Une méthode efficace pour l’induction de cellules dirigées de type hépatocytes à partir de cellules souches embryonnaires humaines

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) en cellules fonctionnelles de type hépatocytes (CHN) en complétant continuellement l’activine A et le CHIR99021 pendant la différenciation du CSEh en endoderme définitif (DE).

Les cellules de type hépatocytes dérivées de cellules souches embryonnaires humaines sont utiles dans la modélisation des maladies et le dépistage des médicaments. Il s’agit d’une méthode efficace et reproductible pour induire efficacement la différenciation des cellules souches embryonnaires humaines en cellules fonctionnelles ressemblant à des hépatocytes. Un statut indifférencié et une confluence appropriée de cellules souches embryonnaires humaines sont essentiels pour une différenciation réussie aux cellules de type hépatocytes.

Pour l’entretien des cellules souches, enrobez les plaques stériles traitées par culture de tissus à six puits d’un millilitre de Matrigel qualifié en cellules souches embryonnaires humaines 1X par puits, et stockez-les à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Laisser les plaques à température ambiante pendant 30 minutes avant utilisation. Décongeler les HESE cryo-conservés dans un bain d’eau de 37 degrés Celsius pendant trois minutes sans secouer, puis transférer immédiatement les cellules souches en les canalisant dans un tube à centrifuger de 15 millilitres contenant quatre millilitres de milieu mTESR préchauffé de 37 degrés Celsius.

Centrifuger les HESE et aspirer le surnageant, puis suspendre doucement les cellules dans un millilitre de milieu mTESR. Aspirer le milieu DMEM F-12 de la plaque. Ensemencer les cellules dans une plaque de six puits à une densité de 1 x 10 aux 5ème cellules dans deux millilitres de mTESR, et incuber dans un incubateur de dioxyde de carbone à 5%.

Entretenir les cellules en remplaçant quotidiennement le milieu par un milieu mTESR préchauffé. Faites passer les cellules à environ 70 à 80% de confluence, ou lorsque les colonies cellulaires commencent à entrer en contact. Pour les cellules qui passent, aspirer le milieu et incuber les cellules avec un millilitre par puits de solution enzymatique pendant cinq minutes à 37 degrés Celsius.

Transférer les cellules en les pipetant dans un tube de centrifugation de 15 millilitres contenant quatre millilitres de DMEM F-12 préchauffés à 37 degrés Celsius. Préparez des plaques de 24 puits en les recouvrant de 250 microlitres de milieu Matrigel qualifié 1X hESC. Ensemencement de cseh à une densité de 1 à 1,5 fois 10 à 5ème cellules par puits dans 500 microlitres de milieu mTESR.

Ajouter à la fois l’activine A à une concentration finale de 100 nanogrammes par millilitre et CHIR99021 à une concentration finale de trois micromolaires dans un volume approprié de milieu de base de différenciation préchauffé de stade un. Après trois jours de différenciation, les cellules différenciées devraient exprimer des marqueurs des cellules endodermiques définitives, telles que FOXA2, SOX17, GATA4, CXCR4 et FOXA1. Le troisième jour de différenciation, aspirez le milieu, remplacez-le par le milieu de stade deux et incuber pendant 24 heures.

Changez le support tous les deux jours les quatre à huit jours. Après huit jours de différenciation, les cellules différenciées doivent exprimer des marqueurs appropriés des cellules progénitrices hépatiques, telles que HNF4 alpha, AFP, TBX3, TTR, ALB, NTCP, CEBPA. Le huitième jour, aspirez le milieu de stade deux des cellules et remplacez-le par un milieu de stade trois.

Laissez les cellules incuber pendant 10 jours à 37 degrés Celsius dans un incubateur de dioxyde de carbone et changez le milieu tous les deux jours avec des facteurs de différenciation fraîchement ajoutés. Après 18 jours de différenciation, les cellules différenciées doivent exprimer des marqueurs caractéristiques des hépatocytes, tels que AAT, ALB, TTR, HNF4 alpha, NTCP, ASGR1, CYP3A4. Le diagramme schématique des cellules de type hépatocytes des CSEh et des images de champ lumineux de chaque étape de différenciation sont montrés.

Au premier stade, l’activine A et le CHIR99021 ont été ajoutés pendant trois jours pour inciter les cellules souches à former des cellules endodermiques. Au stade deux, les cellules endodermiques se sont différenciées en cellules progénitrices hépatiques après avoir été traitées avec un milieu de différenciation pendant cinq jours. À l’étape trois, après 10 jours, les hepatocytes tôt avaient mûri et différencié en hépatocytes-comme des cellules dans le facteur de croissance d’hépatocytes et l’oncostatine.

À la dernière étape de la différentiation, les cellules ont montré un phénotype typique de hepatocyte. RT-PCR, souillure d’immunofluorescence, et éponger occidental ont été utilisés pour détecter des marqueurs des cellules endodermiques, des cellules hépatiques de précurseur, et des hepatocytes mûrs. Les cellules différenciées ont montré des niveaux élevés d’expression des gènes et des protéines liés à la différenciation à chaque étape, tels que les marqueurs endodermiques SOX17 au troisième jour, le marqueur HNF4 alpha de précurseur hépatique au jour huit, l’AFP au jour 14, et le marqueur mature d’hépatocytes ALB au jour 18.

Le HLCs a montré la souillure verte et la souillure étendue de décalage d’acide cytoplasmique. Les hepatocytes ont montré la morphologie bi-nucléée typique. L’activité enzymatique de CYP3A4, cyp métabolique essentiel dans le foie dans HLCs, a été confirmée avec une analyse d’enzymes.

L’implantation des cellules souches embryonnaires humaines à une densité appropriée et le début de la différenciation à la date suivante sont essentiels. Dans la première étape, touchez doucement le support car les cellules sont sujettes à flotter vers le haut. La combinaison de l’activine A et d’autres petites molécules peut encore améliorer les efficacités de différenciation, et produire des cellules hepatocyte-comme plus mûres dans ce procédé.

Cette technique peut fournir une plate-forme pour explorer la transplantation d’hépatocytes, l’ingénierie des tissus hépatiques, les foies bioartificiels et la modélisation des maladies.