Génération rapide et efficace des Recombinant pluripotentes humaines cellules souches par recombinase médiée Cassette Exchange dans le

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une édition ciblée rapide et efficace du génome dans le locus AAVS1 de cellules souches pluripotentes humaines, ou PSC humaines, en utilisant une approche d'échange de cassette médiée par une flippase et une recombinase, ou RMCE. Le RMCE améliore l'insertion ciblée d'une séquence dans le locus AAVS1, ce qui revêt une grande importance en biologie des cellules souches, car il permet de tester rapidement la fonction d'une molécule par surexpression ou inhibition. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de créer en seulement 15 jours des lignées de PSC humaines exemptes d'événements d'intégration aléatoire, toujours pluripotentes et possédant un caryotype normal.

Cette méthode fournit un outil utile pour la transgénèse au niveau du locus AAVS1, mais peut également être appliquée à d'autres locus humains perméables. Pour commencer, cultivez des lignées cellulaires souches humaines maîtresses selon les procédures standard, en présence ou en absence de fibroblastes embryonnaires de souris inactivés ou iMEFs, dans des plaques à six puits. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 60 % à 70 %, ensemencez les iMEFs résistants aux antibiotiques en utilisant d'abord une solution de gélatine à 0,1 % pour recouvrir les puits nécessaires d'une plaque à 12 puits, puis incubez la plaque à température ambiante pendant cinq minutes.

Ensuite, répartir 125 000 iDR4 par puits et incuber les cultures toute la nuit dans du milieu iMEF. Le jour suivant, préincuber les cultures de PSC humaines avec du milieu frais contenant 10 micromolaire d'inhibiteur de la ROCK à 37 degrés Celsius pendant une heure. Pendant ce temps, porter la solution de transfection pour ESC humaines et l'agent de dissociation cellulaire à température ambiante.

Préparez un millilitre de milieu de mise en culture pour la nucléofection par condition de nucléofection. Ensuite, retirez le milieu iDR4 des puits, lavez les cellules avec un millilitre de PBS à température ambiante et ajoutez le milieu de mise en culture pour la nucléofection. Transférez 500 microlitres par échantillon de milieu de culture dans des tubes stériles de 1,5 millilitre et conservez-les à 37 degrés Celsius jusqu'à la mise en culture.

Pour détacher les CSP humaines en suspension simple de cellules, retirez le milieu, utilisez du PBS à température ambiante pour laver les cellules et ajoutez un millilitre de trypsine 0,05 % ou d'Accutase sur des cultures de CSPh avec ou sans cellules nourricières, respectivement. Incubez les cultures à 37 degrés Celsius. Ensuite, retirez délicatement la plaque de l'incubateur et, sans laisser les cellules se détacher, aspirez l'agent de dissociation et ajoutez 1 millilitre de milieu pour CSP humaines.

Dissocier les cellules lâches en rinçant doucement le milieu sur la surface de la plaque, tout en évitant la formation d'écume. Récolter les cellules sous forme de suspension monocellulaire dans un tube stérile et propre de 15 ou 50 millilitres. Ensuite, utiliser 1 millilitre de milieu hESC pour laver les cellules et les récolter dans le même tube.

Prélevez un aliquot de 50 microlitres de la suspension cellulaire pour le comptage et centrifugez les cellules restantes à 300 × g pendant cinq minutes à température ambiante. Comptez les cellules à l’aide d’un dispositif de comptage cellulaire pendant que la suspension est en cours de centrifugation. Éliminez le surnageant et utilisez du PBS à température ambiante pour resuspendre doucement le culot cellulaire à une concentration de 10⁶ cellules par millilitre.

Transférez ensuite deux millilitres par condition expérimentale dans des tubes stériles propres de 15 millilitres et répétez la centrifugation. Pendant que les échantillons tournent, préparez des mélanges de plasmides dans trois tubes propres de 1,5 millilitre avec des rapports moléculaires de donneur flippase de 0:1, 2:1 et 2:0 en utilisant 2,5 microgrammes de plasmide flippase. Pour poursuivre la nucléofection, retirez la plaque iDR4 et le tube de 1,5 millilitre contenant le milieu de culture de l’incubateur.

Un tube à la fois, sans perturber le culot, aspirez soigneusement le PBS en éliminant autant que possible le tampon. Utilisez 100 microlitres de solution de transfection pour resuspendre le culot en pipetant délicatement. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans le tube de 1,5 millilitre contenant les mélanges de plasmides et mélangez doucement.

Transférez le mélange d'ADN cellulaire dans la cuvette de transfection, en prenant soin de ne pas introduire de bulles. Insérez la cuvette dans l'appareil de nucléofection et lancez le programme A13 pour les cellules cultivées sur des cellules nourricières ou le programme F16 pour la transfection sans cellules nourricières. Retirez la cuvette et utilisez les pipettes jetables fournies dans le kit pour ajouter délicatement, mais rapidement et d'un seul mouvement, 0,5 millilitre de milieu de mise en culture dans la cuvette.

Ensuite, récupérez le volume de la même manière et déposez-le goutte à goutte dans la plaque 12 puits contenant les iDR4 et le milieu de culture. Placez la boîte de culture sur une étagère de l’incubateur et déplacez-la lentement d’avant en arrière et de côté à côté afin de répartir uniformément la suspension cellulaire. Incubez la boîte pendant 24 heures avant de changer le milieu.

Deux à trois jours après la transfection, commencer la sélection. Aspirer le milieu, laver les cellules avec 1 millilitre de PBS, puis ajouter du milieu pour cellules souches embryonnaires humaines contenant 100 nanogrammes par millilitre de puromycine. Observer la croissance cellulaire et augmenter la concentration de puromycine en conséquence, jusqu'à un maximum de 250 nanogrammes par millilitre, en poursuivant la sélection par la puromycine pendant sept jours.

Après trois à quatre jours de sélection à la puromycine, commencer la sélection avec 0,5 micromolaire de fialuridine ou FIAU. Changer le milieu quotidiennement et maintenir le FIAU pendant un maximum de sept jours consécutifs. Après la fin de la sélection, vers les jours 14 à 15, des colonies RMCE résistantes seront présentes et constitueront la nouvelle lignée RMCE.

Diviser les cellules selon un rapport de 1:2 en suivant les procédures standard. Lorsque les puits du point clé 1 sont prêts à être divisés, dissocier le puits destiné à la caractérisation en une suspension monocellulaire comme décrit précédemment dans la vidéo et recueillir les cellules dans un tube de 15 millilitres. Centrifuger les cellules à 300 ×g à température ambiante pendant cinq minutes.

Ensuite, utilisez un millilitre de PBS pour resuspendre les cellules et diviser l'échantillon en deux. L'un est filtré à l'aide d'un tamis cellulaire pour réaliser la cytométrie en flux et l'autre pour l'analyse de l'ADN selon le protocole décrit dans le texte. Après transfection avec la recombinase flippase et le donneur RMCE tdT, les hPSC ont formé de petits groupes de cellules uniformément répartis sur la couche de MEF iDR4 et exprimé de manière constitutive la GFP ainsi que le tdT de façon transitoire.

La sélection positive à la puromycine favorise l’insertion du donneur RMCE, puis la sélection négative à l’FIAU sélectionne uniquement les événements de recombinaison médiés par FRT et dépourvus de TK. Vers le sixième jour après la transfection, de petits groupes de cellules RMCE négatives pour la GFP et positives pour la tdT peuvent être identifiés. Comme illustré ici, les colonies RMCE négatives pour la GFP et positives pour la tdT sont présentes uniquement lorsque le donneur RMCE et la flippase sont utilisés simultanément, tandis que le RMCE n’a pas lieu en l’absence de flippase. La caractérisation par cytométrie en flux des nouvelles lignées RMCE, constituées des colonies résistantes à la puromycine et à l’FIAU, combinées en une population cellulaire non clonale, confirme que 100 % des cellules présentent le phénotype RMCE négatif pour la GFP et positif pour la tdT.

Lorsque des donneurs RMCE sans activité de registreur dans les hPSC sont utilisés, 100 % des cellules sont négatives pour la GFP. La caractérisation par PCR présentée ici de la lignée RMCE non clonale démontre l'échange complet du cassette et que le programme de sélection utilisé produit des lignées exemptes d'intégration aléatoire, tant du donneur RMCE que du vecteur exprimant la flippase. En résumé, cette méthode RMCE simplifie considérablement l'édition génique dans les hPSC pour un locus défini, par rapport aux nucléases ciblées.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 15 jours. Par conséquent, l'ERM est un outil d'édition génique très rapide qui permettra des études comparatives dans un contexte isogénique. Lors de l'utilisation de cette procédure, il est important d'obtenir des efficacités de transfection supérieures à 30 % et de réaliser une sélection appropriée avec l'agent de sélection du noyau.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une RMCE au niveau du locus AAVS1 des CSP humaines et comment caractériser la lignée recombinante.