Name: Conjugatif Mating Assays pour lanalyse des protéines de transfert impliqués dans Conjugaison bactérienne spécifique à la séquence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-01-04T12:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 41 s
Description: Apprenez les essais d'accouplement conjugal pour analyser les protéines de transfert impliquées dans la conjugaison bactérienne spécifique à la séquence. Cette méthode utilise le knock-out génique et la recombinaison homologue pour étudier les interactions protéiques.

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Cette recherche a été soutenue par une subvention à la découverte des sciences et en génie du Conseil naturel du Canada (CRSNG).

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Les auteurs déclarent qu&#39;ils ont aucun intérêt financier concurrents.

processus de conjugaison bactérienne fournit un moyen par lequel les bactéries peuvent se propager des gènes offrant un avantage évolutif pour la croissance dans des environnements difficiles, tels que la propagation de marqueurs de résistance aux antibiotiques. Étant donné que la plupart des plasmides de conjugaison sont si grandes, 12 des études fonctionnelles sur les protéines impliquées dans l&#39; assemblage du dispositif de transfert par mutation des gènes cibles sur le plasmide conjugatif se sont diffi...

Le transfert de gènes et de protéines au niveau des micro-organismal joue un rôle central dans la survie des bactéries et de l&#39;évolution ainsi que les processus d&#39;infection. L&#39;échange d&#39;ADN entre les bactéries ou entre une bactérie et une cellule peut être obtenue par transformation, conjugaison ou transduction du vecteur. 1,2 Conjugaison est unique en comparaison à la transformation et la transduction en ce que pendant la conjugaison entre les bactéries Gram-négatives telles que Escherichia coli, le transfert d&#39;ADN a lieu de façon contrôlée du donneur dans lequel un système complexe macromoléculaire relie les cellules du donneur et du receveur. Conjugaison est aussi le moyen le plus direct dans lequel les cellules bactériennes interagissent avec les cellules hôtes pour injecter des gènes, des protéines ou des produits chimiques pour les systèmes hôtes. 3 Très souvent, le transfert de ces agents a des effets remarquables sur l&#39;hôte, allant de la pathogenèse et la carcinogenèse d&#39;accueillir l&#39; évolution et l&#39; adaptation. Il a été démontré que recombinatio conjugatifn augmente le taux d&#39;adaptation de 3 fois dans les bactéries avec des taux de mutation élevés dans des conditions de stress environnemental. 4 En outre, la conjugaison est de loin la voie la plus commune à travers laquelle les gènes de résistance aux antibiotiques dans les souches bactériennes sont réparties. 5,6 Les micro-organismes ont développé des systèmes de sécrétion spécialisés pour soutenir le transfert de macromolécules à travers les membranes cellulaires; il y a actuellement 9 types de systèmes de sécrétion (TSSS) dans les bactéries Gram négatives qui ont été décrites: T1SS, T2SS, T3SS, T4SS, T5SS, T6SS, T7SS, ainsi que le Sec (sécrétion) et Tat (deux-arginine translocation) voies. 7,8 Chaque type de système de sécrétion est divisé en différents sous - types, une nécessité en raison de la diversité des protéines et la spécificité des voies impliquées dans différentes souches bactériennes. Par exemple, dans le système de sécrétion de type IV (T4SS), les systèmes Ti et Cag facilitent le transport effecteur tandis que le F-plasmide, un R27nd pKM101 T4SSs faciliter le transfert d&#39;un plasmide conjugatif. 7,9,10 Une compréhension détaillée des mécanismes par lesquels les organismes assemblent leurs systèmes de sécrétion respectifs de leurs protéines et composants partagent contenu cellulaire avec un destinataire ou leur environnement est un facteur important dans le développement de stratégies ciblées pour lutter contre les micro - organismes et les processus de pathogènes infection cellulaire. Suite à la conjugaison bactérienne initiale d&#39;identification dans E. coli par Lederberg et Tatum, 11 un grand nombre de plasmides conjugatifs et mobiles ont été identifiés et caractérisés. 12 Ces plasmides mobiles montrent gamme considérable est la taille (de 1 à plus de 200 kilobases (kb)), mais tous les plasmides mobiles contiennent un relaxase, qui reconnaît l&#39;origine du transfert (ORIT) permettant ainsi la transmission du plasmide. les plasmides conjugatifs autres gènes codent pour l&#39;assemblage d&#39;un T4SS fonctionnel ainsi que d&#39;un typeIV protéine de couplage. 12 Par exemple , le F 100 kb du plasmide de E. coli code pour l&#39; ensemble des gènes conjugatifs dans une région 33,3 kB de transfert (tra). 13 Les gènes de la région tra du plasmide F encode les protéines qui facilitent la formation de pili, l&#39; accouplement formation de paires (MPF), le transfert de l&#39; ADN et des fonctions d&#39;exclusion pendant le transfert du plasmide conjugatif. 10,14,15 Un important corpus de connaissances est disponible pour conjugatif T4SSs, cependant détaillé des études structurales des protéines et des complexes de conjugaison ne sont plus récemment devenues disponibles. 16-28 Pour assembler une vue d&#39;ensemble du processus de conjugaison, un couplage des études structurales détaillées mutationnelle analyses de protéines de transfert de conjugaison est nécessaire. Ceci peut être réalisé grâce à des essais d&#39;accouplement de conjugaison. Pour le plasmide F, chaque protéine codée dans la région de tra joue un rôle dans la co F médiationnjugation; par conséquent, le knock - out / suppression d&#39;un gène de transfert abolira la capacité de conjugaison de la cellule (Figure 1). Tandis que les petits plasmides mobiles sont plus propices à la procédure d&#39;effacement standard, pour les plasmides de conjugaison plus grandes telles que F, knock-out de gène sont plus facilement atteints par l&#39;intermédiaire d&#39;une recombinaison homologue dans laquelle le gène cible est remplacée par une transporter un gène de résistance aux antibiotiques distincts. Dans le protocole actuel, nous employons la recombinaison homologue pour remplacer un gène de transfert d&#39;intérêt avec le chloramphénicol acétyltransférase (CAT) dans le 55 kb F plasmide dérivé pOX38-Tc; 29,30 plasmide résultant knock-out, pOX38-Tc :: cm Δgene facilite la résistance à la présence de chloramphénicol (Cm) dans les milieux de croissance. Les cellules donneuses qui hébergent pOX38-Tc :: cm sont Δgene incapable d&#39;affecter le transfert d&#39;ADN par conjugaison / accouplement comme observé par l&#39;utilisation d&#39;un essai d&#39;accouplement; l&#39;efficacité de l&#39;accouplement d&#39;une cellule donneuse pOX38-Tc :: Δgene cm et une normale recipient diminuera ou, plus souvent, être aboli. transfert conjugatif du pOX38-Tc Δgene :: Cm plasmidique peut être restauré par un petit plasmide de récupération hébergeant le gène de transfert ciblé. Ce plasmide de récupération peut être celle qui fournit une expression constitutive, tels que le plasmide pK184 (pK184 gène), 31 ou qui fournit une expression inductible tant que ce plasmide cible correctement le gène à l&#39;emplacement approprié dans la cellule (cytoplasme ou le périplasme). Par conséquent, dans des essais d&#39;accouplement entre ce nouveau donneur (hébergeant pOX38-Tc Δgene plasmides :: Cm + pK184 gène) et une cellule receveuse, l&#39;efficacité de l&#39;accouplement est prévu pour rendre à peu près celle d&#39;un test d&#39;appariement donneur-receveur normal. Ce système une permet de sonder la fonction du gène éliminé par la génération d&#39;une série de constructions pK184 gène (délétions ou mutations ponctuelles) et en testant la capacité de chaque construction pour rétablir la capacité d&#39;accouplement de la pOX38-Tc Δgene :: cm recel cellule donneuses.

<table><tbody><tr><td>GeneJet Plasmid Mini-Prep Kit</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0503</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel GeneJet</td><td>Fisher Scientific</td><td>K0692</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purification PCR GeneJet</td><td></td><td>Fisher Scientific K0702</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Kit de mutagénèse dirigée New</td><td>England Biolabs</td><td>E0554S</td><td></td></tr><tr><td>Échelle d’ADN à large gamme</td><td>New England Biolabs</td><td>N0303A</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes de Pétri</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Électroporateur</td><td>Eppendorf</td><td>4309000027</td><td></td></tr><tr><td>Les cuvettes d’électroporation</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB101</td><td>ont un espace de 1 mm.</td></tr><tr><td>Enzymes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>AvaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0152S</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0101S</td><td></td></tr><tr><td>HindIII</td><td>New England Biolabs</td><td>R0104L</td><td></td></tr><tr><td>NdeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0111S</td><td></td></tr><tr><td>Phusion DNA Polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>T4 DNA Ligase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0202S</td><td></td></tr><tr><td>DpnI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td></td></tr><tr><td>Antibiotiques</td><td></td><td></td><td>Concentrations finales</td></tr><tr><td>Chloramphénicol (cm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP904-100</td><td>20 &micro ; g/mL</td></tr><tr><td>de Kanamycine (Km)</td><td>BioBasic Inc.</td><td>DB0286</td><td>50 et micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Acide nalidixique (Nal)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N8878-25G</td><td>10 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>de rifampicine (Rif)</td><td>Calbiochem</td><td>557303</td><td>20 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>de tétracycline (Tc)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP912-100</td><td>10 & micro ; g/mL</td></tr><tr><td>de streptomycine (Sm)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP910-50</td><td>50 & micro ; g/mL</td></tr></tbody></table>

conjugatif mating assays pour l&#39;analyse des protéines de transfert impliqués dans conjugaison bactérienne spécifique à la séquence

Conjugative Mating Assays for Sequence-specific Analysis of Transfer Proteins Involved in Bacterial Conjugation

Le transfert de matériel génétique par conjugaison bactérienne est un processus qui se déroule via des complexes formés par des protéines de transfert spécifiques. Chez Escherichia coli, ces protéines de transfert constituent une machinerie de transfert d’ADN connue sous le nom de formation de paires d’accouplement, ou complexe de transfert d’ADN, qui facilite le transfert conjugatif de plasmides. L’objectif de cet article est de fournir une méthode qui peut être utilisée pour déterminer le rôle d’une protéine de transfert spécifique impliquée dans la conjugaison à l’aide d’une série de délétions et/ou de mutations ponctuelles en combinaison avec des tests d’accouplement. Le gène cible est inactivé sur le plasmide conjugatif et est ensuite fourni en trans par l’utilisation d’un petit plasmide de récupération hébergeant le gène cible. Les mutations affectant le gène cible sur le plasmide de récupération peuvent révéler des informations sur les aspects fonctionnels de la protéine cible qui entraînent l’altération de l’efficacité de l’accouplement des cellules donneuses hébergeant le gène muté. Les modifications de l’efficacité de l’accouplement donnent un aperçu du rôle et de l’importance de la protéine de transfert particulière, ou d’une région de celle-ci, dans la facilitation du transfert conjugatif de l’ADN. Le couplage de cet essai d’accouplement avec des études structurales tridimensionnelles détaillées permettra de comprendre complètement la fonction de la protéine de transfert conjugative et de fournir un moyen d’identifier et de caractériser les régions d’interaction protéine-protéine.

Le procédé de conjugaison bactérienne F induite par le plasmide est un processus coordonné qui implique des protéines de transfert dans la région de tra du F-plasmide qui assemble un T4SS pour faciliter la synthèse du pili et le transfert d'ADN par conjugaison. La protéine TRAF (GenBank # BAA97961; UniProt ID P14497) est nécessaire pour la formation conjugatif F-pili. 10,14,35 - 37 La protéine contient un domaine semblable à la thiorédoxine C-ter...

Ici, nous présentons un protocole pour inactiver un gène d’intérêt impliqué dans la conjugaison plasmidique et analysons ensuite l’impact de son absence à l’aide de tests d’accouplement. La fonction du gène est explorée plus en détail dans une région spécifique de sa séquence à l’aide de délétions ou de mutations ponctuelles.

Conjugatif Mating Assays pour l&#39;analyse des protéines de transfert impliqués dans Conjugaison bactérienne spécifique à la séquence

The transfer of genetic material by bacterial conjugation is a process that takes place via complexes formed by specific transfer proteins. In Escherichia ...

L’objectif global de cet essai d’accouplement est d’évaluer les effets des mutations au sein du gène de transfert conjugatif sur sa capacité à affecter le transfert plasmidique dans le contexte d’un complexe de sécrétion fonctionnel de type quatre. Cette méthode permet de poser des questions spécifiques aux protéines, telles que l’identification des régions d’interactions protéine-protéine qui se produisent entre les protéines de transfert lorsqu’elles assemblent un système de sécrétion fonctionnel de type quatre en conjugaison bactérienne. Dans cette technique, les gènes sur de grands plasmides conjugatifs sont éliminés par recombinaison homologue.La fonction du gène est évaluée en fournissant le gène cible aux knock-outs sur un plasmide plus petit. En général, les personnes qui ne connaissent pas cette méthode auront du mal, car l’organisation et la configuration sont essentielles pour mener à bien cette procédure. Une bonne préparation expérimentale est nécessaire pour obtenir des résultats interprétables.Commencez ce protocole par la préparation du plasmide pBAD33 digéré comme décrit dans le protocole texte. Exécutez chaque condensat sur un gel d’agarose. À l’aide d’une armoire UV et d’un rasoir stérile, coupez le gel la bande de base de 2,8 kilos qui répond à la séquence de cathétérisme.Travaillez rapidement pour minimiser l’exposition aux UV de l’ADN. Extrayez l’ADN de la tranche de gel découpée à l’aide d’un kit d’extraction de gel selon le protocole du fabricant. Pour amplifier la cassette de chat extraite par réaction en chaîne par polymérase ou PCR.Préparez le mélange réactionnel dans un tube PCR stérile. Utilisez des amorces qui contiennent des surplombs homologues à la séquence du gène cible pour la recombinaison homologue. Mettre en place un contrôle négatif qui porte les mêmes composants, sauf qu’il faut remplacer l’ADN matrice par de l’eau distillée deux fois.De plus, mettez en place un contrôle positif à l’aide d’ADN matrice et d’amorces dont l’efficacité a été prouvée lors d’une réaction PCR. Mélangez doucement tout le contenu de la réaction par pipetage. Ensuite, amplifiez la cassette de chat extraite à l’aide des paramètres PCR répertoriés dans le protocole texte.Utilisez seulement cinq microlitres de chaque réaction pour confirmer la taille correcte de l’amplification par électrophorèse sur gel d’agarose. Purifiez l’amplicon PCR à l’aide d’un kit de purification PCR avec le protocole du fabricant. Ajoutez 300 nanogrammes de la cassette de chat amplifiée dans 50 microlitres de cellules DY330R électrocompétentes, hébergeant le plasmide pOX38-Tc sur de la glace.Pipetez doucement de haut en bas pour mélanger. Répétez cette étape en utilisant le plasmide pBAD33 non modifié comme témoin positif. Ensuite, transférez les cellules dans une cuvette d’électroporation d’un millimètre pré-refroidie.Électroporez les cellules à 1,8 kilovolts avec une constante de temps de 5,5 millisecondes à l’aide d’un électroporateur. Immédiatement, après l’application de l’impulsion, diluez les cellules avec un millilitre de média SOC et transférez-les dans un tube microfuge frais. Incuber les cellules à 32 degrés Celsius pendant deux heures.Ensuite, aliquote 100 microlitres de chaque échantillon sur des plaques de gélose contenant 10 microgrammes par millilitre de tétracycline et 20 microgrammes par millilitre de chloramphénicol. Étalez l’aliquote sur la plaque à l’aide d’un épandeur stérile. Incuber l’assiette à l’envers à 32 degrés Celsius pendant la nuit.Le lendemain, sélectionnez les recombinants réussis. La cassette de chat introduite dans la cellule subira une recombinaison homologue avec le gène d’intérêt et créera le clone knock-out du chloramphénicol pOX38-Tc. Séparez l’électroporat de 300 nanogrammes du plasmide du gène pK184 ou du plasmide mutant du gène pK184 en 50 microlitres de cellules électrocompotentes DY330R hébergeant le plasmide knock-out du chloramphénicol pOX38-Tc comme auparavant.Pour générer les cellules donneuses XK1200, effectuez un accouplement conjugatif suivi d’une électroporation pour générer des cellules XK1200 en harcelant à la fois l’inactivation du chloramphénicol et le plasmide PK184 comme décrit dans le protocole texte. Préparation de la culture nocturne de ces cellules donneuses XK1200 dans 20 millilitres de LB stérile avec du chloramphénicol et de la kanamycine. Préparez également des cellules receveuses de MC4100 dans 50 millilitres de LB avec 50 microgrammes par millilitre de streptomycine en utilisant des cellules d’un stock de glycérol ou d’une seule colonie sur une plaque d’ang agar.Cultivez les cultures à 37 degrés Celsius, en secouant à 200 tr/min. Ajouter du glucose à une concentration finale de 100 millimolaires dans toutes les cellules du donneur. Le lendemain, faites 1 dilution sur 70 de chaque culture de nuit séparément dans deux millilitres de LB stérile avec les mêmes antibiotiques.Cultivez les cellules jusqu’à la phase mi-logarithmique à 37 degrés Celsius avec agitation à 200 tr/min. Centrifugez la culture cellulaire pour granuler les cellules et jeter le surnageant. Ensuite, lavez une fois la pastille cellulaire avec du LB stérile à froid pour éliminer les antibiotiques.Après centrifugation une seconde fois comme précédemment, nous suspendons les cellules dans deux millilitres de stérile froid LB.In double, aliquote 100 microlitres de cellules donneuses et 100 microlitres de cellules receveuses à 800 microlitres de milieu stérile LB pour un volume total d’un millilitre. Laissez les cellules s’accoupler à 37 degrés Celsius pendant une heure sans secouer. Au bout d’une heure, faites un vortex sur les cellules pendant 30 secondes pour perturber les couples d’accouplement.Ensuite, placez les cellules sur de la glace pendant 10 minutes pour éviter tout nouvel accouplement. À l’aide des cultures logarithmiques moyennes et des LB stériles frais, préparez six dilutions en série des cellules donneuses et receveuses de 1 et 100 à 1 et 10 millions. Sur chacune des deux moitiés d’une plaque de gélose contenant de l’acide naladixique, du chloramphénicol et de la kanamycine, repérez 10 microlitres d’aliquotes de chaque dilution de cellules donneuses XK1200.Répétition du spotting pour les dilutions des cellules MC4100 receveuses sur des plaques de gélose contenant de la streptomycine. Ensuite, incubez les assiettes pendant la nuit à 37 degrés Celsius. Ensuite, à l’aide du mélange vortex et du LB stérile frais, préparez six dilutions des transconjugants.Sélectionnez pour le transconjugant MC4100 les cellules qui hébergent le chloramphénicol pOX38-Tc knock-out bu en repérant dix aliquotes de microlitres de chaque dilution sur chaque moitié des plaques de gélose contenant de la streptomycine et du chloramphénicol. Répétez l’opération pour les deux mélanges en double. Ensuite, incubez les assiettes pendant la nuit à 37 degrés Celsius.Calculez l’efficacité de l’accouplement en comptant le nombre de colonies à partir de la même dilution pour chaque cellule donneuse, receveuse et transconjugante sur leurs plaques respectives. De plus, comptez les colonies réceptrices pour tester tout biais résultant d’un plus grand nombre de transconjugants que de receveurs à cette dilution donnée. Calculez l’efficacité de l’accouplement en divisant le nombre de colonies transconjuguées par le nombre de colonies donneuses, multiplié par 100 pour obtenir la valeur de l’efficacité pour 100 cellules donneuses.Lorsque le gène du système de sécrétion de type quatre-tra-F est éliminé du plasmide pOX38-Tc, il en résulte une perte de transfert conjugatif du plasmide de chloramphénicol pOX38-Tc traF du donneur aux cellules réceptrices. Cependant, lorsque le gène traF est fourni en trans par le plasmide PK184 traF et les cellules donneuses, une récupération du transfert conjugatif du plasmide knock-out chloramphénicol pOX38-Tc traF est observée. Lorsqu’il est fourni avec des mutants de dilution de traF et du plasmide PK184 dans les cellules donneuses, une perte de transfert conjugatif du plasmide knock-out chloramphénicol pOX38-Tc traF peut être observée.La perte de transfert conjugatif indique la région de la protéine importante pour les interactions protéine-protéine dans le système de sécrétion conjugatif de type quatre. Cette région peut ensuite être sondée plus en détail par des mutations ponctuelles qui affectent l’efficacité du transfert. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une seule journée de travail avec des temps de croissance prévus.Ce protocole peut être réalisé sur des cellules autres que celles démontrées ici. L’aspect critique, à ce stade, est que les cellules donneuses et receveuses n’hébergent pas le plasmide d’intérêt. Ainsi, lorsque vous ajoutez le plasmide knock-out, vous n’obtenez pas de résultats contradictoires.Lors de la tentative de cette procédure, il est important d’être très organisé car il existe différentes conditions de croissance et antibiotiques pour les cellules donneuses, receveuses et transconjuguées. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que la cristallographie, la RMN ou la spectrométrie de masse peuvent être réalisées afin d’obtenir une image structurale et fonctionnelle détaillée de la protéine d’intérêt.

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Genetics

Génétique

Une méthode rapide et efficace d'intégrer l'ADN étranger dans des souches d'intérêt accepteurs pré-faites, dites souches piste d'atterrissage, est décrite. Procédé permettant d'intégration spécifique de site d'une cassette d'ADN dans le locus piste d'ingénierie d'une souche donnée, par conjugaison et l'expression de l'intégrase ΦC31.

Site spécifique génie chromosome bactérien: ΦC31 intégrase médiation Cassette Exchange (IMCE)

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Conjugatif Mating Assays pour l'analyse des protéines de transfert impliqués dans Conjugaison bactérienne spécifique à la séquence

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