Name: Conjugatif Mating Assays pour lanalyse des protéines de transfert impliqués dans Conjugaison bactérienne spécifique à la séquence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Apprenez les essais d'accouplement conjugal pour analyser les protéines de transfert impliquées dans la conjugaison bactérienne spécifique à la séquence. Cette méthode utilise le knock-out génique et la recombinaison homologue pour étudier les interactions protéiques.

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Cette recherche a été soutenue par une subvention à la découverte des sciences et en génie du Conseil naturel du Canada (CRSNG).

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

processus de conjugaison bactérienne fournit un moyen par lequel les bactéries peuvent se propager des gènes offrant un avantage évolutif pour la croissance dans des environnements difficiles, tels que la propagation de marqueurs de résistance aux antibiotiques. Étant donné que la plupart des plasmides de conjugaison sont si grandes, 12 des études fonctionnelles sur les protéines impliquées dans l&#39; assemblage du dispositif de transfert par mutation des gènes cibles sur le plasmide conjugatif se sont diffi...

Le transfert de gènes et de protéines au niveau des micro-organismal joue un rôle central dans la survie des bactéries et de l&#39;évolution ainsi que les processus d&#39;infection. L&#39;échange d&#39;ADN entre les bactéries ou entre une bactérie et une cellule peut être obtenue par transformation, conjugaison ou transduction du vecteur. 1,2 Conjugaison est unique en comparaison à la transformation et la transduction en ce que pendant la conjugaison entre les bactéries Gram-négatives telles que Escherichia coli, le transfert d&#39;ADN a lieu de façon contrôlée du donneur dans lequel un système complexe macromoléculaire relie les cellules du donneur et du receveur. Conjugaison est aussi le moyen le plus direct dans lequel les cellules bactériennes interagissent avec les cellules hôtes pour injecter des gènes, des protéines ou des produits chimiques pour les systèmes hôtes. 3 Très souvent, le transfert de ces agents a des effets remarquables sur l&#39;hôte, allant de la pathogenèse et la carcinogenèse d&#39;accueillir l&#39; évolution et l&#39; adaptation. Il a été démontré que recombinatio conjugatifn augmente le taux d&#39;adaptation de 3 fois dans les bactéries avec des taux de mutation élevés dans des conditions de stress environnemental. 4 En outre, la conjugaison est de loin la voie la plus commune à travers laquelle les gènes de résistance aux antibiotiques dans les souches bactériennes sont réparties. 5,6 Les micro-organismes ont développé des systèmes de sécrétion spécialisés pour soutenir le transfert de macromolécules à travers les membranes cellulaires; il y a actuellement 9 types de systèmes de sécrétion (TSSS) dans les bactéries Gram négatives qui ont été décrites: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, ainsi que le Sec (sécrétion) et Tat (deux-arginine translocation) voies. 7,8 Chaque type de système de sécrétion est divisé en différents sous - types, une nécessité en raison de la diversité des protéines et la spécificité des voies impliquées dans différentes souches bactériennes. Par exemple, dans le système de sécrétion de type IV (T4SS), les systèmes Ti et Cag facilitent le transport effecteur tandis que le F-plasmide, un R27nd pKM101 T4SSs faciliter le transfert d&#39;un plasmide conjugatif. 7,9,10 Une compréhension détaillée des mécanismes par lesquels les organismes assemblent leurs systèmes de sécrétion respectifs de leurs protéines et composants partagent contenu cellulaire avec un destinataire ou leur environnement est un facteur important dans le développement de stratégies ciblées pour lutter contre les micro - organismes et les processus de pathogènes infection cellulaire. Suite à la conjugaison bactérienne initiale d&#39;identification dans E. coli par Lederberg et Tatum, 11 un grand nombre de plasmides conjugatifs et mobiles ont été identifiés et caractérisés. 12 Ces plasmides mobiles montrent gamme considérable est la taille (de 1 à plus de 200 kilobases (kb)), mais tous les plasmides mobiles contiennent un relaxase, qui reconnaît l&#39;origine du transfert (ORIT) permettant ainsi la transmission du plasmide. les plasmides conjugatifs autres gènes codent pour l&#39;assemblage d&#39;un T4SS fonctionnel ainsi que d&#39;un typeIV protéine de couplage. 12 Par exemple , le F 100 kb du plasmide de E. coli code pour l&#39; ensemble des gènes conjugatifs dans une région 33,3 kB de transfert (tra). 13 Les gènes de la région tra du plasmide F encode les protéines qui facilitent la formation de pili, l&#39; accouplement formation de paires (MPF), le transfert de l&#39; ADN et des fonctions d&#39;exclusion pendant le transfert du plasmide conjugatif. 10,14,15 Un important corpus de connaissances est disponible pour conjugatif T4SSs, cependant détaillé des études structurales des protéines et des complexes de conjugaison ne sont plus récemment devenues disponibles. 16-28 Pour assembler une vue d&#39;ensemble du processus de conjugaison, un couplage des études structurales détaillées mutationnelle analyses de protéines de transfert de conjugaison est nécessaire. Ceci peut être réalisé grâce à des essais d&#39;accouplement de conjugaison. Pour le plasmide F, chaque protéine codée dans la région de tra joue un rôle dans la co F médiationnjugation; par conséquent, le knock - out / suppression d&#39;un gène de transfert abolira la capacité de conjugaison de la cellule (Figure 1). Tandis que les petits plasmides mobiles sont plus propices à la procédure d&#39;effacement standard, pour les plasmides de conjugaison plus grandes telles que F, knock-out de gène sont plus facilement atteints par l&#39;intermédiaire d&#39;une recombinaison homologue dans laquelle le gène cible est remplacée par une transporter un gène de résistance aux antibiotiques distincts. Dans le protocole actuel, nous employons la recombinaison homologue pour remplacer un gène de transfert d&#39;intérêt avec le chloramphénicol acétyltransférase (CAT) dans le 55 kb F plasmide dérivé pOX38-Tc; 29,30 plasmide résultant knock-out, pOX38-Tc :: cm Δgene facilite la résistance à la présence de chloramphénicol (Cm) dans les milieux de croissance. Les cellules donneuses qui hébergent pOX38-Tc :: cm sont Δgene incapable d&#39;affecter le transfert d&#39;ADN par conjugaison / accouplement comme observé par l&#39;utilisation d&#39;un essai d&#39;accouplement; l&#39;efficacité de l&#39;accouplement d&#39;une cellule donneuse pOX38-Tc :: Δgene cm et une normale recipient diminuera ou, plus souvent, être aboli. transfert conjugatif du pOX38-Tc Δgene :: Cm plasmidique peut être restauré par un petit plasmide de récupération hébergeant le gène de transfert ciblé. Ce plasmide de récupération peut être celle qui fournit une expression constitutive, tels que le plasmide pK184 (pK184 gène), 31 ou qui fournit une expression inductible tant que ce plasmide cible correctement le gène à l&#39;emplacement approprié dans la cellule (cytoplasme ou le périplasme). Par conséquent, dans des essais d&#39;accouplement entre ce nouveau donneur (hébergeant pOX38-Tc Δgene plasmides :: Cm + pK184 gène) et une cellule receveuse, l&#39;efficacité de l&#39;accouplement est prévu pour rendre à peu près celle d&#39;un test d&#39;appariement donneur-receveur normal. Ce système une permet de sonder la fonction du gène éliminé par la génération d&#39;une série de constructions pK184 gène (délétions ou mutations ponctuelles) et en testant la capacité de chaque construction pour rétablir la capacité d&#39;accouplement de la pOX38-Tc Δgene :: cm recel cellule donneuses.

<table><tbody><tr><td>GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel GeneJet</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0692</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purification PCR GeneJet</td><td></td><td>Fisher Scientific K0702</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Kit de mutagénèse dirigée New</td><td>England Biolabs</td><td>E0554S</td><td></td></tr><tr><td>Échelle d’ADN à large gamme</td><td>New England Biolabs</td><td>N0303A</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Électroporateur</td><td>Eppendorf</td><td>4309000027</td><td></td></tr><tr><td>Les cuvettes d’électroporation</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB101</td><td>ont un espace de 1 mm.</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotiques</td><td></td><td></td><td>Concentrations finales</td></tr><tr><td>Chloramphénicol (cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>20 &micro ; g/mL</td></tr><tr><td>de Kanamycine (Km)</td><td>BioBasic Inc.</td><td>DB0286</td><td>50 et micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Acide nalidixique (Nal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8878-25G</td><td>10 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>de rifampicine (Rif)</td><td>Calbiochem</td><td>557303</td><td>20 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>de tétracycline (Tc)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td>10 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>de streptomycine (Sm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP910-50</td><td>50 & micro ; g/mL</td></tr></tbody></table>

conjugatif mating assays pour l&#39;analyse des protéines de transfert impliqués dans conjugaison bactérienne spécifique à la séquence

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Le transfert de matériel génétique par conjugaison bactérienne est un processus qui se déroule via des complexes formés par des protéines de transfert spécifiques. Chez Escherichia coli, ces protéines de transfert constituent une machinerie de transfert d’ADN connue sous le nom de formation de paires d’accouplement, ou complexe de transfert d’ADN, qui facilite le transfert conjugatif de plasmides. L’objectif de cet article est de fournir une méthode qui peut être utilisée pour déterminer le rôle d’une protéine de transfert spécifique impliquée dans la conjugaison à l’aide d’une série de délétions et/ou de mutations ponctuelles en combinaison avec des tests d’accouplement. Le gène cible est inactivé sur le plasmide conjugatif et est ensuite fourni en trans par l’utilisation d’un petit plasmide de récupération hébergeant le gène cible. Les mutations affectant le gène cible sur le plasmide de récupération peuvent révéler des informations sur les aspects fonctionnels de la protéine cible qui entraînent l’altération de l’efficacité de l’accouplement des cellules donneuses hébergeant le gène muté. Les modifications de l’efficacité de l’accouplement donnent un aperçu du rôle et de l’importance de la protéine de transfert particulière, ou d’une région de celle-ci, dans la facilitation du transfert conjugatif de l’ADN. Le couplage de cet essai d’accouplement avec des études structurales tridimensionnelles détaillées permettra de comprendre complètement la fonction de la protéine de transfert conjugative et de fournir un moyen d’identifier et de caractériser les régions d’interaction protéine-protéine.

Le procédé de conjugaison bactérienne F induite par le plasmide est un processus coordonné qui implique des protéines de transfert dans la région de tra du F-plasmide qui assemble un T4SS pour faciliter la synthèse du pili et le transfert d'ADN par conjugaison. La protéine TRAF (GenBank # BAA97961; UniProt ID P14497) est nécessaire pour la formation conjugatif F-pili. 10,14,35 - 37 La protéine contient un domaine semblable à la thiorédoxine C-ter...

Ici, nous présentons un protocole pour inactiver un gène d’intérêt impliqué dans la conjugaison plasmidique et analysons ensuite l’impact de son absence à l’aide de tests d’accouplement. La fonction du gène est explorée plus en détail dans une région spécifique de sa séquence à l’aide de délétions ou de mutations ponctuelles.

Conjugatif Mating Assays pour l&#39;analyse des protéines de transfert impliqués dans Conjugaison bactérienne spécifique à la séquence

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

L’objectif global de cet essai d’accouplement est d’évaluer les effets des mutations au sein du gène de transfert conjugatif sur sa capacité à affecter le transfert plasmidique dans le contexte d’un complexe de sécrétion fonctionnel de type quatre. Cette méthode permet de poser des questions spécifiques aux protéines, telles que l’identification des régions d’interactions protéine-protéine qui se produisent entre les protéines de transfert lorsqu’elles assemblent un système de sécrétion fonctionnel de type quatre en conjugaison bactérienne. Dans cette technique, les gènes sur de grands plasmides conjugatifs sont éliminés par recombinaison homologue.La fonction du gène est évaluée en fournissant le gène cible aux knock-outs sur un plasmide plus petit. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal, car l’organisation et la configuration sont essentielles pour mener à bien cette procédure. Une bonne préparation expérimentale est nécessaire pour obtenir des résultats interprétables.Commencez ce protocole par la préparation du plasmide pBAD33 digéré comme décrit dans le protocole texte. Exécutez chaque condensat sur un gel d’agarose. À l’aide d’une armoire

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Génétique

Une méthode rapide et efficace d'intégrer l'ADN étranger dans des souches d'intérêt accepteurs pré-faites, dites souches piste d'atterrissage, est décrite. Procédé permettant d'intégration spécifique de site d'une cassette d'ADN dans le locus piste d'ingénierie d'une souche donnée, par conjugaison et l'expression de l'intégrase ΦC31.

Site spécifique génie chromosome bactérien: ΦC31 intégrase médiation Cassette Exchange (IMCE)

Source : Erdogan, F., et al., Tests d’accouplement conjugatif pour l’analyse spécifique à la séquence des protéines de transfert impliquées dans la conjugaison bactérienne. J. Vis. Exp. (2017)Cette vidéo montre la procédure de transfert d’un plasmide F de cellules E. coli donneuses à receveuses à l’aide d’un plasmide de secours et de sélection de transconjugants par double résistance aux antibiotiques. Le processus comprend le mélange de cultures bactériennes, l’incubation sans secousse, la...

F Transfert de plasmide et double sélection d’antibiotiques chez E. coli

Nous décrivons ici trois protocoles différents pour l'enquête in vitro de la conjugaison, la transduction et la transformation naturelle de Staphylococcus aureus.

Méthodologie de l&#39;étude du transfert horizontal de gènes dans<em&gt; Staphylococcus aureus</em

Dans le but de comprendre les comportements des divers éléments d’ADN conjugaison bactériennes dans des conditions différentes, les auteurs décrivent un protocole pour détecter les différences de fréquence de conjugaison, avec une haute résolution, pour estimer l’efficacité avec laquelle la bactérie donneur initie la conjugaison.

Haute résolution comparaison des fréquences de la conjugaison bactérienne

Ici, nous présentons un protocole décrivant comment i) assembler un vecteur auto-réplicant à l'aide de la boîte à outils modulaire de clonage CyanoGate, ii) introduire le vecteur dans un hôte cyanobactérieparpare par conjugaison, et iii) caractériser les souches transgéniques cyanobactéries en utilisant un lecteur de plaque ou cytométrie de flux.

Modification génétique des cyanobactéries par conjugaison à l'aide de la boîte à outils de clonage modulaire CyanoGate

Nous décrivons une méthode pour générer des bibliothèques mutantes transposons saturantes chez les bactéries gramnégatives et la préparation subséquente des bibliothèques d’amiplicons d’ADN pour le séquençage à haut débit. À titre d’exemple, nous nous concentrons sur l’agent pathogène ESKAPE, Acinetobacter baumannii, mais ce protocole est accessible à un large éventail d’organismes gramnégatifs.

Génération de bibliothèques d’insertion transposon dans les bactéries gramnégatives pour le séquençage à haut débit

Ici, nous décrivons la construction de mutants nuls d’Aeromonas dans des glycosyltransférases spécifiques ou des régions contenant des glycosyltransférases, les tests de motilité et la purification des flagelles effectués pour établir l’implication et la fonction de leurs enzymes codées dans la biosynthèse d’un glycane, ainsi que le rôle de ce glycane dans la pathogenèse bactérienne.

Génération de mutants nuls pour élucider le rôle des glycosyltransférases bactériennes dans la motilité bactérienne

La conjugaison intervient dans le transfert horizontal de gènes en mobilisant l’ADN plasmidique à travers deux cellules différentes, facilitant ainsi la propagation de gènes bénéfiques. Ce travail décrit une méthode largement utilisée pour la détection efficace du transfert plasmidique conjugatif, basée sur l’utilisation de marqueurs différentiels dans le plasmide conjugatif, le donneur et le receveur pour détecter la transconjugaison.

Détection du transfert horizontal de gènes médié par des plasmides conjugatifs naturels chez E. coli

Dans ce manuscrit, nous décrivons un protocole permettant d’examiner fonctionnellement la transcription et l’activité inhibitrice des agents antibactériens ciblant la transcription bactérienne.

Dans les dosages transcription in vitro et leur application dans la découverte de médicaments

Ici, nous présentons un protocole qui facilite la caractérisation fonctionnelle à moyen à haut débit des constructions de gènes et de promoteurs dans le tissu secondaire de la tige de l’arbre dans des délais relativement courts. Il est efficace, facile à utiliser et largement applicable à une gamme d’espèces d’arbres.

L&#39;utilisation de la Induced somatique analyse sectorielle (AISS) pour l&#39;étude des gènes et de promoteurs impliqués dans la formation du bois et le développement de souches secondaire

Apprenez les essais d'accouplement conjugal pour analyser les protéines de transfert impliquées dans la conjugaison bactérienne spécifique à la séquence. Cette méthode utilise le knock-out génique et la recombinaison homologue pour étudier les interactions protéiques.

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