Conjugatif Mating Assays pour l'analyse des protéines de transfert impliqués dans Conjugaison bactérienne spécifique à la séquence

L’objectif global de cet essai d’accouplement est d’évaluer les effets des mutations au sein du gène de transfert conjugatif sur sa capacité à affecter le transfert plasmidique dans le contexte d’un complexe de sécrétion fonctionnel de type quatre. Cette méthode permet de poser des questions spécifiques aux protéines, telles que l’identification des régions d’interactions protéine-protéine qui se produisent entre les protéines de transfert lorsqu’elles assemblent un système de sécrétion fonctionnel de type quatre en conjugaison bactérienne. Dans cette technique, les gènes sur de grands plasmides conjugatifs sont éliminés par recombinaison homologue.

La fonction du gène est évaluée en fournissant le gène cible aux knock-outs sur un plasmide plus petit. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal, car l’organisation et la configuration sont essentielles pour mener à bien cette procédure. Une bonne préparation expérimentale est nécessaire pour obtenir des résultats interprétables.

Commencez ce protocole par la préparation du plasmide pBAD33 digéré comme décrit dans le protocole texte. Exécutez chaque condensat sur un gel d’agarose. À l’aide d’une armoire UV et d’un rasoir stérile, coupez le gel la bande de base de 2,8 kilos qui répond à la séquence de cathétérisme.

Travaillez rapidement pour minimiser l’exposition aux UV de l’ADN. Extrayez l’ADN de la tranche de gel découpée à l’aide d’un kit d’extraction de gel selon le protocole du fabricant. Pour amplifier la cassette de chat extraite par réaction en chaîne par polymérase ou PCR.

Préparez le mélange réactionnel dans un tube PCR stérile. Utilisez des amorces qui contiennent des surplombs homologues à la séquence du gène cible pour la recombinaison homologue. Mettre en place un contrôle négatif qui porte les mêmes composants, sauf qu’il faut remplacer l’ADN matrice par de l’eau distillée deux fois.

De plus, mettez en place un contrôle positif à l’aide d’ADN matrice et d’amorces dont l’efficacité a été prouvée lors d’une réaction PCR. Mélangez doucement tout le contenu de la réaction par pipetage. Ensuite, amplifiez la cassette de chat extraite à l’aide des paramètres PCR répertoriés dans le protocole texte.

Utilisez seulement cinq microlitres de chaque réaction pour confirmer la taille correcte de l’amplification par électrophorèse sur gel d’agarose. Purifiez l’amplicon PCR à l’aide d’un kit de purification PCR avec le protocole du fabricant. Ajoutez 300 nanogrammes de la cassette de chat amplifiée dans 50 microlitres de cellules DY330R électrocompétentes, hébergeant le plasmide pOX38-Tc sur de la glace.

Pipetez doucement de haut en bas pour mélanger. Répétez cette étape en utilisant le plasmide pBAD33 non modifié comme témoin positif. Ensuite, transférez les cellules dans une cuvette d’électroporation d’un millimètre pré-refroidie.

Électroporez les cellules à 1,8 kilovolts avec une constante de temps de 5,5 millisecondes à l’aide d’un électroporateur. Immédiatement, après l’application de l’impulsion, diluez les cellules avec un millilitre de média SOC et transférez-les dans un tube microfuge frais. Incuber les cellules à 32 degrés Celsius pendant deux heures.

Ensuite, aliquote 100 microlitres de chaque échantillon sur des plaques de gélose contenant 10 microgrammes par millilitre de tétracycline et 20 microgrammes par millilitre de chloramphénicol. Étalez l’aliquote sur la plaque à l’aide d’un épandeur stérile. Incuber l’assiette à l’envers à 32 degrés Celsius pendant la nuit.

Le lendemain, sélectionnez les recombinants réussis. La cassette de chat introduite dans la cellule subira une recombinaison homologue avec le gène d’intérêt et créera le clone knock-out du chloramphénicol pOX38-Tc. Séparez l’électroporat de 300 nanogrammes du plasmide du gène pK184 ou du plasmide mutant du gène pK184 en 50 microlitres de cellules électrocompotentes DY330R hébergeant le plasmide knock-out du chloramphénicol pOX38-Tc comme auparavant.

Pour générer les cellules donneuses XK1200, effectuez un accouplement conjugatif suivi d’une électroporation pour générer des cellules XK1200 en harcelant à la fois l’inactivation du chloramphénicol et le plasmide PK184 comme décrit dans le protocole texte. Préparation de la culture nocturne de ces cellules donneuses XK1200 dans 20 millilitres de LB stérile avec du chloramphénicol et de la kanamycine. Préparez également des cellules receveuses de MC4100 dans 50 millilitres de LB avec 50 microgrammes par millilitre de streptomycine en utilisant des cellules d’un stock de glycérol ou d’une seule colonie sur une plaque d’ang agar.

Cultivez les cultures à 37 degrés Celsius, en secouant à 200 tr/min. Ajouter du glucose à une concentration finale de 100 millimolaires dans toutes les cellules du donneur. Le lendemain, faites 1 dilution sur 70 de chaque culture de nuit séparément dans deux millilitres de LB stérile avec les mêmes antibiotiques.

Cultivez les cellules jusqu’à la phase mi-logarithmique à 37 degrés Celsius avec agitation à 200 tr/min. Centrifugez la culture cellulaire pour granuler les cellules et jeter le surnageant. Ensuite, lavez une fois la pastille cellulaire avec du LB stérile à froid pour éliminer les antibiotiques.

Après centrifugation une seconde fois comme précédemment, nous suspendons les cellules dans deux millilitres de stérile froid LB.In double, aliquote 100 microlitres de cellules donneuses et 100 microlitres de cellules receveuses à 800 microlitres de milieu stérile LB pour un volume total d’un millilitre. Laissez les cellules s’accoupler à 37 degrés Celsius pendant une heure sans secouer. Au bout d’une heure, faites un vortex sur les cellules pendant 30 secondes pour perturber les couples d’accouplement.

Ensuite, placez les cellules sur de la glace pendant 10 minutes pour éviter tout nouvel accouplement. À l’aide des cultures logarithmiques moyennes et des LB stériles frais, préparez six dilutions en série des cellules donneuses et receveuses de 1 et 100 à 1 et 10 millions. Sur chacune des deux moitiés d’une plaque de gélose contenant de l’acide naladixique, du chloramphénicol et de la kanamycine, repérez 10 microlitres d’aliquotes de chaque dilution de cellules donneuses XK1200.

Répétition du spotting pour les dilutions des cellules MC4100 receveuses sur des plaques de gélose contenant de la streptomycine. Ensuite, incubez les assiettes pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ensuite, à l’aide du mélange vortex et du LB stérile frais, préparez six dilutions des transconjugants.

Sélectionnez pour le transconjugant MC4100 les cellules qui hébergent le chloramphénicol pOX38-Tc knock-out bu en repérant dix aliquotes de microlitres de chaque dilution sur chaque moitié des plaques de gélose contenant de la streptomycine et du chloramphénicol. Répétez l’opération pour les deux mélanges en double. Ensuite, incubez les assiettes pendant la nuit à 37 degrés Celsius.

Calculez l’efficacité de l’accouplement en comptant le nombre de colonies à partir de la même dilution pour chaque cellule donneuse, receveuse et transconjugante sur leurs plaques respectives. De plus, comptez les colonies réceptrices pour tester tout biais résultant d’un plus grand nombre de transconjugants que de receveurs à cette dilution donnée. Calculez l’efficacité de l’accouplement en divisant le nombre de colonies transconjuguées par le nombre de colonies donneuses, multiplié par 100 pour obtenir la valeur de l’efficacité pour 100 cellules donneuses.

Lorsque le gène du système de sécrétion de type quatre-tra-F est éliminé du plasmide pOX38-Tc, il en résulte une perte de transfert conjugatif du plasmide de chloramphénicol pOX38-Tc traF du donneur aux cellules réceptrices. Cependant, lorsque le gène traF est fourni en trans par le plasmide PK184 traF et les cellules donneuses, une récupération du transfert conjugatif du plasmide knock-out chloramphénicol pOX38-Tc traF est observée. Lorsqu’il est fourni avec des mutants de dilution de traF et du plasmide PK184 dans les cellules donneuses, une perte de transfert conjugatif du plasmide knock-out chloramphénicol pOX38-Tc traF peut être observée.

La perte de transfert conjugatif indique la région de la protéine importante pour les interactions protéine-protéine dans le système de sécrétion conjugatif de type quatre. Cette région peut ensuite être sondée plus en détail par des mutations ponctuelles qui affectent l’efficacité du transfert. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une seule journée de travail avec des temps de croissance prévus.

Ce protocole peut être réalisé sur des cellules autres que celles démontrées ici. L’aspect critique, à ce stade, est que les cellules donneuses et receveuses n’hébergent pas le plasmide d’intérêt. Ainsi, lorsque vous ajoutez le plasmide knock-out, vous n’obtenez pas de résultats contradictoires.

Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’être très organisé car il existe différentes conditions de croissance et antibiotiques pour les cellules donneuses, receveuses et transconjuguées. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la cristallographie, la RMN ou la spectrométrie de masse peuvent être réalisées afin d’obtenir une image structurale et fonctionnelle détaillée de la protéine d’intérêt.