Détection de Inter-chromosomiques Aberrations Stable par Fluorescence Multiple In Situ Hybridation (mFISH) et Spectral caryotype (SKY) chez des souris irradiées

L’objectif global de cette méthode cytogénique moléculaire est d’observer les aberrations stables interchromosomiques dans les cellules de la moelle osseuse de souris exposées à une irradiation corporelle totale. Cette méthode peut aider à répondre à la question clé dans le domaine de la biologie des rayonnements, comme le risque d’induire des aberrations chromosomiques stables dans les cellules de la moelle osseuse de souris exposées à des radiations corporelles totales. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet une visualisation guidée des dommages génétiques stables induits par les radiations dans les cellules de la moelle osseuse de souris qui peuvent être propagés à travers de nombreuses générations cellulaires.

Après avoir isolé la moelle osseuse des os du fémur et du tibia de souris et fabriqué une suspension unicellulaire conformément au protocole textuel, superposez soigneusement la suspension cellulaire sur un volume égal de milieu de séparation de cellules mononucléées de moelle osseuse. Centrifugez le gradient à 400 fois G à température ambiante pendant 30 minutes. Ensuite, récupérez soigneusement la couche leucocytaire sans déranger les couches restantes et transférez la solution dans un nouveau tube à centrifuger de 15 millilitres.

Pour préparer des étalements cellulaires en métaphase, ajoutez 10 millilitres de PBS dans le tube contenant la couche leucocytaire. Ensuite, centrifugez le tube à 400 fois G à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, retirez soigneusement le surnageant et tapotez doucement le tube pour briser la pastille cellulaire.

Ajoutez ensuite 10 millilitres de PBS et centrifugez à nouveau la suspension. Retirez le surnageant sans perturber la pastille cellulaire. Cassez la pastille et ajoutez, goutte à goutte, quatre millilitres de solution hypotonique préchauffée de chlorure de potassium de 0,075 molaire en secouant doucement et constamment.

Incuber la suspension cellulaire à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes dans un bain-marie. Ensuite, ajoutez un volume égal de fixateur dans le tube et mélangez doucement en inversant le tube. Centrifugez le tube et retirez le surnageant.

Ensuite, cassez la pastille cellulaire et ajoutez-y un fixateur frais. Répétez l’essorage et l’ajout de fixateur cinq fois de plus. Après avoir remis les cellules en suspension dans 400 à 600 microlitres de fixateur, déposez 30 microlitres de cellules fixes sur des lames prénettoyées et humides inclinées à un angle de 45 degrés et laissez les lames sécher complètement à l’air libre pendant la nuit.

Pour réaliser la peinture des chromosomes de souris par mFISH, placez la lame contenant les cellules métaphasées étalées dans 2X SSC pendant deux minutes à température ambiante. Ensuite, déshydratez la lame par un lavage à l’éthanol en série à 70 %, 80 % et 100 % d’éthanol pendant deux minutes à chaque lavage. Préchauffer 40 millilitres de solution de dénaturation dans un bocal en verre à 70 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Transférez ensuite la lame dans la solution préchauffée et incubez l’échantillon pendant une à 1 minute et demie pour dénaturer les chromosomes. Utilisez immédiatement de l’éthanol glacé à 70 % pour tremper la lame pendant deux minutes afin d’arrêter le processus de dénaturation et d’empêcher les chromosomes dénaturés de se recuire. Ensuite, déshydratez la lame à l’aide d’une série d’éthanol commençant par 80 % d’éthanol pendant deux minutes.

Ensuite, placez la lame dans de l’éthanol à 100 % pendant deux minutes. Ensuite, séchez complètement la lame à température ambiante. Pour dénaturer la sonde, centrifugez brièvement le mélange de sonde fourni par le fabricant, puis transférez 10 microlitres dans un tube à centrifuger à bouchon pression de 500 microlitres et incubez le tube dans un bain-marie à 80 degrés Celsius pendant sept minutes.

Placez maintenant le tube contenant la sonde dénaturée dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Appliquez ensuite le mélange de sonde sur une lame avec des chromosomes dénaturés. Couvrez soigneusement la zone avec une lamelle en verre de 18 millimètres sur 18 millimètres et éliminez toutes les bulles d’air visibles en appuyant très doucement la lamelle sur la lame.

Utilisez de la colle de caoutchouc pour sceller les quatre côtés de la lamelle. Et incubez la lame dans l’obscurité dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures. Après l’hybridation, retirez soigneusement le ciment en caoutchouc et la lamelle et placez la lame dans un SSC 0,4X préchauffé à 74 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Transférez ensuite la diapositive dans la solution de lavage trois pendant deux minutes. Ajoutez 20 microlitres de support de montage anti-décoloration avec contre-coloration DAPI sur la lame et couvrez-la d’une lamelle en verre. Utilisez du papier de soie de laboratoire pour appuyer doucement sur la lamelle afin d’éliminer les bulles d’air et l’excès de solution de montage.

Utilisez ensuite du vernis à ongles pour sceller les bords de la lamelle. Visualisez les lames à l’aide d’un microscope fluorescent équipé des filtres appropriés. Pour le caryotype spectral des chromosomes de souris, après l’hybridation des sondes sur les chromosomes dénaturés et le lavage des échantillons conformément au protocole de texte, appliquez 80 microlitres de réactif de coloration SY5 sur la lame.

Placez une lamelle en plastique de 24 x 60 millimètres sur le dessus de l’échantillon et incubez-la dans l’obscurité dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes. Trempez la lame dans un bocal en verre contenant la solution de lavage préchauffée trois et incubez-la dans un bain-marie à 45 degrés Celsius en secouant pendant deux minutes. Répétez le lavage trois fois.

Appliquez 80 microlitres de réactif de coloration SY5.5 sur l’échantillon, couvrez-le d’une lamelle en plastique de 24 x 60 millimètres et incubez-le dans l’obscurité dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes. Utilisez une solution de lavage préchauffée pour laver la diapositive trois fois, puis maintenez la diapositive en position inclinée contre une serviette en papier pour évacuer l’excès de liquide. Ajoutez 20 microlitres de réactif DAPI anti-décoloration à l’échantillon et placez soigneusement une lamelle en verre sur le dessus sans introduire de bulles d’air.

Utilisez du vernis à ongles pour sceller les bords et observez l’échantillon avec un microscope à épifluorescence équipé pour capturer des images du ciel. Cette figure montre des propagations cellulaires représentatives en métaphase avec des paires de chromosomes de souris normales et aberrantes un, deux et trois. Il s’agit d’une aberration stable impliquant le chromosome un où une partie du chromosome un a été intégrée dans un chromosome DAPI non peint tandis qu’une autre partie a formé un fragment acentrique.

Dans cet exemple, une partie du chromosome deux a été intégrée dans un chromosome non peint. Cette aberration stable implique le chromosome trois. Des aberrations stables impliquant les trois chromosomes peints sont observées dans cette propagation en métaphase.

Voici un exemple de spectrocaryotype d’une souris femelle normale. Ce panneau représente une aberration stable impliquant les chromosomes quatre et 12. Enfin, l’aberration chromosomique stable dans ce panneau implique les chromosomes sept et 10.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée dans un délai de 48 à 72 heures si elle est bien faite. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que seules des cellules proliférantes doivent être utilisées. Le suivi de cette procédure et d’autres méthodes comme la bande peut être utilisé pour répondre à des questions supplémentaires telles que la présence d’aberrations stables interchromosomiques dans les cellules irradiées.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la cytogénétique moléculaire pour explorer l’association entre les aberrations génétiques et les différentes maladies. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une idée plus claire de la façon de déterminer les aberrations stables interchromosomiques. N’oubliez pas que travailler avec la colchicine peut être extrêmement dangereux car elle est cancérigène et que des précautions telles que le port de gants doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette expérience.