Préparation de l’échantillon miniaturisé pour la microscopie électronique à Transmission

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie de la structure, comme la préparation de protéines sensibles, lorsqu’une quantité limitée de protéines est disponible. Le principal avantage de cette technique est que, par rapport aux méthodes standard de préparation d’échantillons, seules des quantités infimes d’échantillon sont nécessaires et qu’aucune étape de transfert de papier dure n’est impliquée. Les implications de cette technique s’étendent à l’analyse de cellules uniques par protéomique visuelle, ou au diagnostic de maladies liées aux protéines.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons eu la technologie disponible pour résoudre des structures à haute résolution avec seulement environ 100 000 particules individuelles. Pour commencer, préparez l’échantillon comme décrit dans le protocole de texte ci-joint. Ensuite, assemblez la tasse d’éthane, le support de boîte cryogénique et l’araignée.

Et remplissez le récipient cryogénique à ras bord avec de l’azote liquide. Après quelques minutes, la tasse sera froide et exempte d’azote liquide. Ouvrez ensuite la bouteille de gaz éthane et laissez lentement le gaz s’écouler dans la coupelle d’éthane.

Laissez la tasse se remplir d’éthane liquide jusqu’à ce que le niveau soit de deux à trois millimètres sous le haut. Cela prendra quelques minutes et nécessitera environ cinq millilitres d’éthane liquide. Retirez l’araignée, placez le couvercle en polystyrol sur le dessus et placez le récipient cryogénique sur le support dans l’enregistreur cryogénique.

Saisissez la grille EM déchargée de lueur avec la pince à épiler de l’enregistreur cryogénique, nouez la pince à épiler sur l’électroaimant et vissez le micromanipulateur pour aligner la grille à plat sur la platine, côté film de carbone vers le haut. De retour dans le logiciel, double-cliquez sur grid_save. Ajustez ensuite la position du microcapillaire, de sorte que la pointe soit à environ 10 micromètres au-dessus de la surface de la grille.

Assurez-vous que le microcapillaire peut se déplacer librement sur la grille, sans le toucher nulle part. Et si nécessaire, prélever le microcapillaire de quelques micromètres. Ensuite, ramenez-le à la position au centre de la grille et enregistrez la nouvelle position en tant que grille.

Déplacez le microcapillaire vers la position d’origine. Ensuite, rincez le microcapillaire avec quelques dizaines de nanolitres de liquide du système et utilisez un tissu non pelucheux pour éliminer toutes les gouttes du microcapillaire. Maintenant que tout est prêt, lancez le script de macro.

Le macro se met d’abord en position et distribue cinq nanolitres de liquide du système pour éliminer les bulles d’air à l’extrémité, puis se déplace vers la position des échantillons. Ensuite, il aspire 65 nanolitres d’échantillon, puis réinjecte cinq nanolitres dans le tube d’échantillon. Cela tient compte du jeu du système et permet une écriture synchronisée.

Une fois qu’il s’est déplacé vers la position de la grille, il initie un modèle d’écriture, qui fera se déplacer le microcapillaire à travers la grille et distribuera simultanément 45 nanolitres d’échantillon. Ensuite, il ramène le microcapillaire au centre de la grille, l’abaisse de 10 micromètres supplémentaires et retire l’excès de liquide de l’échantillon. Enfin, le macro retire le microcapillaire et désactive l’électroaimant, ce qui déclenche le mécanisme de congélation en plongée.

Une fois libéré de l’aimant, relâchez soigneusement l’adaptateur magnétique du piston et transférez rapidement la grille de la tasse d’éthane dans le récipient cryogénique, contenant la boîte cryogénique, en plaçant la grille dans une fente libre. Pour commencer, préparez les cellules comme décrit dans le protocole de texte ci-joint, et montez la lame d’oxyde d’indium et d’étain sur l’insert du microscope. Utilisez deux vis pour fixer la glissière sur l’insert en aluminium et pour assurer le contact électrique entre le revêtement en oxyde d’indium et d’étain de la glissière et le cadre en aluminium mis à la terre électriquement.

Retirez ensuite le milieu de culture cellulaire du puits et lavez les cellules deux fois avec 300 microlitres de tampon d’électroporation. Après le dernier lavage, conservez les cellules dans le tampon d’électroporation. Ensuite, placez l’insert en aluminium qui maintient la lame d’oxyde d’indium et d’étain dans l’étage d’incubation de cellules vivantes, sur l’installation.

À l’aide du microscope, localisez la culture cellulaire et choisissez une zone sans cellules. Approchez-vous de l’embout microcapillaire sur la surface de la glissière et touchez-le doucement. Retirez ensuite la pointe à 100 micromètres et enregistrez la position sous forme de cellules.

Maintenant, quittez rapidement la culture cellulaire et rincez l’embout microcapillaire avec quelques dizaines de nanolitres de liquide du système, puis remettez-le dans la culture cellulaire. Versez quelques nanolitres pendant l’immersion dans le puits PDMS pour vous assurer qu’aucune bulle d’air n’est piégée à la pointe. Double-cliquez sur la position de la cellule et approchez-vous doucement de la surface de la lame d’oxyde d’indium et d’étain et, au contact, rétractez la pointe de 10 micromètres.

À ce stade, sélectionnez une cellule voisine pour la lyse. et placez l’extrémité du microcapillaire au-dessus de la cellule ciblée. Démarrez ensuite le script de macro pour la lyse de cellule unique.

Une fois lancé, le script demandera une position vers laquelle le microcapillaire doit être déplacé après qu’une cellule ait été lysée avec succès. Entrez la position souhaitée, par exemple la grille, pour la grille EM. La macro se déroulera ensuite sans intervention de l’utilisateur et commencera par déplacer la platine du microscope en culture cellulaire de 100 micromètres vers la gauche, où elle prendra un instantané de la cellule ciblée.

Ensuite, 15 nanolitres d’eau doublement distillée s’écoulent du tube microcapillaire, déplaçant et diluant le tampon à haute teneur en sel, appliquant une pression osmotique à la cellule. Ensuite, la platine recule pour positionner à nouveau la pointe au-dessus de la cellule ciblée. Là, une rafale de tension prédéfinie est appliquée, et après 500 millisecondes, le système de pompe commence à aspirer trois nanolitres d’échantillon à un débit de deux microlitres par minute.

Enfin, la platine se déplace à nouveau vers la gauche, ce qui permet d’inspecter la cellule. Une fenêtre s’affiche pour demander à l’utilisateur d’entrer sa candidature. Si la cellule a réussi, entrez oui pour prendre un instantané de la cellule lysée.

Ensuite, le microcapillaire se déplace vers l’emplacement de l’endo, immergé dans le liquide du réservoir. Laissez le microcapillaire immergé pendant huit à 12 minutes, selon la géométrie de la buse. Ensuite, distribuez cinq nanolitres de lysat cellulaire conditionné sur la grille.

Prélever le microcapillaire et laisser sécher lentement l’échantillon conditionné sur une étape de point de rosée. Enfin, retirez la grille de la scène et conservez-la à température ambiante dans une boîte à grille. Vous trouverez ci-dessous des images cryogéniques typiques d’échantillons congelés à l’aide de la configuration CryoWriter décrite.

Dans la vue d’ensemble de la grille, la périphérie de la glace vitreuse est clairement visible. En examinant de plus près une fente de grille avec le film de carbone troué contenant de la glace vitreuse, des trous blancs peuvent être trouvés, indiquant que tous les trous n’ont pas été remplis avec un tampon d’échantillon. Dans l’un des échantillons contenant des trous de carbone, la queue d’un bactériophage est clairement visible avec des détails.

En utilisant le CryoWriter mis en place pour effectuer la protéomique visuelle unicellulaire, on peut voir des choses telles que des protéines individuelles, par exemple de l’actine filamenteuse et des patchs membranaires avec des protéines attachées. L’image que vous pouvez voir dans le panneau 6b est colorée négativement avec une coloration négative de 2 %, basée sur un composé organotungstène. Le panneau c montre un lysat unicellulaire préparé pour la cryo-EM. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de préparer des grilles de coloration négative ou de cryo EM, à partir de volumes totaux de nanolitres d’échantillons de protéines ou d’extraits de cellules uniques.

N’oubliez pas que travailler avec de l’éthane et de l’azote liquides peut être extrêmement dangereux, et que des précautions, telles que le port de lunettes de sécurité et d’une blouse de laboratoire, doivent toujours être prises lors de cette procédure.