Détection de Inter-chromosomiques Aberrations Stable par Fluorescence Multiple

L'objectif général de cette méthode cytogénétique moléculaire est d'observer les aberrations stables interchromosomiques dans les cellules de la moelle osseuse de souris exposées à une irradiation corporelle totale. Cette méthode peut aider à répondre à une question clé dans le domaine de la biologie de la radiation, comme le risque d'induire des aberrations chromosomiques stables dans les cellules de la moelle osseuse de souris exposées à une irradiation corporelle totale. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet une visualisation ciblée des lésions génétiques stables induites par les radiations dans les cellules de la moelle osseuse de souris, lesquelles peuvent être transmises au cours de nombreuses générations cellulaires.

Après avoir isolé la moelle osseuse à partir des os fémoraux et tibiaux de souris et préparé une suspension monocellulaire selon le protocole décrit, déposez soigneusement la suspension cellulaire sur un volume égal de milieu de séparation des cellules mononucléées de la moelle osseuse. Effectuez une centrifugation en gradient à 400 fois G pendant 30 minutes à température ambiante. Ensuite, prélèvez délicatement la couche de globules blancs sans perturber les autres couches et transférez la solution dans un nouveau tube de centrifugation de 15 millilitres.

Pour préparer des lames de cellules en métaphase, ajouter 10 millilitres de PBS dans le tube contenant le buffy coat. Ensuite, centrifuger le tube à 400 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Puis, retirer soigneusement le surnageant et taper doucement sur le tube pour disperser le culot cellulaire.

Ensuite, ajoutez 10 millilitres de PBS et centrifugez à nouveau la suspension. Éliminez le surnageant sans perturber le culot cellulaire. Détachez le culot et ajoutez goutte à goutte quatre millilitres de solution hypotonique de chlorure de potassium à 0,075 mole par litre préalablement réchauffée, en agitant doucement et constamment.

Incuber la suspension cellulaire à 37 degrés Celsius pendant 20 minutes dans un bain-marie. Ensuite, ajouter un volume égal de fixateur dans le tube et mélanger délicatement en renversant le tube. Centrifuger le tube et éliminer le surnageant.

Ensuite, disloquer le culot cellulaire et ajouter du fixateur frais. Répéter l'étape de centrifugation et l'ajout de fixateur cinq fois supplémentaires. Après avoir resuspendu les cellules dans 400 à 600 microlitres de fixateur, déposer 30 microlitres de cellules fixées sur des lames préalablement nettoyées et humides, inclinées à un angle de 45 degrés, et laisser les lames sécher à l'air libre complètement toute la nuit.

Pour réaliser la coloration chromosomique chez la souris par FISH-m, placer la lame contenant les cellules en métaphase sur laquelle se trouvent des chromosomes étalés dans du SSC 2X pendant deux minutes à température ambiante. Ensuite, déshydrater la lame par une série de lavages à l'éthanol à 70 %, 80 % et 100 %, deux minutes pour chaque lavage. Préchauffer 40 millilitres de solution de dénaturation dans un bocal en verre type Coplin à 70 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Ensuite, transférez la lame dans la solution préchauffée et incubez l'échantillon pendant une à 1 1/2 minute afin de dénaturer les chromosomes. Utilisez immédiatement de l'éthanol glacé à 70 % pour arrêter la lame pendant deux minutes afin de bloquer le processus de dénaturation et d'empêcher les chromosomes dénaturés de se réassocier. Ensuite, déshydratez la lame à l'aide d'une série d'éthanol en commençant par de l'éthanol à 80 % pendant deux minutes.

Ensuite, placez la lame dans de l'éthanol à 100 % pendant deux minutes. Puis faites sécher complètement la lame à température ambiante. Pour dénaturer la sonde, centrifugez brièvement une courte durée le mélange de sonde fourni par le fabricant, puis transférez 10 microlitres dans un tube de centrifugeuse de 500 microlitres avec bouchon à visser et incubez le tube dans un bain-marie à 80 degrés Celsius pendant sept minutes.

Maintenant, placez le tube contenant la sonde dénaturée dans un bain-marie à 37 degrés Celsius pendant 10 minutes. Appliquez ensuite une goutte du mélange de sonde sur une lame contenant des chromosomes dénaturés. Recouvrez soigneusement la zone d'une lamelle en verre de 18 millimètres sur 18 millimètres et éliminez toute bulle d'air visible en appuyant très doucement sur la lamelle contre la lame.

Utiliser du ciment en caoutchouc pour sceller les quatre côtés du coverslip. Incuber la lame à l'obscurité dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius pendant 12 à 16 heures. Après l'hybridation, retirer soigneusement le ciment en caoutchouc et le coverslip, puis placer la lame dans du SSC 0,4X préchauffé à 74 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Transférez ensuite la lame dans la solution de lavage numéro trois pendant deux minutes. Ajoutez 20 microlitres de milieu de montage antifade avec une contre-coloration par le DAPI sur la lame et recouvrez-la d'une lamelle en verre. Utilisez du papier essuie-tout de laboratoire pour appuyer doucement sur la lamelle afin d'éliminer les bulles d'air et l'excès de milieu de montage.

Ensuite, utiliser du vernis à ongles pour sceller les bords de la lame. Observer les préparations au microscope fluorescent équipé des filtres appropriés. Pour le caryotypage spectral des chromosomes de souris, après hybridation des sondes sur les chromosomes dénaturés et lavage des échantillons conformément au protocole décrit, appliquer 80 microlitres du réactif de coloration SY5 sur la lame.

Placer une lame de plastique de 24 par 60 millimètres sur l'échantillon, puis l'incuber à l'obscurité dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes. Plonger la lame dans un bocal en verre Coplin contenant une solution de lavage préchauffée pendant trois minutes et l'incuber dans un bain-marie à 45 degrés Celsius avec agitation pendant deux minutes. Répéter le lavage trois fois.

Appliquer 80 microlitres du réactif de marquage SY5.5 sur l'échantillon, le recouvrir d'une lame de couverture en plastique de 24 par 60 millimètres et l'incuber à l'abri de la lumière dans une chambre humidifiée à 37 degrés Celsius pendant 40 minutes. Utiliser la solution de lavage préalablement réchauffée trois pour laver la lame trois fois, puis maintenir la lame en position inclinée contre une serviette en papier pour éliminer le liquide excédentaire. Ajouter 20 microlitres du réactif antifade DAPI sur l'échantillon et poser délicatement une lame de couverture en verre par-dessus sans introduire de bulles d'air.

Utilisez du vernis à ongles pour sceller les bords et observez l'échantillon au microscope à épifluorescence équipé pour capturer des images du ciel. Cette figure montre des étalements représentatifs de cellules en métaphase avec des paires de chromosomes murins normaux et anormaux, numéros un, deux et trois. Voici une aberration stable impliquant le chromosome un, où une partie du chromosome un a été intégrée dans un chromosome DAPI non coloré tandis qu'une autre partie a formé un fragment acentrique.

Dans cet exemple, une partie du chromosome deux a été intégrée dans un chromosome non coloré. Cette anomalie stable implique le chromosome trois. Des anomalies stables impliquant les trois chromosomes colorés sont observées sur cette préparation en métaphase.

Illustré ici est un exemple de caryotypage spectral d'une souris femelle normale. Ce panneau représente une aberration stable impliquant les chromosomes quatre et 12. Enfin, l'aberration chromosomique stable dans ce panneau concerne les chromosomes sept et 10.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 48 à 72 heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler que seules les cellules en prolifération doivent être utilisées. En suivant cette procédure ainsi que d'autres méthodes comme in band, on peut répondre à des questions supplémentaires, telles que la présence d'aberrations stables interchromosomiques dans les cellules irradiées.

Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la cytogénétique moléculaire pour explorer l'association entre les anomalies génétiques et diverses maladies. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une idée plus claire de la manière de déterminer les aberrations stables interchromosomiques. N'oubliez pas que le travail avec la colchicine peut être extrêmement dangereux car elle est cancérigène, et que des précautions telles que le port de gants doivent toujours être prises lors de la réalisation de cette expérience.