Name: Préparation de l’échantillon miniaturisé pour la microscopie électronique à Transmission (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-27T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Découvrez une méthode innovante de préparation d'échantillons miniaturisés pour la microscopie électronique à transmission sans étape de buvardage papier. Cette technique réduit la perte d'échantillon et permet l'analyse de lysats de cellules uniques pour la protéomique visuelle.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Les auteurs aimeraient remercier l’atelier de la Biozentrum de l’Université de Bâle pour leur soutien, S. A. Müller de discussions critiques et de lire attentivement le manuscrit, A. Fecteau-LeFebvre pour l’assistance technique avec EM, Ricardo Adaixo, Frank Lehmann pour protéine membranaire tester des échantillons (tous des C-CINA, Biozentrum, Université de Bâle) et A. Engel, émérite Université Bâle pour ses conversations inspirantes. Les échantillons ont été gracieusement fournis par P. Ringler, m.-a Mahi et T. Schwede (Biozentrum, Université de Bâle), P. Leiman (laboratoire de biologie structurale et biophysique, EPFL) et R. Diaz-Avalos (Structural Biology Center de New York, États-Unis). Le projet a été soutenu par l’Institut suisse de nanosciences (SNI, projet P1401, projet ARGOVIA MiPIS) et le Swiss National Science Foundation (SNF, projet 200021_162521).

<ol><li>Kuhlbrandt, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Biochemistry%3A+The+resolution+revolution%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Biochemistry: The resolution revolution.</a> Science. 343 (6178), 1443-1444 (2014).</li>
<li>Bai, X. -c, McMullan, G., Scheres, S. H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+cryo-EM+is+revolutionizing+structural+biology%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Biochem+Sci%22%5BJournal%5D)">How cryo-EM is revolutionizing structural biology.</a> Trends Biochem Sci. 40 (1), 49-57 (2015).</li>
<li>Dubochet, J., Adrian, M., Chang, J. J., Homo, J. C., Lepault, J., McDowall, A. W., Schultz, P. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/3043536">Cryo-electron microscopy of vitrified specimens.</a> Q Rev Biophys. 21 (2), 129-228 (1988).</li>
<li>Lepault, J., Booy, F. P., Dubochet, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+microscopy+of+frozen+biological+suspensions%5BTitle%5D)+AND+%22J+Microsc%22%5BJournal%5D)">Electron microscopy of frozen biological suspensions.</a> J Microsc. 129, Pt 1 89-102 (1983).</li>
<li>Baker, L. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Radiation+damage+in+electron+cryomicroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Enzymol%22%5BJournal%5D)">Radiation damage in electron cryomicroscopy.</a> Methods Enzymol. , (2010).</li>
<li>Crewe, A. V., Eggenberger, D. N., Wall, J., Welter, L. M. <a target="_blank" href="https://aip.scitation.org/doi/abs/10.1063/1.1683435">Electron gun using a field emission source.</a> Rev Sci Instrum. , (2003).</li>
<li>Zemlin, F. <a target="_blank" href="https://www.sciencedirect.com/science/article/pii/0968432894900264">Expected contribution of the field-emission gun to high-resolution transmission electron microscopy.</a> Micron. 25 (3), 223-226 (1994).</li>
<li>Scheres, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RELION%3A+implementation+of+a+Bayesian+approach+to+cryo-EM+structure+determination%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination.</a> J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).</li>
<li>Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FREALIGN%3A+high-resolution+refinement+of+single+particle+structures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">FREALIGN: high-resolution refinement of single particle structures.</a> J Struct Biol. 157 (1), 117-125 (2007).</li>
<li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. a, Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nat methods. 10, 584-590 (2013).</li>
<li>Milazzo, A. -C., Cheng, A., Moeller, A., Lyumkis, D., Jacovetty, E., Polukas, J., Ellisman, M. H., Xuong, N. -H., Carragher, B., Potter, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+evaluation+of+a+direct+detection+device+detector+for+single+particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Initial evaluation of a direct detection device detector for single particle cryo-electron microscopy.</a> J Struct Biol. 176 (3), 404-408 (2011).</li>
<li>Ruskin, R. S., Yu, Z., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+characterization+of+electron+detectors+for+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantitative characterization of electron detectors for transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 184 (3), 385-393 (2013).</li>
<li>Veesler, D., Campbell, M. G., Cheng, A., Fu, C. -y, Murez, Z., Johnson, J. E., Potter, C. S., Carragher, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+the+potential+of+electron+cryomicroscopy+data+collected+using+direct+detectors%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Maximizing the potential of electron cryomicroscopy data collected using direct detectors.</a> J Struct Biol. 184 (2), 193-202 (2013).</li>
<li>Campbell, M. G., Cheng, A., Brilot, A. F., Moeller, A., Lyumkis, D., Veesler, D., Pan, J., Harrison, S. C., Potter, C. S., Carragher, B., Grigorieff, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movies+of+ice-embedded+particles+enhance+resolution+in+electron+Cryo-microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Structure%22%5BJournal%5D)">Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron Cryo-microscopy.</a> Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).</li>
<li>Ripstein, Z. A., Rubinstein, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+Cryo-EM+movie+data%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Processing of Cryo-EM movie data.</a> Methods in Enzymology. 579, 103-124 (2016).</li>
<li>Li, X., Mooney, P., Zheng, S., Booth, C. R., Braunfeld, M. B., Gubbens, S., Agard, D. A., Cheng, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Electron+counting+and+beam-induced+motion+correction+enable+near-atomic-resolution+single-particle+cryo-EM%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM.</a> Nature Methods. 10 (6), 584-590 (2013).</li>
<li>McLeod, R. A., Kowal, J., Ringler, P., Stahlberg, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+image+alignment+for+cryogenic+transmission+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Robust image alignment for cryogenic transmission electron microscopy.</a> J Struct Biol. 197 (3), 279-293 (2017).</li>
<li>Cheng, Y., Grigorieff, N., Penczek, P. A., Walz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+primer+to+single-particle+cryo-electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A primer to single-particle cryo-electron microscopy.</a> Cell. 161 (3), 438-449 (2015).</li>
<li>Brenner, S., Horne, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+negative+staining+method+for+high+resolution+electron+microscopy+of+viruses%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">A negative staining method for high resolution electron microscopy of viruses.</a> Biochim Biophys Acta. 34, 103-110 (1959).</li>
<li>De Carlo, S., Harris, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Negative+staining+and+cryo-negative+staining+of+macromolecules+and+viruses+for+TEM%5BTitle%5D)+AND+%22Micron%22%5BJournal%5D)">Negative staining and cryo-negative staining of macromolecules and viruses for TEM.</a> Micron. 42 (2), 117-131 (2011).</li>
<li>Glaeser, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+good+can+cryo-EM+become%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">How good can cryo-EM become.</a> Nat Methods. 13, 28-32 (2016).</li>
<li>Engel, A. in . <a target="_blank" href="http://www.springer.com/us/book/9783642025969">Single Molecule Spectroscopy in Chemistry, Physics and Biology</a>. Graslund, A., Rigler, R., Widengren, J. 96, Springer Berlin. Heidelberg, Berlin. 417-431 (2010).</li>
<li>Kemmerling, S., Ziegler, J., Schweighauser, G., Arnold, S. A., Giss, D., Müller, S. A., Ringler, P., Goldie, K. N., Goedecke, N., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Engel, A., Braun, T. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/22094535">Connecting µ-fluidics to electron microscopy.</a> J Struct Biol. 177 (1), 128-134 (2012).</li>
<li>Arnold, S. A., Albiez, S., Opara, N., Chami, M., Schmidli, C., Bieri, A., Padeste, C., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Total+sample+conditioning+and+preparation+of+nanoliter+volumes+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+nano%22%5BJournal%5D)">Total sample conditioning and preparation of nanoliter volumes for electron microscopy.</a> ACS nano. 10 (5), 4981-4988 (2016).</li>
<li>Kemmerling, S., Arnold, S. A., Bircher, B. A., Sauter, N., Escobedo, C., Dernick, G., Hierlemann, A., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+lysis+for+visual+analysis+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell lysis for visual analysis by electron microscopy.</a> J Struct Biol. 183, 467-473 (2013).</li>
<li>Arnold, S. A., Albiez, S., Bieri, A., Syntychaki, A., Adaixo, R., McLeod, R. A., Goldie, K. N., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blotting-free+and+lossless+cryo-electron+microscopy+grid+preparation+from+nanoliter-sized+protein+samples+and+single-cell+extracts%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Blotting-free and lossless cryo-electron microscopy grid preparation from nanoliter-sized protein samples and single-cell extracts.</a> J Struct Biol. 197 (3), 220-226 (2017).</li>
<li>Ramakrishnan, C., Bieri, A., Sauter, N., Roizard, S., Ringler, P., Müller, S. A., Goldie, K. N., Enimanev, K., Stahlberg, H., Rinn, B., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((openBEB%3A+open+biological+experiment+browser+for+correlative+measurements%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">openBEB: open biological experiment browser for correlative measurements.</a> BMC Bioinformatics. 15, 84(2014).</li>
<li>Giss, D., Kemmerling, S., Dandey, V., Stahlberg, H., Braun, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+the+interactome%3A+microfluidic+isolation+of+proteins+and+interacting+partners+for+quantitative+analysis+by+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Exploring the interactome: microfluidic isolation of proteins and interacting partners for quantitative analysis by electron microscopy.</a> Anal Chem. 86, 4680-4687 (2014).</li>
</ol>

Les auteurs Stefan A. Arnold, Henning Stahlberg et Thomas Braun déclarent l’intérêt financier concurrent suivant : le concept de cryoWriter fait partie de la demande de brevet PCT / EP2015/065398 et EP16194230.

L’instrument de « cryoWriter » et les protocoles requis pour préparer les grilles échantillon pour NS - et cryo-EM des volumes d’échantillon total nL taille et complètement éviter l’étape de papier-buvard classique sont présentés. Principes de microfluidique et un système de micromécanique sont combinés dans le cryoWriter pour rendre cela possible.
Notre expérience montre que lorsque les méthodes miniaturisés présentées dans ce manuscrit sont utilisés, l’espace de paramètre pour la préparation de l’EM-grille est plus grand que des méthodes classiques et sous un contrôle plus strict utilisateur. Ce qui est important, la reproductibilité accrue atteinte permet de pré-visualiser avec système de tampon échantillon, complété par une protéine test facilement disponibles, pour déterminer les paramètres optimaux avant l’expérience réelle ne soit effectuée. Ceci maintient la consommation de l’échantillon d’intérêt à l’absolu minimum et est fortement recommandée. Les étapes cruciales pour les deux préparation de grille NS - et cryo-EM sont : (i) d’amorçage du système pompe ; pour sup-nanolitres toute distribution de volume, le liquide (eau) doit être dégazée et bubble gratuit. (ii) contrôle précis de la lampe à décharge luminescente ou plasma nettoyage étape ; les caractéristiques de surface de la grille de l’EM sont essentiels pour obtenir des résultats reproductibles. (iii) conditionnement d’échantillon ; le temps requis pour le conditionnement, par exemple, avec NS, dépend le type de tampon, la teneur en sel et la concentration (Figure 3), ainsi que sur la géométrie de la buse de la microcapillaire24. (iv) taux d’évaporation des préparatifs de la NS-EM EM quantitative ; l’effet du café-anneau peut interdire l’analyse quantitative des préparations de NS-EM et doit être supprimée par des taux d’évaporation lente contrôlées par la DP-scène.
Différents aspects des méthodes de préparation de la grille présentée librement combinables permettant l’élaboration de protocoles polyvalents pour des exemples spécifiques. Des exemples typiques seraient l’élimination d’une substance qui empêche les EM à haute résolution, par exemple, glycérol, par une étape de conditionnement avant la préparation de la grille pour cryo-EM ; l’introduction de molécules de médiateur, comme ligands, par conditionnement avant que les grilles sont préparées ; ou l’examen de la seule cellule de lysat de NS - ou cryo-EM (Figure 6).
L’utilisation de la microfluidique et des quantités d’échantillon minimale dans les méthodes présentées supprime complètement le besoin d’étapes papier-buvard. Il s’agit d’un grand avantage, car le papier buvard est un traitement sévère pour les protéines, potentiellement contaminer l’échantillon avec les ions indésirables et intrinsèquement conduisant à la perte massive d’échantillon. En revanche, les effets potentiels de l’interface air-eau du film mince échantillon formé quand les échantillons de cryo-EM sont préparés à la manière classique sont évités pas lorsque le cryoWriter est utilisé. Grilles pour cryo-EM peuvent être préparés avec un temps d’attente inférieur à 0,2 s entre l’exemple d’application et de la vitrification (données non présentées). Cependant, comme protéines voyagent quelques dixièmes de nanomètre en quelques nanosecondes par diffusion, il est encore assez de temps pour eux d’entrer en collision avec l’interface air-eau d’un film d’épaisseur d’échantillon nm 100 plusieurs fois. Cependant, la quantité de protéines s’en tenir à l’interface air-eau peut être significativement réduite par ces lacunes de peu de temps et pourrait empêcher la dénaturation de la protéine ou restreinte d’orientation de la particule. Une autre approche prometteuse qui pourrait protéger les protéines sensibles de l’interface air-eau est de couvrir le film échantillon de tensio-actifs de faible poids moléculaire. Ces composés pourraient être rapidement présentés par une étape de conditionnement dans le cryoWriter avant la préparation de la grille. Le rapport surface-volume élevé des systèmes microfluidiques est une autre limite de le cryoWriter, comme échantillon peut potentiellement être perdu par adsorption non spécifique à la surface microcapillaire et perturber l’analyse quantitative par comptage des particules. Le problème est abordé de deux façons : tout d’abord, l’échantillon ne déplace pas dans le microcapillaire de longues distances. En effet, le volume d’échantillon nanolitres reste à la pointe capillaire tout au long du traitement. En second lieu, la surface à rapport volumétrique est plus réduite en utilisant microcapillaries avec relativement grands diamètres intérieurs, par exemple, 180 µm. Troisièmement, les surfaces de la microcapillaries peuvent être facilement passivés, si nécessaire, par exemple, en les traitant avec glycols d’éthanol polylysine commercialement disponibles (PLL-PEG).
L’analyse à haute résolution des protéines par l’approche d’une seule particule utilisée dans EM exige seulement 100 000 pour quelques images de millions de particules de protéines individuelles. Cela signifie que les techniques microfluidiques peuvent fournir assez complexes de protéine pour l’enquête structurelle. Une méthode immuno-précipitation miniaturisés pour l’isolement rapide de complexes protéiques (environ 1 heure) des montants minimes cellulaire (env. 40 000 cellules) a été développée plus tôt28. Cette méthode est maintenant directement liée à la phase de préparation d’échantillon miniaturisée de la cryoWriter. L’objectif final est de développer un pipeline intégré microfluidiques pour protéine ultra-rapide d’isolement et cryo-EM grille préparation qui nécessite moins de deux heures en tout. En outre, comme le montre la Figure 6, la quantité infime et le volume du matériel nécessaire pour la préparation des échantillons et la climatisation presque sans perte et la procédure de préparation de grille réalisée à l’aide de la cryoWriter, permettent d’étudier la protéine complexes de cellules individuelles. Ensemble, la méthode d’immuno-précipitation miniaturisés et le cryoWriter jeter les fondements d’une nouvelle méthode de protéomique, appelée « cellule unique visual protéomique », comme nous l’a récemment démontré pour le choc thermique expériences24. Les algorithmes d’analyse de données axées sur l’analyse d’images « protéomique visuelle » sont actuellement à l’essai.

Matériel et logiciels pour l’analyse structurale des complexes de protéine par microscopie électronique à transmission (TEM) a massivement avancé au cours de ces dernières années. Les améliorations apportées a ouvert la voie à une « révolution de la résolution »1,2 et fondamentalement changé recherche structurale. La révolution a commencé avec l’avènement de cryo-electron microscopy (cryo-EM)3,4, qui permet la préparation d’échantillons biologiques sous proche des conditions physiologiques tout en diminuant la sensibilité de la radiation et la prévention évaporation d’échantillon dans le vide du microscope électronique à transmission5. Dans les années suivantes, progrès technologique a graduellement augmenté la résolution réalisable. Parmi ces innovations ont été l’application de canons de l’émission de champ6,7et, plus récemment, amélioration des algorithmes d’analyse de données, tels que les méthodes de maximum de vraisemblance8,9. Direct électronique détecteur caméras10,11,12,13, imagerie en mode film et l’accompagnement logiciel développements14,15, 16 , 17, fourni la percée finale requise pour atteindre la résolution atomique pour échantillons biologiques par analyse de particules uniques (pour une revue, voir Cheng, Grigorieff, et al. 18). l’importance de la cryo-EM a récemment été reconnu par l’attribution du prix Nobel de chimie à trois des pionniers.
Pour un échantillon biologique par TEM de l’image, la méthode utilisée pour charger la grille EM avec l’échantillon (par la suite dénommé « préparation de la grille ») doit s’assurer que la couche résultante de l’échantillon (i) est assez mince (&lt; 100 nm) pour éviter les bruits de vastes d’inélastiques ou multiplier dispersés électrons, (ii) résiste au vide poussé du microscope électronique, et (iii) protège les biomolécules des radiolésions. Deux méthodes principales sont utilisées pour remplir ces gratifications : colorant négatif(NS)19,20 procédures (Figure 1A) adsorbent l’échantillon à un film de carbone mince, incorporer les biomolécules dans amorphe métaux lourds, puis permettre à l’Assemblée sécher à l’air. C’est simple et rapide, et les grilles de EM chargés (par la suite dénommés « grilles d’échantillon ») sont faciles à stocker et peuvent être maintenus pendant de longues périodes de temps (en général années). En TEM, les préparations présentent un contraste élevé en raison de la NS et tolèrent des doses plus élevées d’électrons que cryo-préparations, mais la résolution est limitée à environ 20 procédures Å. Cryo-EM (Figure 1B) emploient holey carbone prend en charge. Une couche mince de la solution échantillon est enjambée à travers les trous et la grille de l’EM est plongée dans un cryogène, éthane habituellement liquéfié, pour la refroidir rapidement au-dessous de-150 ° C. Le résultat est un amorphe, vitrifiée, 50 à 100 nm d’épaisseur film de la solution dans les trous de la prise en charge. Ce film mince, amorphe résiste le vide poussé au microscope électronique et, dans le cas idéal, préserve les structures biologiques dans leur état natif. La procédure permet d’échantillons biologiques à être photographiée à haute résolution. Cependant, la grille de l’échantillon doit être conservée à température ci-dessous-150 ° C en permanence pour éviter les devitrification. Il peut être copié à l’aide de doses relativement élevées d’électrons en raison de la basse température, mais le contraste et le rapport signal-bruit est néanmoins faible. Par conséquent, moyenne techniques sont employées pour augmenter le contraste et, pourvu que l’échantillon est photographié sous différents angles, Tèlèchargez la carte en trois dimensions (3D) peut être reconstruite. Le plus couramment utilisé et une méthode très réussie pour la reconstruction 3D à partir de maintenant est l’approche d’une seule particule. Pour une revue récente, voir Cheng al.18.
Colorant négatif TEM (NS-EM) est important pour le dépistage et le contrôle de la qualité, quand le contraste élevé est nécessaire ou lorsqu’il existe seulement une quantité limitée de l’échantillon (adsorption pour le film de carbone concentre généralement l’échantillon). Une seule particule cryo-EM est la méthode de l’étalon-or si les reconstructions 3D haute résolution de la structure de la protéine sont visées pour.
<img alt="Schéma des techniques de micro-manipulation ; Comprend le dépôt de gouttelettes, l’extraction de nanostructures et le transfert." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57310/57310fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1: préparation de grille de principes de TEM et la comparaison entre le classique (panneau A, B) et une approche de microfluidique (panneau C, D). A) préparation de grille classique NS-EM : environ 3 µL de l’échantillon sont reversé à la main sur une grille de EM recouverte d’un film de carbone continue (dénommé par la suite une « grille de NS-EM ») (i). Après incubation pendant env. 10 s, papier filtre est utilisé pour sécher à l’excès de liquide du côté (ii), laissant les molécules adsorbées dans un film mince de l’eau. Par la suite, la protéine est incubée dans une solution de sel de métaux lourds, par exemple, 2 % d’acétate d’uranyle, pendant 20 s (iii) et nouveau le liquide est supprimé en tamponnant sur le côté à l’aide de papier filtre (iv). Enfin, l’EM-grille on laisse pour sécher à l’air. B) préparation de grille classique cryo-EM : environ 3 µL de l’échantillon sont distribués par un coup de main sur un film de carbone trouée. Pour former un film mince échantillon, le liquide excédentaire est enlevé par le papier-buvard visage-sur d’une ou deux faces (ii). Enfin, la grille est rapidement plongée dans éthane liquide pour la vitrification (iii). C) préparation de grille de NS-EM en utilisant la configuration de cryoWriter : volume A 5 nL est aspiré de la crosse de l’échantillon à l’aide d’un microcapillaire (i). Pour exemple de conditionnement, la pointe microcapillaire est immergée dans la solution de climatisation, par exemple, 2 % d’acétate d’ammonium. Ions et petites molécules sont échangés par diffusion (ii). Notez que les dimensions de la microcapillaire veille à ce que l’ensemble du processus est piloté par diffusion. Les protéines sont les constantes de diffusion beaucoup plus faible que les ions de sels et ne disparaissent pas significativement24. Enfin, l’échantillon est distribué sur la grille et laisser sécher (iii). D) principes de préparation de grille de cryo-EM à l’aide de la méthode axée sur les cryoWriter : EM An grille recouverte d’un film de carbone holey est placé sur la surface d’une plateforme à température contrôlée et qui s’est tenue par la pince à épiler. La température de la plate-forme est contrôlée à un décalage par rapport à la température de point de rosée de l’environnement de la grille. La grille est déplacée par rapport à la microcapillaire contenant l’échantillon et le microcapillaire s’abaisse jusqu'à ce qu’il est de quelques micromètres au-dessus de la grille. Par la suite, quelques microseringues de l’échantillon sont dispensés d’elle, tandis que la scène est déplacée dans un motif en spirale ; le liquide en excès est ré-aspiré (i). Après la grille EM d’amorçage, le microcapillaire est retiré et la grille reste sur la plateforme contrôlées de température (par la suite appelée stade de point de rosée (DP)) pendant une courte période afin de permettre une quantité contrôlée de l’échantillon de s’évaporer. Pour plongeon de congélation, la grille est rapidement retirée de la scène à l’aide de la pince à épiler (ii), renversée par 90° en position verticale et plongée dans un bain de cryogène (iii) (par la suite dénommé « pick-et-plongeon » mécanisme). <a href="/files/ftp_upload/57310/57310fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Malheureusement, les méthodes de préparation de grille utilisées pour NS et cryo-EM n’ont pas significativement amélioré depuis qu’ils ont été inventés. Les inconvénients actuels sont la consommation élevée d’échantillon (env. 3 µL de protéine de 1 mg/mL) et la grande quantité (&gt; 99 %) de l’échantillon (Figure 1A, B) a perdu. En outre, la méthode classique utilisée pour préparer les grilles pour cryo-EM est une procédure dure pour les protéines : tout d’abord, il s’agit d’une vaste visage-sur papier-buvard étape (Figure 1B, ii), et, deuxièmement, la protéine est exposée à l’interface air-eau pour une quantité importante de temps21. Ici, une méthode alternative pour échantillon pré conditionnement, préparation des échantillons grille et post-traitement (grille de séchage ou vitrification) pour NS-EM (Figure 1C) ou cryo-EM (Figure 1D) est présenté. Le programme d’installation intégré interne, appelé « cryoWriter », utilise miniaturisé échantillon manutention principes technologiques et microfluidique pour aspirer, condition et de distribuer des échantillons, en évitant de papier buvard complètement et en fournissant des méthodes alternatives aux échantillons minces pour Cryo-EM. Il a considérablement réduit la consommation d’échantillon et améliore le contrôle utilisateur au cours de la préparation de l’échantillon dans son ensemble. En outre, la méthode permet de nouvelles applications expérimentales ; comme la préparation des composants biologiques isolés des cellules individuelles dans une approche appelée « cellule unique visual protéomique »22,23,24,25.

<table><tbody><tr><td>Manipulation des liquides</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Pointe microcapillaire</td><td>Nouveau Objectif</td><td>FS360-100-30-N-20</td><td>SilicaTips 30 &micro ; m pointe ID, 100 &micro ; m ID , pk. 20</td></tr><tr><td></td><td></td><td>FS360-150-30-N-20</td><td>SilicaTips 30 &micro ; m pointe ID, 150 & micro ; m ID , pq. 20</td></tr><tr><td>Manchon conducteur</td><td>Nouvel objectif</td><td>CONGAS-1&nbsp ;</td><td>Élastomère conducteur pour contact HV, 12" de long</td></tr><tr><td>Tube en silice fondue</td><td>BGB-Analytik</td><td>TSP-150375</td><td>TSP Standard FS Tube, 150 &micro ; m ID, 363 & micro ; m OD, 5 mètres</td></tr><tr><td>Connecteur PressFit</td><td>BGB-Analytik</td><td>2525LD</td><td>Deact. Connecteur PressFit 0,25 à 0,25 mm ID, pqt. 25&nbsp ;</td></tr><tr><td>Seringue 10 & micro ; l</td><td>BGB-Analytik</td><td>HA-80001</td><td>Hamilton 1701 LT - Pointe Luer (aiguille non incluse)&nbsp ;</td></tr><tr><td>Contrôleur de pompe à seringue</td><td>Cetoni</td><td>A3921000093</td><td>Contrôleur neMESYS</td></tr><tr><td>Unité de dosage de pompe à seringue</td><td>Cetoni</td><td>A3921000095</td><td>unité de dosage neMESYS</td></tr><tr><td>Contrôle de la températureCapteur de point de</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>rosée</td><td>Meltec</td><td>UFT75-AT</td><td>Capteur d’humidité/température, calcul du point de rosée, USB et DLL</td></tr><tr><td>intégré Température capteur</td><td>Sensorshop24.ch</td><td>LS7-PT1000-1.0-3L</td><td>Capteur de température montable en surface Pt1000</td></tr><tr><td>Contrôleur Peltier</td><td>Cooltronic</td><td>TC2812&nbsp ;</td><td>Régulateur de température PID pour l’activation de systèmes pilotés par Peltier avec une sortie de tension constante</td></tr><tr><td>Élément peltier</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-127-14-15-S</td><td>40x40 mm</td></tr><tr><td>Bloc de refroidissement par eau</td><td></td><td>--</td><td>Bloc de refroidissement par eau pour élément peltier 40x40 mm, base en cuivre</td></tr><tr><td>Pompe à eau</td><td></td><td>Digitec.ch 294877</td><td>XSPC X20 750 Dual 5.25 Bay Reservoir Pump Noir V4</td></tr><tr><td>Bloc d’échangeur de chaleur d’eau</td><td>-</td><td>-</td><td>Bloc d’échangeur de chaleur d’eau avec 2 ventilateurs pour refroidir l’eau en circulation</td></tr><tr><td>Petits refroidisseurs d’eau</td><td>PCHC.ch</td><td>223050</td><td>Alphacool MCX ram copper edition 2 pcs</td></tr><tr><td>Petits éléments peltier</td><td>Distrelec.ch</td><td>PE-031-10-15-S</td><td>Laird 15x15 mm 3.4 A 8.1 W 3.8 V 74 &deg ; C, 2 pièces</td></tr><tr><td>Mechanics</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>Platine linéaire</td><td>axe z Dyneos AG</td><td>M-404.2PD</td><td>Platine de translation de précision à haute charge, plage de déplacement de 50 mm, moteur à courant continu</td></tr><tr><td>Contrôleur de platine</td><td>Dyneos AG</td><td>C-863</td><td>Servo contrôleur de mercure</td></tr><tr><td>Microscope Platine sur l’axe xy</td><td>Prior Scientific</td><td>H117EIL5</td><td>Platine motorisée pour Zeiss Axiovert 200 microscope inversé</td></tr><tr><td>Petits aimants permanents</td><td>Supermagnete</td><td>S-05-08-N</td><td>Aimant à tige & Oslash ; 5 mm, hauteur 8,47 mm, néodyme, N45, nickelé, pqt. 10</td></tr><tr><td>Petit électroaimant</td><td>Schramme</td><td>EG1025A02/110</td><td>Électroaimant 24V 220 N 150 N 2,5 W</td></tr><tr><td>Électroaimant de commande</td><td>Conrad.ch</td><td>MST-1630.001 7</td><td>Commande d’électroaimant Carte PCB</td></tr><tr><td>moyeu solénoïde</td><td>Distrelec.ch</td><td>HD8286-R-F-24V100 %</td><td>Kuhnke Solenid Moyeu 30 mm 16 N 2 N 16 W</td></tr><tr><td>Mini pince à épiler</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>0302-M5S-PS</td><td>Dumont Type 5 mini, pointes super fines</td></tr><tr><td>Diverses pièces optomécaniques</td><td>Thorlabs</td><td>-</td><td>-</td></tr><tr><td>Pièces mécaniques diverses</td><td>Atelier Biozentrum, Université de Bâle-Plaques</td><td></td> <td>d’adaptation conçues sur mesure, supports, etc. voir les fichiers CAO joints</td></tr><tr><td>Diode laser Optics</td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td></td><td>Thorlabs</td><td>CPS780S</td><td>780 nm Module de diode laser 2,5 mW</td></tr><tr><td>Détecteur de gain commutable</td><td>Thorlabs</td><td>PDA100A-EC</td><td>Si, 320-1100 nm, 2,4 MHz BW, 100 mm2</td></tr><tr><td>EM grids</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DURASIN FILM TEM</td><td></td> <td>emsdiasum.comDTF-03523</td><td>Membranes en nitrure de silicium 30 nm DuraSiN&trade ; pour TEM, paquet de 5</td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 mesh R 2/1</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Quantifoil Cu 200 mesh R 1.2/1.3</td><td>Quantifoil Micro Tools GmbH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Buffers / Neg. stain</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma</td><td>D8537&nbsp ; SIGMA</td><td>Dulbecco' s Phosphate salin tamponné</td></tr><tr><td>NanoVan 2</td><td> %nanoprobes.com</td><td></td><td>Coloration négative à base de vanadium</td></tr><tr><td>NanoW 2 %</td><td>nanoprobes.com</td><td></td><td>Coloration négative à base de tungstène</td></tr><tr><td>Software</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>openBEB</td><td></td><td></td><td>Le cadre openBEB 2 est disponible sur demande, la version 3 sera téléchargeable</td></tr><tr><td>Contrôle CryoWriter logiciel (plugin openBEB)</td><td></td><td>Disponible sur demande, des frais supplémentaires pour les logiciels de pilote tiers peuvent s’appliquer.</td><td></td></tr></tbody></table>

préparation de l’échantillon miniaturisé pour la microscopie électronique à transmission

Miniaturized Sample Preparation for Transmission Electron Microscopy

En raison des progrès technologiques récents, cryo microscopie électronique (cryo-EM) devient rapidement une méthode standard pour l’analyse structurale des complexes de protéine à la résolution atomique. Cependant, techniques d’isolation de protéine et les méthodes de préparation d’échantillon pour EM restent un goulot d’étranglement. Un nombre relativement faible (100 000 à quelques millions) des particules de protéines individuelles doivent être photographié pour l’analyse à haute résolution des protéines par la seule particule approche EM, rendant l’échantillon miniaturisé manipulation techniques et principes microfluidiques faisable.
Miniaturisés, papier-buvard-free EM grille PROCEDE de preparation de pré conditionnement d’échantillon, de EM grille d’amorçage et de post-traitement qui ne consomme que nanolitre-volumes d’échantillon est présenté. La méthode utilise un système de distribution avec une précision sub-nanolitres pour absorption liquide contrôle et amorçage grille EM, une plate-forme pour contrôler la température de la grille ainsi déterminer l’humidité relative au-dessus de la grille de l’EM et un pick-et-plongée-mécanisme d’échantillon vitrification. Pour cryo-EM, une grille d’EM est placée sur la scène à température contrôlée et l’échantillon est aspiré dans un tube capillaire. La pointe capillaire est placée à proximité de la surface de la grille, la grille est chargée avec l’échantillon et excès est ré-aspiré dans le microcapillaire. Par la suite, le film de l’échantillon est stabilisé et légèrement éclairci par évaporation de l’eau contrôlée réglementée par le décalage de la température de la plate-forme par rapport au point de rosée. À un moment donné, le mécanisme de choix-et-plongement est déclenché, transférer rapidement la grille EM amorcée en éthane liquide pour la vitrification de l’échantillon. Alternativement, les méthodes de conditionnement d’échantillon sont disponibles pour préparer le volume des échantillons de taille nanolitres pour une coloration négative (NS) EM.
Les méthodologies de considérablement réduisent la consommation de l’échantillon et éviter les approches potentiellement nuisibles aux protéines, telles que le filtre papier buvard utilisées dans les méthodes conventionnelles. En outre, la minuscule quantité d’échantillon nécessaire permet de nouvelles stratégies expérimentales, telles que rapide exemple conditionné, combinaison avec lyse monocellulaires pour « protéomique visuel », ou « sans perte » préparation de l’échantillon total pour l’analyse quantitative des échantillons complexes.

Méthodes pour la préparation du volume des échantillons de taille nanolitres pour microscopie électronique à transmission et un instrument est présenté. Aucune étape de papier-buvard est requise, afin d’éviter les conséquences négatives que cela peut avoir pour les protéines, considérablement réduisant la perte de l’échantillon et permettant l’analyse de lysat pour la protéomique visuel unique cellule.

Préparation de l’échantillon miniaturisé pour la microscopie électronique à Transmission

Due to recent technological progress, cryo-electron microscopy (cryo-EM) is rapidly becoming a standard method for the structural analysis of protein ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie de la structure, comme la préparation de protéines sensibles, lorsqu’une quantité limitée de protéines est disponible. Le principal avantage de cette technique est que, par rapport aux méthodes standard de préparation d’échantillons, seules des quantités infimes d’échantillon sont nécessaires et qu’aucune étape de transfert de papier dure n’est impliquée. Les implications de cette technique s’étendent à l’analyse de cellules uniques par protéomique visuelle, ou au diagnostic de maladies liées aux protéines.Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons eu la technologie disponible pour résoudre des structures à haute résolution avec seulement environ 100 000 particules individuelles. Pour commencer, préparez l’échantillon comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Ensuite, assemblez la tasse d’éthane, le support de boîte cryogénique et l’araignée.Et remplissez le récipient cryogénique à ras bord avec de l’azote liquide. Après quelques minutes, la tasse sera froide et exempte d’azote liquide. Ouvrez ensuite la bouteille de gaz éthane et laissez lentement le gaz s’écouler dans la coupelle d’éthane.Laissez la tasse se remplir d’éthane liquide jusqu’à ce que le niveau soit de deux à trois millimètres sous le haut. Cela prendra quelques minutes et nécessitera environ cinq millilitres d’éthane liquide. Retirez l’araignée, placez le couvercle en polystyrol sur le dessus et placez le récipient cryogénique sur le support dans l’enregistreur cryogénique.Saisissez la grille EM déchargée de lueur avec la pince à épiler de l’enregistreur cryogénique, nouez la pince à épiler sur l’électroaimant et vissez le micromanipulateur pour aligner la grille à plat sur la platine, côté film de carbone vers le haut. De retour dans le logiciel, double-cliquez sur grid_save. Ajustez ensuite la position du microcapillaire, de sorte que la pointe soit à environ 10 micromètres au-dessus de la surface de la grille.Assurez-vous que le microcapillaire peut se déplacer librement sur la grille, sans le toucher nulle part. Et si nécessaire, prélever le microcapillaire de quelques micromètres. Ensuite, ramenez-le à la position au centre de la grille et enregistrez la nouvelle position en tant que grille.Déplacez le microcapillaire vers la position d’origine. Ensuite, rincez le microcapillaire avec quelques dizaines de nanolitres de liquide du système et utilisez un tissu non pelucheux pour éliminer toutes les gouttes du microcapillaire. Maintenant que tout est prêt, lancez le script de macro.Le macro se met d’abord en position et distribue cinq nanolitres de liquide du système pour éliminer les bulles d’air à l’extrémité, puis se déplace vers la position des échantillons. Ensuite, il aspire 65 nanolitres d’échantillon, puis réinjecte cinq nanolitres dans le tube d’échantillon. Cela tient compte du jeu du système et permet une écriture synchronisée.Une fois qu’il s’est déplacé vers la position de la grille, il initie un modèle d’écriture, qui fera se déplacer le microcapillaire à travers la grille et distribuera simultanément 45 nanolitres d’échantillon. Ensuite, il ramène le microcapillaire au centre de la grille, l’abaisse de 10 micromètres supplémentaires et retire l’excès de liquide de l’échantillon. Enfin, le macro retire le microcapillaire et désactive l’électroaimant, ce qui déclenche le mécanisme de congélation en plongée.Une fois libéré de l’aimant, relâchez soigneusement l’adaptateur magnétique du piston et transférez rapidement la grille de la tasse d’éthane dans le récipient cryogénique, contenant la boîte cryogénique, en plaçant la grille dans une fente libre. Pour commencer, préparez les cellules comme décrit dans le protocole de texte ci-joint, et montez la lame d’oxyde d’indium et d’étain sur l’insert du microscope. Utilisez deux vis pour fixer la glissière sur l’insert en aluminium et pour assurer le contact électrique entre le revêtement en oxyde d’indium et d’étain de la glissière et le cadre en aluminium mis à la terre électriquement.Retirez ensuite le milieu de culture cellulaire du puits et lavez les cellules deux fois avec 300 microlitres de tampon d’électroporation. Après le dernier lavage, conservez les cellules dans le tampon d’électroporation. Ensuite, placez l’insert en aluminium qui maintient la lame d’oxyde d’indium et d’étain dans l’étage d’incubation de cellules vivantes, sur l’installation.À l’aide du microscope, localisez la culture cellulaire et choisissez une zone sans cellules. Approchez-vous de l’embout microcapillaire sur la surface de la glissière et touchez-le doucement. Retirez ensuite la pointe à 100 micromètres et enregistrez la position sous forme de cellules.Maintenant, quittez rapidement la culture cellulaire et rincez l’embout microcapillaire avec quelques dizaines de nanolitres de liquide du système, puis remettez-le dans la culture cellulaire. Versez quelques nanolitres pendant l’immersion dans le puits PDMS pour vous assurer qu’aucune bulle d’air n’est piégée à la pointe. Double-cliquez sur la position de la cellule et approchez-vous doucement de la surface de la lame d’oxyde d’indium et d’étain et, au contact, rétractez la pointe de 10 micromètres.À ce stade, sélectionnez une cellule voisine pour la lyse. et placez l’extrémité du microcapillaire au-dessus de la cellule ciblée. Démarrez ensuite le script de macro pour la lyse de cellule unique.Une fois lancé, le script demandera une position vers laquelle le microcapillaire doit être déplacé après qu’une cellule ait été lysée avec succès. Entrez la position souhaitée, par exemple la grille, pour la grille EM. La macro se déroulera ensuite sans intervention de l’utilisateur et commencera par déplacer la platine du microscope en culture cellulaire de 100 micromètres vers la gauche, où elle prendra un instantané de la cellule ciblée.Ensuite, 15 nanolitres d’eau doublement distillée s’écoulent du tube microcapillaire, déplaçant et diluant le tampon à haute teneur en sel, appliquant une pression osmotique à la cellule. Ensuite, la platine recule pour positionner à nouveau la pointe au-dessus de la cellule ciblée. Là, une rafale de tension prédéfinie est appliquée, et après 500 millisecondes, le système de pompe commence à aspirer trois nanolitres d’échantillon à un débit de deux microlitres par minute.Enfin, la platine se déplace à nouveau vers la gauche, ce qui permet d’inspecter la cellule. Une fenêtre s’affiche pour demander à l’utilisateur d’entrer sa candidature. Si la cellule a réussi, entrez oui pour prendre un instantané de la cellule lysée.Ensuite, le microcapillaire se déplace vers l’emplacement de l’endo, immergé dans le liquide du réservoir. Laissez le microcapillaire immergé pendant huit à 12 minutes, selon la géométrie de la buse. Ensuite, distribuez cinq nanolitres de lysat cellulaire conditionné sur la grille.Prélever le microcapillaire et laisser sécher lentement l’échantillon conditionné sur une étape de point de rosée. Enfin, retirez la grille de la scène et conservez-la à température ambiante dans une boîte à grille. Vous trouverez ci-dessous des images cryogéniques typiques d’échantillons congelés à l’aide de la configuration CryoWriter décrite.Dans la vue d’ensemble de la grille, la périphérie de la glace vitreuse est clairement visible. En examinant de plus près une fente de grille avec le film de carbone troué contenant de la glace vitreuse, des trous blancs peuvent être trouvés, indiquant que tous les trous n’ont pas été remplis avec un tampon d’échantillon. Dans l’un des échantillons contenant des trous de carbone, la queue d’un bactériophage est clairement visible avec des détails.En utilisant le CryoWriter mis en place pour effectuer la protéomique visuelle unicellulaire, on peut voir des choses telles que des protéines individuelles, par exemple de l’actine filamenteuse et des patchs membranaires avec des protéines attachées. L’image que vous pouvez voir dans le panneau 6b est colorée négativement avec une coloration négative de 2 %, basée sur un composé organotungstène. Le panneau c montre un lysat unicellulaire préparé pour la cryo-EM. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des grilles de coloration négative ou de cryo EM, à partir de volumes totaux de nanolitres d’échantillons de protéines ou d’extraits de cellules uniques.N’oubliez pas que travailler avec de l’éthane et de l’azote liquides peut être extrêmement dangereux, et que des précautions, telles que le port de lunettes de sécurité et d’une blouse de laboratoire, doivent toujours être prises lors de cette procédure.

miniaturized-sample-preparation-for-transmission-electron-microscopy

Research

Recherche

JoVE Journal

Biology

Biologie

Cryo Electron Microscope, soit à balayage (MEB) ou de transmission (TEM), sont largement utilisés pour la caractérisation des échantillons biologiques ou d'autres matériaux avec une forte teneur en eau 1. Une SEM / Focused Ion Beam (FIB) est utilisé pour identifier les caractéristiques d'intérêt dans des échantillons et extraire une lame mince, électron-transparent pour le transfert à un cryo-MET.

Cryo-microscopie électronique à la préparation des échantillons au moyen d&#39;un faisceau d&#39;ions focalisés

Ici, nous présentons un protocole pour préparer des échantillons avec un faible nombre de cellules pour l’analyse en microscopie électronique à transmission (MET).

Une approche alternative pour la préparation de l&#39;échantillon avec une faible Nombre de cellules d&#39;analyse TEM

Ce rapport décrit un protocole de préparation d’échantillons et des conditions d’imagerie spécifiques pour effectuer la tomographie électronique à transmission à balayage d’échantillons biologiques épais.

Préparation et observation d&#39;échantillons biologiques épais par tomographie électronique à transmission à balayage

Cette étude présente des procédures fiables et faciles pour obtenir des coupes sériées ultraminces d’un micro-organisme sans matériel coûteux en microscopie électronique à transmission.

Une méthode pour obtenir des coupes sériées ultraminces de micro-organismes en microscopie électronique à Transmission

Ce protocole décrit les différentes techniques nécessaires à la microscopie électronique en transmission dont une coloration négative, coupes ultraminces pour structure détaillée et l’immuno-or étiquetage afin de déterminer les positions des protéines spécifiques dans les exosomes.

Préparation des échantillons et l’imagerie des Exosomes par microscopie électronique à Transmission

Nous présentons ici un protocole permettant de combiner deux techniques traitement échantillon haute pression gel et traitement des échantillons assistée par micro-ondes, suivie de minime résine enrobage d’acquisition de données avec un microscope électronique à balayage faisceau ionique focalisé (FIB-SEM). Cela est démontré à l’aide d’un échantillon de nerf tibial de souris et le Caenorhabditis elegans.

Préparation de l’échantillon biologique par congélation à haute pression, amélioration du contraste assistée par micro-ondes et minime résine enrobage pour l’imagerie de Volume

Ce rapport fournit une nouvelle procédure de préparation d’échantillons pour visualiser les jonctions neuromusculaires chez les larves de drosophile . Cette méthode est plus efficace pour empêcher l’enroulement des échantillons par rapport à la méthode traditionnelle et est particulièrement utile pour l’analyse ultrastructurale de la jonction neuromusculaire de la drosophile .

Optimisation du processus de préparation d’échantillons pour la microscopie électronique à transmission des jonctions neuromusculaires chez les larves de drosophile

Ce protocole présente une méthode pratique utilisant Methanocaldococcus jannaschii (MjsHSP16.5) comme exemple pour traiter la distribution inégale des particules par l’optimisation de la préparation des échantillons, fournissant une référence aux chercheurs pour élucider efficacement les structures macromoléculaires à l’aide de la microscopie électronique cryogénique (cryo-EM).

Optimisation de la préparation des échantillons pour la microscopie électronique cryogénique

Ce protocole vidéo illustre comment effectuer une tomographie par microscopie électronique à transmission à balayage d’échantillons virologiques. Pour des résultats optimaux, les échantillons sont préparés par congélation à haute pression et substitution ultérieure de la congélation.

Tomographie par microscopie électronique à transmission à balayage en virologie : imagerie 3D d’échantillons congelés à haute pression et substitués par congélation

Nous décrivons un processus pour la fixation, l'incorporation, de sectionnement et de l'imagerie du stade...

Préparation d&#39;embryons pour la microscopie électronique des Drosophile Tube cardiaque embryonnaire

Découvrez une méthode innovante de préparation d'échantillons miniaturisés pour la microscopie électronique à transmission sans étape de buvardage papier. Cette technique réduit la perte d'échantillon et permet l'analyse de lysats de cellules uniques pour la protéomique visuelle.

Préparation de l’échantillon miniaturisé pour la microscopie électronique à Transmission

Explorer plus de vidéos