Génération rapide et efficace des Recombinant pluripotentes humaines cellules souches par recombinase médiée Cassette Exchange dans le AAVS1 Locus

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer une édition génomique ciblée rapide et efficace dans l’AAVS1 des cellules souches pluripotentes humaines, ou PSC humaines, en utilisant une approche d’échange de cassettes médiée par la flippase, ou RMCE. RMCE améliore l’insertion cible d’une séquence dans le locus AAVS1, ce qui est d’une grande importance pour la biologie des cellules souches car il permet de tester rapidement la fonction d’une molécule par surexpression ou knockdown. Le principal avantage de cette technique est que des lignées PSC humaines exemptes d’événements d’intégration aléatoires, toujours pluripotentes et lorsque des caryotypes normaux peuvent être créés en seulement 15 jours.

Cette méthode fournit un outil utile pour la transgenèse, dans le locus AAVS1, mais peut également être appliquée à d’autres locus permissifs humains. Pour commencer, cultivez des lignées cellulaires maîtresses PSC humaines selon des procédures standard sur ou à partir de fybroblastes embryonnaires de souris inactivés ou iMEF, dans des plaques à six puits. Lorsque les cellules atteignent 60 % à 70 % de confluence, les iMEF résistants aux médicaments sont utilisés en utilisant d’abord une solution de gélatine à 0,1 % pour enrober les puits nécessaires d’une plaque à 12 puits et incuber la plaque à température ambiante pendant cinq minutes.

Ensuite, plaquez 125 000 iDR4 par puits et incubez les cultures pendant la nuit avec un milieu iMEF. Le lendemain, préincubez des cultures humaines de CSP avec un milieu frais comprenant 10 inhibiteurs micromolaires de ROCK à 37 degrés Celsius pendant une heure. Pendant ce temps, apportez la solution de transfection ESC humaine et l’agent de dissociation cellulaire à température ambiante.

Préparez un millilitre de milieu de placage de nucléofection par condition de nucléofection. Ensuite, retirez le milieu iDR4 des puits, utilisez un millilitre de PBS à température ambiante pour laver les cellules et ajoutez un milieu de placage de nucléoformation. Transférez 500 microlitres par échantillon de milieu de placage dans des tubes stériles de 1,5 millilitre et conservez-les à 37 degrés Celsius jusqu’au placage.

Pour détacher les CSP humaines dans une suspension unicellulaire, retirez le milieu, utilisez du PBS à température ambiante pour laver les cellules et ajoutez un millilitre de 0,05 % de trypsine ou d’accutase sur des cultures de CSPh nourricières ou exemptes de nourricière, respectivement. Incuber les cultures à 37 degrés Celsius. Ensuite, retirez soigneusement la plaque de l’incubateur et, sans laisser les cellules se détacher, aspirez l’agent de dissociation et ajoutez 1 millilitre de milieu PSC humain.

Dissociez les cellules lâches en rinçant doucement le fluide à la surface de la plaque tout en évitant la formation de mousse. Recueillez les cellules dans une suspension cellulaire unique dans un tube propre et stérile de 15 ou 50 millilitres. Utilisez ensuite 1 millilitre de milieu hESC pour laver les cellules et les recueillir dans le même tube.

Prenez une aliquote de 50 microlitres de suspension cellulaire pour le comptage et centrifugez les cellules restantes à 300 fois g à température ambiante pendant cinq minutes. Comptez les cellules à l’aide d’un dispositif de comptage de cellules pendant que la suspension est en cours de centrifugation. Retirez le surnageant et utilisez du PBS à température ambiante pour remettre doucement la couleur de la cellule en suspension à 10 à six cellules par millilitre.

Transférez ensuite deux millilitres par condition expérimentale pour nettoyer des tubes stériles de 15 millilitres et répétez la centrifugation. Pendant que les échantillons tournent, préparez des mélanges de plasmides dans trois tubes propres de 1,5 millilitre avec des rapports moléculaires de flippase de donneur de 0:1, 2:1 et 2:0 en utilisant 2,5 microgrammes de plasmide de flippase. Pour procéder à la nucléofection, retirez la plaque iDR4 et le tube de 1,5 millilitre avec le milieu de placage de l’incubateur.

Un tube à la fois, sans déranger la pastille, pipetez soigneusement le PBS, en retirant autant de tampon que possible. Utilisez 100 microlitres de solution de transfection pour remettre le granulé en suspension en le pipetant doucement. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans le tube de 1,5 millilitre contenant les mélanges plasmidiques et mélangez délicatement.

Transférez le mélange d’ADN cellulaire dans la cuvette du transfecteur, en faisant attention à ne pas introduire de bulles. Insérez la cuvette dans le dispositif nucléofecteur et exécutez le programme A13 pour les cellules cultivées sur des mangeoires ou F16 pour une transfection sans mangeoire. Retirez la cuvette et utilisez les pipettes de transfert jetables du kit pour ajouter 0,5 millilitre de produit de placage dans la cuvette doucement, mais rapidement et en un seul mouvement.

Ensuite, récupérez le volume de la même manière et plaquez-le goutte à goutte dans la plaque à 12 puits contenant l’iDR4 et le milieu de placage. Placez la boîte de culture sur une étagère dans l’incubateur et déplacez-la lentement d’avant en arrière et d’un côté à l’autre pour répartir uniformément la suspension cellulaire. Incuber le plat pendant 24 heures avant de changer de milieu.

Deux à trois jours après la transfection, sélection de départ. Aspirez le milieu, utilisez 1 millilitre de PBS pour laver les cellules, puis ajoutez un milieu ESC humain avec 100 nanogrammes par millilitre de puromycine. Observez la croissance cellulaire et augmentez la concentration de puromycine en conséquence jusqu’à un maximum de 250 nanogrammes par millilitre, en continuant la sélection de la puromycine pendant sept jours.

Après trois à quatre jours de sélection de puromycine, commencer la sélection avec 0,5 micromolaire de fialuridine ou FIAU. Changez de support tous les jours et maintenez le FIAU pendant sept jours consécutifs au maximum. Une fois la sélection terminée, vers les jours 14 à 15, des colonies RMCE résistantes seront présentes et constitueront la nouvelle lignée RMCE.

Divisez les cellules selon un rapport de 1:2 en suivant les procédures standard. Lorsque les puits de la clé 1 sont prêts à se diviser, dissociez le puits pour la caractérisation en une suspension à cellule unique, comme décrit plus haut dans la vidéo, et collectez les cellules dans un tube de 15 millilitres. Faites tourner les cellules à 300 fois g à température ambiante pendant cinq minutes.

Ensuite, utilisez un millilitre de PBS pour remettre les cellules en suspension et divisez l’échantillon en deux. L’un filtré à l’aide d’une passoire cellulaire pour effectuer la cytométrie en flux et l’autre pour l’analyse de l’ADN selon le protocole texte. Après la transfection avec la flippase recombinase et le donneur tdT RMCE, les hPSC ont formé de petits groupes de cellules uniformément répartis sur la couche MEF iDR4 et ont exprimé la GFP constitutive et la tdT transitoire.

La sélection positive à l’aide de la puromycine favorise l’insertion du donneur RMCE, puis la sélection négative à l’aide de FIAU sélectionne uniquement pour les événements de recombinaison médiés par la FRT dépourvus de TK. Vers le sixième jour post-transfection, de petits groupes de cellules RMCE GFP négatives et tdT positives peuvent être identifiés. Comme démontré ici, les colonies RMCE GFP négatives et tdT positives ne sont présentes que lorsque le donneur RMCE et la flippase sont utilisés, tandis que la RMCE ne se produit pas en l’absence de flippase. La caractérisation par cytométrie en flux des lignées RMCE nouvellement générées, qui sont les colonies RMCE résistantes à la puromycine et au FIAU, combinées dans une population cellulaire non clonale, confirme que 100 % des cellules représentent le phénotype RMCE GFP-négatif, tdT-positif.

Lorsque des donneurs RMCE sans activité d’enregistrement dans les hPSC sont utilisés, 100 % des cellules sont GFP négatives. La caractérisation par PCR montrée ici de la lignée RMCE non clonale, démontre l’échange complet de cassettes et que le programme de sélection utilisé génère des lignées aléatoires sans intégration, à la fois du donneur RMCE et du vecteur exprimant la flippase. En résumé, cette méthode RMCE simplifie considérablement l’édition génomique dans les hPSC pour un locus défini par rapport aux nucléases ciblées.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 15 jours. Par conséquent, RMCE est un outil d’édition de gènes très rapide qui permettra des études comparatives dans un cadre isogénique. Lors de l’utilisation de cette procédure, il est important d’avoir des efficacités de transfection supérieures à 30 % et de disposer d’un agent de sélection de stockage de noyau approprié.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’effectuer la RMCE dans le locus AAVS1 des CSP humaines et de la façon de caractériser la ligne de recombinaison.