Name: Génération rapide et efficace des Recombinant pluripotentes humaines cellules souches par recombinase médiée Cassette Exchange dans le AAVS1 Locus (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-11-20T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Découvrez l'édition génique rapide par échange de cassette médiée par recombinase (RMCE) dans le locus AAVS1 de cellules souches pluripotentes humaines. Cette méthode génère des lignées isogéniques sans intégration aléatoire en seulement 15 jours.

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L.O. a été financé par IWT/OZM/090838, IACS BPAMER3/08/04 et le gouvernement d’Aragon FMI048/08 ; bourse RB par IWT SB-121396 ; M.P. par FWO 1288714N ; et R.S. par la Fondation néerlandaise du diabète. N.H., J.V., K.C. et Q.C. ont été soutenus par les bourses IWT SB-121396, SB-101230, SB-91228 et SB-093228, respectivement. Le financement de C.M.V. a été assuré par FWO G.0667.07, G.0975.11 et KU Leuven (EIW-B4855-EF/05/11, ETH-C1900-PF, EME-C2161-GOA/11/012), IWT-HEPSTEM, BELSPO-IUAP-DEVREPAIR, FP7-HEMIBIO (266777).

1. Préparation du contenant FRT-HPSC Master Cell ligne pour Transfection <ol><li> Culture CSEh / iPSC lignées cellulaires maître selon des procédures standard sur ou hors inactivés fibroblastes embryonnaires de souris (Imef) en utilisant CSEh ou moyenne iPSC sans alimentation, respectivement (tableau 1). Préparer 2 (sur les départs) ou 1 puits (sans alimentation)-de hPSCs dans une plaque de 6 puits pour chaque condition expérimentale. </li><li> Observer les cultures, et lorsque les cellules atteignent 60-70% de confluence, plaque résistante aux médicaments Imef (iDR4). En bref, revêtir les puits nécessaires d&#39;une plaque de 12 puits avec 0,5 ml d&#39;une solution de gélatine à 0,1% et incuber pendant 5 minutes à température ambiante. Plate 125.000 iDR4s par puits et incuber O / N avec un milieu Imef (tableau 1). </li></ol> 2. HPSC Transfection par Nucléofection <ol><li> Le lendemain, pré-incubation CSEh / cultures iPSC avec des milieux frais, y compris 10 uM de la protéine kinase Rho-associé (ROCK) inhibiteur (Y-27632), pendant 1 h à 37 ° C. Nposte, prendre la solution de transfection CSEh du réfrigérateur pour préchauffer à température ambiante. </li><li> Préparer 1 ml de milieu de nucléofection placage (tableau 1) par condition de nucléofection. Prenez moyen Imef hors puits, laver avec 1 ml de la température ambiante du PBS, et ajouter 500 pi de nucléofection placage moyen. Transférer les 500 autres uL dans des tubes stériles de 1,5 mL et de les stocker à 37 ° C jusqu&#39;à ce que le placage. NOTE: Une expérience de CREM typique contient trois conditions différentes avec des rapports moléculaires de CREM donneur: vecteurs pFLPe de 2: 0, 2: 1 et 0: 1. </li><li> Détachez CSEh / iPSC dans une suspension cellulaire unique. <ol><li> Enlever les médias, le laver avec 2 ml de PBS RT, et ajouter 1 ml de trypsine 0,05% ou Accutase sur nourricières ou sans alimentation-cultures HPSC, respectivement. Incuber 7 (trypsine) ou et 2-5 (Accutase) min à 37 ° C. Pour le traitement Accutase - cellules doivent rester lâche, mais attaché. </li><li> Retirez délicatement la plaque de l&#39;incubateur et sansllowing les cellules pour détacher, enlever l&#39;agent de dissociation par aspiration. Ajouter 1 ml de CSEh médias et dissocier les cellules lâches en rinçant doucement les médias sur la surface de la plaque, ce qui évite le moussage. Assurez-vous que les cellules sont dans une suspension cellulaire unique. </li><li> Recueillir les cellules dans un 15 ou 50 ml tube propre et stérile. Laver les puits avec 1 ml de médias CSEh et recueillir les cellules dans le même 15 ou 50 ml tube. Prélever une partie aliquote de 50 pi de comptage (au cours de l&#39;étape suivante) à l&#39;aide d&#39;un dispositif de comptage de cellules. Notez le volume de collecte et de calculer le nombre total de cellules. Isoler les cellules à 300 xg pendant 5 min à température ambiante. </li></ol></li><li> Remettre en suspension le culot de cellules à une suspension de 10 6 cellules / ml avec du PBS en utilisant une pipette sérologique de 5 ml et pipetage doux. Éviter de faire mousser. Transfert 2 mL par condition expérimentale (environ 2 x 10 6 cellules) à nettoyer, des tubes stériles de 15 ml. </li><li> Alors que la centrifugation, prépare CREM plasmides pFLPe mélanges par des donateurs dans un volume maximum de 10 pi. <ol><li> Transfert 2,5 pg de pFLPe (6,5 Kb) à un environnement propre, stérile tube de 1,5 ml. Ajouter un rapport de 2: 1 moléculaire du vecteur CREM donneur 13 au vecteur pFLPe. Par exemple, environ 10 ug d&#39;un vecteur donneur Kb CREM 12. </li></ol></li><li> Procéder à nucléofection, en évitant la formation de mousse dans toutes les étapes. NOTE: Certains protocoles de transfection HPSC appliquent une étape d&#39;épuisement Imef supplémentaire avant l&#39;étape 2.4. Cependant, dans la pratique, Imef est une fraction mineure de cellules dans la suspension unique qui ne modifie pas de manière significative l&#39;efficacité de transfection, ni ne crée des cellules recombinantes qui contaminent car ils sont non proliférative. En outre, il est essentiel de procéder rapidement au cours du processus de transfection pour augmenter la viabilité. Pour ces raisons, l&#39;épuisement Imef est pas appliquée. <ol><li> Retirer la plaque iDR4 et les tubes de 1,5 ml avec le milieu de placagede l&#39;incubateur. Un tube à la fois, pipeter au large de la PBS avec soin sans perturber le culot cellulaire. Enlever autant que possible. Remettre en suspension le culot avec 100 ul de solution de transfection par pipetage. Transférer la suspension cellulaire au tube de 1,5 ml contenant les mélanges de plasmides et mélanger doucement. </li><li> Transférer le mélange cellule-ADN à la cuvette de transfector, en accordant une attention à ne pas introduire des bulles. Introduire la cuvette dans le dispositif de Nucleofector et appliquer le programme A13 (cellules cultivées sur les départs) ou F16 (chargeur-libre). NOTE: Les appareils autres méthodes de transfection ou Nucleofector peuvent nécessiter l&#39;optimisation de ces programmes ou les conditions de transfection. </li><li> Reprendre la cuvette et, en utilisant les pipettes de transfert jetables disponibles dans le kit de nucléofection, de recueillir son contenu par l&#39;application de 0,5 ml du milieu de placage et aspirer tout le volume. Effectuer cette étape rapidement, mais en douceur et en un seul mouvement. </li><li> Plate goutte à goutte dans le 12-wplaque ell contenant le iDR4 et 500 pi de milieu d&#39;étalement. Répétez les étapes 2.6.1 - 2.6.4 pour la prochaine condition expérimentale. </li></ol></li><li> Placez la boîte de culture sur une étagère dans l&#39;incubateur et le déplacer lentement en arrière et côté à l&#39;autre pour répartir uniformément la suspension cellulaire. Incuber pendant 24 h avant le prochain changement de support pour permettre aux cellules de récupérer en présence d&#39;un inhibiteur de ROCK uM 10 (Y-27632). </li></ol> 3. Sélection positive et négative de cellules Subissant CREM <ol><li> médias Changement de culture quotidienne (1 ml / puits), et 2 - 3 d post-transfection, commencent sélection avec 100 ng / ml de puromycine. NOTE: Les concentrations optimales de réactifs de sélection positifs et négatifs doivent être déterminées expérimentalement pour chaque lignée cellulaire maître HPSC nouvellement généré. Effectuer une courbe kill 13, en utilisant la lignée cellulaire maître pour déterminer la dose faible (concentration à laquelle la toxicité visuelle minimale est apparente après 7d de la sélection, mais la culture ne sont pas envahis), la dose optimale (la plus faible concentration à laquelle toutes les cellules sont mortes après 7 jours de la sélection), et à haute dose (concentration qui a provoqué une toxicité manifeste, tuant les cellules après 2 - 3 d) à la fois la puromycine et la fialuridine (FIAU). <ol><li> Aspirer le moyen CSEh. Laver avec 1 ml de PBS. Ajouter moyen de CSEh avec 100 ng / ml de puromycine. </li></ol></li><li> Observer la croissance des cellules de sorte que la mort et la croissance sont équilibrés. Changer les médias avec la puromycine quotidienne, suite à l&#39;étape 3.1.1. Lorsque le taux de croissance dépasse la mort cellulaire, augmenter la concentration de puromycine dans des blocs de 25 - 50 ng / mL jusqu&#39;à un maximum de 250 ng / mL. Continuer la sélection puromycine pendant 5 - 7 d. </li><li> 3 - 4 d après le début de la sélection de la puromycine, autour du jour 6 post-transfection, commencer sélection avec 0,5 uM CARF. Changer les médias par jour et maintenir CARF pour pas plus de 7 jours consécutifs. </li></ol> 4. Expansion et caractérisation de CREM Lines <ol&gt; <li> Après la fin de la sélection, autour de D14 - 15, les colonies de CREM résistants sont présents et constituent la nouvelle ligne de CREM. Diviser en vrac dans un rapport 1: 2 en suivant les procédures standard (passage 1, P1). </li><li> Plate 2 puits d&#39;une plaque de 12 puits (ou désactiver les mangeoires, en fonction des conditions de culture normales de la lignée cellulaire maître d&#39;origine). Utilisez un puits d&#39;expansion, le stockage ou expérimental (aucune description supplémentaire de ces procédures est fait dans ce protocole), et l&#39;autre pour la caractérisation. </li><li> Lorsque les cellules de P1 sont prêtes à se fendre, se dissocier du puits pour la caractérisation dans une suspension à cellule unique, comme décrit dans 2.4 et recueillir les cellules dans un tube de 15 ml. REMARQUE: Utiliser des cellules du HPSC WT (pas de modification génétique) et la lignée cellulaire de maître comme témoins négatifs et positifs, respectivement, pour la caractérisation. </li><li> Isoler à 300 xg pendant 5 min à température ambiante. Remettre en suspension dans 1 ml de PBS et on divise l&#39;échantillon en deux par cytométrie de fluxet analyse de l&#39; ADN 13. </li><li> Analyse par cytométrie en flux 13 (300 ul): <ol><li> Ajouter du sérum de foetus de veau aux cellules dans du PBS jusqu&#39;à une concentration finale de 5%. Transférer les cellules dans un tube de FACS propre avec un tamis cellulaire et les garder sur la glace. NOTE: La viabilité des cellules est élevé dans ces conditions, il est donc possible, mais pas nécessaire, d&#39;utiliser un colorant fluorescent pour les cellules non viables (par exemple, 7-AAD ou PI). </li><li> Procéder immédiatement à l&#39;analyse dans un cytomètre de flux analyseur de cellules et enregistrer 20.000 - 30.000 événements. Pour l&#39;analyse, définissez les portes ci-dessus GFP ou TDT fond florescence utilisant le WT échantillon témoin négatif. </li></ol></li><li> Analyse de l&#39; ADN 13 (700 ul): <ol><li> Transférer les cellules à un propre tube de 1,5 ml. Isoler à 300 xg pendant 5 min à température ambiante et aspirer le surnageant. Passez à l&#39;extraction de l&#39;ADN en utilisant un kit commercial et suivez les instructions du fabricant. Stocker le culot sec à -20 ° C pour latanalyse de er. </li></ol></li><li> Mesurer la concentration d&#39;ADN. <ol><li> Préparer des réactions de PCR standard en fonction des conditions de la figure 3 et le tableau 2 échantillons sur 13 Run PCR d&#39; un gel d&#39;agarose à 2% contenant 1 x gel tache d&#39;ADN à 150 V pendant 15 -. 25 min. Analyser la course dans un analyseur de gel. </li></ol></li></ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

édition Gene méthodes loci portuaires sécuritaires demeurent un outil essentiel pour développer la transgénèse dans hPSCs. Bien que le caractère de refuge de AAVS1 a récemment été remise en question pour certaines applications 13,18, ce locus reste actuellement le meilleur , caractérisé en lignées cellulaires humaines dérivées. La conscience de ses limites dans hPSCs peut aider à obtenir des données fiables. Par conséquent, AAVS1 devrait encore être un site utile, par exemple, pour les études de perte et intensité forte de fonction ou inductible expression / constitutive de facteurs qui nécessitent un contexte isogénique dans et entre les milieux génétiques déterminés. Le locus AAVS1 a été ciblé par de nombreux groupes utilisant ZFNs, TALEN ou CRISPR / cas9 1,2,19. Ces nucleases augmentent de façon significative l&#39;efficacité de la recombinaison homologue dans un lieu déterminé. Cependant, le processus de dépister et de caractériser complètement clones correctement ciblés, libres de integ aléatoireration et de maintenir la pluripotence et l&#39; intégrité du génome peut prendre jusqu&#39;à 3 mois ( à l&#39; aide des outils d&#39;édition optimisés de gènes) (figure 3). Les deux derniers peuvent être causés par des mutations possibles générés par l&#39;activité de nucléase hors cible. Le système de CREM utilisé ici, cependant, offre une méthode rapide, efficace et élégante pour atteindre cet objectif en seulement deux semaines, une fois que des séquences cibles spécifiques recombinase sont préintégrées dans le locus AAVS1. Utilisation de la sélection positive / négative et un programme de sélection approprié sont les principaux facteurs qui contribuent à la simplification de l&#39; édition des gènes dans le locus AAVS1 par CREM. La caractérisation génotypique des nouvelles lignées transgéniques est significativement réduite (pas de dépistage clonale est nécessaire), et la caractérisation associée à l&#39;activité hors cible nucléase est rendue indispensable en raison de la spécificité de FLPe pour FRT. La caractérisation peut également être réduit dans des expériences de routine CREM en démontrant laperte complète de l&#39; expression de GFP à partir de la lignée cellulaire maître (figure 2A), parce que l&#39; échange de la cassette complète et le manque d&#39;intégration aléatoire ont déjà été suffisamment démontrée par PCR (figure 2B) et Southern blot 13. L&#39;utilisation de la sélection positive / négative constitue également la principale différence avec les rapports précédents. Plusieurs groupes décrits précédemment CREM dans hPSCs, soit dans le AAVS1 ou d&#39; autres loci, utilisés une seule étape de sélection positive 7,14,16. Cela ne constitue pas un avantage technique sur l&#39;édition génétique réalisée avec des nucléases, parce que le dépistage de la colonie doit être effectuée également dans le but de démontrer l&#39;intégration correcte et l&#39;absence d&#39;intégration aléatoire au niveau clonal. L&#39; utilisation de ce système CREM dans plusieurs CSEh lignes / iPSC nécessite préintégration du FRT contenant la cassette décrite dans le locus AAVS1 de chaque ligne indépendante. Cependant, une fois généré,sa rapidité et de simplicité, il est possible de développer des semi-haut débit écrans génétiques dans les paramètres isogéniques définis pour les applications mentionnées ci-dessus qui, autrement, serait techniquement très coûteuse en temps. En outre, tous les vecteurs de CREM sont construits dans le vecteur de ciblage de gène pZ AAVS1 utilisé pour cibler le locus avec ZFN, mais TALENs ou CRISPR / cas9 ont également été signalés. La dualité du vecteur CREM est très utile pour générer plusieurs lignes pour un transgène déterminé hPSCs avec ou sans FRT. Par exemple, un coup a démontré avec succès dans un écran génétique déterminée effectuée par CREM serait idéalement besoin d&#39;être testé dans plusieurs lignes HPSC pour confirmer les résultats. En l&#39;absence de plusieurs lignées de cellules maître CREM-approprié, gène cible directe du succès en utilisant nucléases pourrait être effectuée. L&#39;utilité du double caractère des vecteurs de CREM a été prouvé par notre groupe 20. Dans cette étude, la correction génique a été réalisée chez le patient dérivéLa démence frontotemporale (DFT) CSPi qui portent une mutation causant progranuline (PGRN) déficit d&#39;expression. Gène de complémentation par ZFN médiées par insertion dans le locus AAVS1 d&#39;une cassette qui rétablit les niveaux PGRN, corrige le phénotype déficient en corticogenèse associé à la présence de la mutation. En outre, une ligne comparable a été générée par CREM en CSEh WT pour être utilisé comme témoin pour l&#39; expression PGRN exogène. En l&#39;absence de colonies recombinantes, vérifier l&#39;efficacité de transfection du vecteur CREM des donateurs. l&#39;efficacité de transfection supérieure à 30% donnent les résultats indiqués ci-dessus. efficacités plus faibles de transfection diminuent l&#39;efficacité de recombinaison. Enfin, le système de CREM a été généré dans le locus AAVS1, mais elle est applicable à tout autre locus.

Ciblée recombinaison du génome a permis des progrès rapides dans de nombreux domaines de recherche. Chez les souris, la synergie entre l&#39;édition du génome et les cellules souches a permis une meilleure compréhension du mécanisme complexe de la fonction des gènes et la régulation des gènes. Ces progrès sont attendus dans les cellules humaines pluripotentes de troncs (hPSCs), ainsi, bien que depuis de nombreuses années depuis le premier isolement de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh), et humain plus tard induite par des cellules souches pluripotentes (de hiPSCs), l&#39;édition de gènes a constitué un obstacle technique . Les progrès récents dans l&#39;ingénierie du génome en utilisant nucléases-zinc ciblées Finger nucléases (ZFN), transcription nucléases effectrices activatrices-like (Talen), ou en cluster régulièrement intercalées courte répétitions palindromiques / CRISPR-associated protein 9 (CRISPR / cas9) nous ont permis de surmonter ces difficultés, ce qui rend la recombinaison un processus efficace ciblés : 1 - 3. loci spécifiques dans le mouse génome qui permettent stable, fiable et omniprésente expression du transgène en l&#39;absence d&#39;effets indésirables comme Rosa26, HPRT1 ou COL1A1, sont devenus des outils essentiels dans la réalisation d&#39;études génétiques. loci portuaires sécuritaires permettent une analyse comparable entre les différentes lignées de souris dans des contextes isogéniques. Ceci ne peut être réalisé en utilisant des méthodes d&#39;intégration aléatoire standard, qui sont associés à des limites bien connues telles que la mutagenèse insertionnelle, les effets dépendants de la dose, ou l&#39;expression du transgène bigarrée. Gene montage facilité et la flexibilité dans le port sûr loci est augmenté par l&#39;utilisation de recombinases site-spécifiques ciblés comme Cre ou flippase (FLPe), qui reconnaissent spécifiquement des séquences cibles (loxP ou FRT, respectivement) et catalysent la recombinaison efficace entre des objectifs identiques. En raison de ces caractéristiques, l&#39;édition du gène recombinase à médiation en utilisant des séquences loxP ou FRT dans préintégrées loci de refuge est un outil couramment utilisé dans la souris transgenèse. En plus de l&#39; insertion de la cassette ou l&#39; excision à médiation entre des séquences cibles identiques, l&#39;utilisation de sites loxP ou FRT incompatibles permet l&#39;échange de cassette à médiation par la recombinase (CREM) 4. Chez l&#39;homme, les tentatives pour identifier les loci de la sphère de sécurité ont été effectuées. Le HPRT orthologue de la souris, en dépit de son association avec le syndrome de la perte de fonction de Lesch-Nyhan et ROSA26 ont été ciblés en hPSCs. HPRT a été signalé pour faire taire rapidement l&#39; expression du transgène dans ESC et, comme ROSA26, sa capacité à maintenir l&#39; expression du transgène dans terminale des cellules différenciées n&#39;a pas été étudiée 5-7. Parce qu&#39;une mutation nulle homozygote du gène CCR5 semble être bien toléré chez l&#39; homme, sa valeur refuge a été évaluée. CCR5 a été ciblé et rapporté pour soutenir l&#39; expression du transgène stable dans différentes lignées cellulaires humaines, y compris 8,9 CES. cependant,ce dernier n&#39;a pas été prouvé au niveau clonal pendant la culture à long terme, et l&#39; expression du transgène omniprésente n&#39;a pas été démontrée dans la descendance différenciée des trois couches germinales. AAVS1, le site d&#39;intégration naturelle de l&#39;Adeno Associated Virus de type 2 (AAV), a été testé en CSEh ainsi, en raison de la résistance rapportée à transgène taire 10. Par la suite, de nombreux groupes ont utilisé le locus AAVS1 et décrit l&#39; expression stable du transgène dans hPSCs indifférenciées, ainsi que leur descendance différenciée de l&#39; ensemble des trois couches germinales, à la fois in vitro et in vivo 2,8,11,12. Les résultats récents nuancent néanmoins ces résultats, comme le lieu AAVS1 a été trouvé pour exercer une inhibition de transgène variables in vitro dans CSEh indifférenciées et hépatocytes descendance 13. études de dépistage supplémentaires utilisant des approches et des méthodes d&#39;intégration aléatoires pour déterminer l&#39;intégration à copie unique visant à trouver des génosites d&#39;intégration micro résistantes aux transgène silencieux pendant hPSCs l&#39; expansion et la différenciation 14,15. Dans l&#39;ensemble, jusqu&#39;à présent, aucun site génomique a été entièrement validée comme un port sûr dans hPSCs et leur progéniture; l&#39; identification d&#39;un site approprié pour l&#39; expression du transgène stable omniprésente, non seulement en hPSCs mais aussi dans leurs descendances différenciées in vitro et in vivo, reste à résoudre. Parmi tous les loci étudiés et malgré ses limites, AAVS1 reste le mieux caractérisé et le plus utilisé dans la recherche sur les cellules souches. CREM a été réalisé avec succès en hPSCs dans certains de ces loci 6,7,14,16, en utilisant la plupart du temps Cre recombinase, même s&#39;il y a des indications que FLPe est plus efficace que Cre 17. Dans tous ces cas, une cassette de résistance à la drogue positive a été utilisée pour la sélection de colonies recombinantes. Malgré son succès, ces procédures ne constituent pas un progrès technique sur la norme géné-procédures d&#39;édition en utilisant ZFNs, TALENs ou CRISPR / cas9, comme une seule procédure de sélection antibiotique ne permet pas d&#39;exclure des intégrations aléatoires et exige le dépistage des colonies pour identifier les clones correctement ciblés. Dans cette procédure, on décrit des méthodes pour effectuer CREM en hPSCs dans le locus AAVS1 utilisant une combinaison de positif (à l&#39;intérieur de la cassette entrant) et négative (à l&#39;intérieur de la cassette pré - intégrée) , les sélections qui permettent la génération de lignées transgéniques polyclonaux à ± 15 jours , avec 100% d&#39;efficacité et sans événements d&#39;intégration aléatoires. Par conséquent, cette méthode représente un progrès au-delà des technologies de CREM actuellement décrites dans hPSCs.

<table><tbody><tr><td>DR4 Fibroblastes embryonnaires de souris (MEF)</td><td>AMS bio</td><td>GSC-6204G</td><td>culture hPSC sur mangeoires</td></tr><tr><td>CF-1 MEF, traitement à la mitomycine</td><td>AMS Bio</td><td>GSC-6001M</td><td></td></tr><tr><td>EmbryoMax 0,1 % Solution de gélatine</td><td>Millipore</td><td>ES-006-B</td><td>Placage iMEF</td></tr><tr><td>DMEM/F-12, HEPES</td><td>Gibco</td><td>31330-038</td><td></td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement </td><td>Gibco</td><td>10828-028</td><td></td></tr><tr><td>L-Glutamine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8540</td><td>Pour hESC medium</td></tr><tr><td>L-Glutamine, 200</td><td>mM Gibco</td><td>25030-081</td><td>Pour iMEF medium</td></tr><tr><td>2-Mercaptoethanol, 50&nbsp ; mM</td><td>Gibco</td><td>31350-010</td><td></td></tr><tr><td>MEM Solution d’acides aminés non essentiels (100x)</td><td>Gibco</td><td>11140-035</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Gibco</td><td>15140122</td><td></td></tr><tr><td>Humain basique FGF</td><td>Peprotech</td><td>100-18C</td><td></td></tr><tr><td>Y-27632 en solution</td><td>VWR</td><td>688001-500</td><td></td></tr><tr><td>DMEM High Glucose</td><td>Gibco</td><td>41965-039&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7524</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td>hPSC culture sur mangeoires</td></tr><tr><td>Matrigel, hESC qualifié</td><td>VWR</td><td>734-1440</td><td></td></tr><tr><td>mTeSR1 kit de milieu complet</td><td>Technologies de cellules souches</td><td>05850</td><td>Pour la culture sans feeder</td></tr><tr><td>StemPro Accutase Réactif de dissociation</td> cellulaire<td>Gibco</td><td>A1110501</td><td>Pour culture sans nourrisseur</td></tr><tr><td>Y-27632 en solution</td><td>VWR</td><td>56726</td><td></td></tr><tr><td>Kit de nucléofecteur de cellules souches humaines 2</td><td>Lonza</td><td>VVPH-5022</td><td></td></tr><tr><td>Chlorhydrate de puromycine</td><td>Gibco</td><td>A11138-03</td><td></td></tr><tr><td>FIAU (Fialuridine)</td><td>ABX</td><td>2910</td><td></td></tr><tr><td>Hygromycine B</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H3274</td><td></td></tr><tr><td>pFLPe</td><td></td><td></td><td>Modifié à partir de pCAGGS-FLPe (MES4488, Open Biosystems) pour éliminer les donneurs de puromycine</td></tr><tr><td>RMCE</td><td>-</td><td>-</td><td>Modifié à partir de donneur pZ AAVS1 vecteur puromycine (PZD0020-1KT, Sigma Aldrich)13</td></tr><tr><td>5 mL Tube à essai en polystyrène à fond rond, avec crépine cellulaire</td><td>Falcon</td><td>352235</td><td></td></tr><tr><td>PureLink Kit d’ADN génomique</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td>K182001</tr><tr><td>GoTaq Flexi DNA polymérase</td><td>Promega</td><td>M8298</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sigma</td><td>A9539</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Safe DNA Gel Stain</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Nucleofector 2b Device</td><td>Lonza (Amaxa)</td><td>AAB-1001</td><td></td></tr><tr><td>NucleoCounter NC-100</td><td>Chemometec</td><td>NC-100</td><td></td></tr><tr><td>BD FACS Canto</td><td>BD Biosciences</td><td>337175</td><td></td></tr><tr><td>NucleoCassette</td><td>Chemometec</td><td>941-0002</td><td></td></tr></tbody></table>

génération rapide et efficace des recombinant pluripotentes humaines cellules souches par recombinase médiée cassette exchange dans le<em&gt; aavs1</em&gt; locus

Rapid and Efficient Generation of Recombinant Human Pluripotent Stem Cells by Recombinase-mediated Cassette Exchange in the AAVS1 Locus

Même avec la révolution des technologies de gènes ciblage dirigé par CRISPR-cas9, la modification génétique des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) est encore temps. Des études comparatives qui utilisent des lignes recombinantes avec des transgènes intégrés dans le port sûr loci pourrait bénéficier d&#39;approches qui utilisent recombinases site-spécifiques ciblées, comme Cre ou FLPe, qui sont plus rapides et moins sujettes à des effets hors-cible. Ces méthodes ont été décrites, mais ils ne le font pas de manière significative le gène surperformer le ciblage dans la plupart des aspects. Utilisation de nucléases à doigt de zinc, nous avons déjà créé une lignée de cellules de maître dans le locus AAVS1 de hPSCs qui contient un GFP-hygromycine-tk exprimant cassette, flanqué par des séquences FRT hétérotypiques. Ici, nous décrivons les procédures pour effectuer FLPe échange de cassette recombinase-médiée (CREM) en utilisant cette ligne. Le maître cligne ell est transfectée avec un vecteur CREM donneur, qui contient un promoteur de résistance puromycine, et avec FLPe recombinase. Application de la fois positif (puromycine) et négatif (CARF) programme de sélection conduit à la sélection de CREM sans intégrations aléatoires. CREM génère des lignées transgéniques polyclonaux pluripotentes entièrement caractérisé en 15 j avec 100% d&#39;efficacité. Malgré la récente décrit les limites du locus AAVS1, la facilité du système ouvre la voie à HPSC transgénèse dans les paramètres isogéniques, est nécessaire pour des études comparatives, et permet des écrans génétiques semi-haut débit pour le gain / perte d&#39;analyse de la fonction qui autrement être très longue.

Utilisation de AAVS1 ZNFs spécifique de lignées de cellules maître CSEh / iPSC entièrement caractérisés contenant hétérotypiques séquences cibles FRT ont été générées et décrites 13. Les lignées cellulaires maîtres contenant FRT maintenues pluripotence et l&#39; intégrité du génome après le traitement ZFN et exprimés de manière stable GFP in vitro et in vivo. CREM est effectuée par co - transfection des lignées de cellules parentales avec FLPe recombinase et les vecteurs donneurs CREM (figure 1A). Vecteurs CREM contiennent des séquences FRT identiques à ceux de la lignée cellulaire maître AAVS1 flanquant le transgène Figure 1B surveille CREM en utilisant l&#39;expression constitutivement TDT pZ:.. F3-P CAGGS tdTPH-F Après transfection, HPSC forment de petits groupes de cellules réparties uniformément sur la couche iDR4 MEF, et transfectées HPSC expriment à la fois la GFP ainsi que transitoire TDT (Figure 1B, D 2). Les cellules sont autorisés à récupérer pendant 2 - 3d post-transfection avant de commencer la sélection. La sélection positive est d&#39;abord commencé à utiliser une faible dose de puromycine afin de favoriser l&#39;insertion CREM des donateurs. Puromycin est appliquée doucement au début, parce que la mort initiale cellulaire massive pourrait conduire à des cellules individuelles subissant une recombinaison, ce qui les rend incapables de survivre au processus. Dans les jours suivants, la concentration de puromycine doit être soulevée par étapes jusqu&#39;à la dose optimale afin de permettre aux cellules recombinantes de croître dans de petites colonies tandis que les cellules nonrecombined meurent progressivement. 3 - 4 d après le début de la sélection positive (environ 6 D post-transfection), la sélection négative est commencée afin de sélectionner uniquement pour les événements de recombinaison FRT-médiation. CREM provoque la perte de la thymidine kinase (TK), le gène suicide et donc la sensibilité à la fialuridine (FIAU). La sélection négative appliquée à ce stade, dans lequel de petits groupes de 2-4 GFP - / TDT + (CREM) , les cellules sontcapable de résister à des concentrations optimales de CARF (Figure 1B, D 6), empêche l&#39; intégration aléatoire, parce que , dans de tels événements, le gène Tk dans le locus AAVS1 reste inchangée. Présence de simultanée FRT-médiation et de l&#39; intégration aléatoire est hautement improbable, comme l&#39;a démontré l&#39;absence d&#39;événements d&#39;intégration aléatoires plus tard lors de la caractérisation (figure 2B). Le CREM GFP mixte - / TDT + colonies continuent de croître, tout en devenant plus homogène, de sorte que par D 9 - 10 post-transfection, certaines colonies de CREM mixtes pas entièrement sélectionnés peuvent être trouvés (figure 1B). GFP - / TDT + CREM colonies sont présentes uniquement lorsque le donneur et les deux CREM FLPe (2: 1) sont utilisés, tandis que CREM ne se produit pas en l&#39;absence de FLPe (2: 0). Sélection complète avec CARF jusqu&#39;au jour 13 - 15 post-transfection donne lieu à une GFP homogène - / TDT + culture. CREM donne une moyenne de 12,8 ± 6,8 (= 6 n) colonies Puro R / FIAU R en 15 jours 13. Cytométrie de flux caractérisation de la ligne de CREM nouvellement généré (les colonies de CREM Puro R / FIAU R combinés dans une population de cellules nonclonal) confirme que 100% des cellules présentent le CREM GFP - / TDT + phénotype (figure 2A). Lorsque les donateurs de CREM sans expression constitutive d&#39;un rapporteur fluorescent sont utilisées, la ligne Puro R / FIAU R CREM HPSC résultant est homogène GFP -. Caractérisation par PCR de la ligne de CREM nonclonal démontre l&#39;échange de la cassette complète (aucune trace de la cassette de la lignée cellulaire maître peut être détectée) et que le programme de sélection utilisé génère des lignes sans d&#39;intégration aléatoires (à la fois du donneur de CREM et FLPe exprimant vecteur) (figure 2B). Ces résultats ont encore été prouvés par set transfert de UD, en outre, on a démontré que les lignes de CREM restent pluripotentes 13. Cela rend plus nécessaire de réaliser soit l&#39;évaluation de l&#39;ensemble du génome de l&#39;intégration aléatoire ou le test de la pluripotence au cours des expériences de CREM routine. En résumé, en utilisant ce protocole, HPSC lignées cellulaires transgéniques dans le locus AAVS1 sans intégration au hasard peuvent être facilement générés en 15 d à 100% d&#39; efficacité et sans la nécessité d&#39;une caractérisation. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/54718/54718fig1.jpg" /> Figure 1: Vue d&#39; ensemble schématique du CREM (A) Chronologie du programme de sélection de CREM.. A gauche: la lignée cellulaire maître (MCL), abritant une cassette FRT flanquée (triangles) qui expriment la GFP et l&#39;hygromycine-tk (lié par des peptides auto-cliver 2A) est transfectée par nucléofection (NF) avec le vecteur FLPe exprimant et le vecteur CREM donneur, which contient un gène de résistance à la puromycine sans promoteur (accepteur d&#39; épissage - SA- Puro R) et une cassette expérimental variable (X). A droite: nouvelle ligne de CREM (RMCEL) obtenu après l&#39;achèvement de la sélection avec la puromycine (triangle rouge) et CARF (ligne bleue). (B) CREM utilisant un constitutive TDT exprimant donneur et des rapports différents de l&#39; ADN du donneur et FLPe ADN (0: 1, 2: 1, 2: 0) contrôlée par microscopie de fluorescence (GFP - fluorescence verte, TDT - fluorescence rouge) à différentes des points de temps. D 2 et 6: échelle barres représentent 100 um. D 10: barres d&#39;échelle représentent 200 um. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54718/54718fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/54718/54718fig2.jpg" /> Figure 2:. Caractérisation des CREM Lines (A) Détermination de CREM parcytométrie de flux. GFP et d&#39; expression TDT est montré pour la ligne de WT, lignée cellulaire maître (MCL), et la ligne de CREM nouvellement généré au D 15 post-nucléofection utilisant un vecteur constitutif TDT-expression (CAGGS TDT), ou les bailleurs de fonds avec GFP entraînés par un promoteur goosecoid (GSCP GFP, marqueur endoderme définitif) ou un promoteur d&#39;AAT (APOeAATp GFP, marqueur hépatocytes). (B) Confirmation du CREM (5 &#39;/ 3&#39; JA RMCEL), l&#39; absence de (MCL) de la cassette de la ligne de la cellule principale (5 &#39;/ 3&#39; JA MCL), et le manque d&#39;intégration aléatoire (5 &#39;/ 3&#39; / FLPe RI ) par PCR en utilisant les paires d&#39;amorces décrites. L&#39;ADN de WT, MCL, lignes de CREM (1 - 5), vecteur donneur d&#39;CREM (+ RI), FLPe vecteur exprimant, et aucun contrôle de modèle (NTC) ont été utilisés. Figure modifiée à partir (Ordovas et al., 2015) 13. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54718/54718fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> dans les pages = &quot;1&quot;&gt; <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/54718/54718fig3.jpg" /> Figure 3. Génération du Master Cell ligne et comparaison de Gene CREM-approprié Ciblage avec CREM en AAVS1 gauche. Le ciblage génique utilise des cellules WT non modifiés qui sont co - transfectées avec un donneur ( la cassette décrite dans la figure 1A pour la génération de la lignée cellulaire maître MCL) et ZFN optimisées spécifiques. Le processus pour compléter la caractérisation complète peut durer jusqu&#39;à 3 mois. A droite: CREM est réalisée par cotransfection du donneur avec des vecteurs FLPe et une ligne pleine est généré, caractérisé en 15d. Gene efficacité du ciblage en AAVS1 est des études antérieures 1,2. <a href="http://ecsource.jove.com/files/ftp_upload/54718/54718fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> ays &quot;&gt; <tbody><tr><td> Médias </td><td> Composants </td><td> La concentration finale </td></tr><tr><td rowspan="7"> moyen CSEh </td><td> DMEM-F12, HEPES </td><td> 80% </td></tr><tr><td> moyen de remplacement de sérum </td><td> 20% </td></tr><tr><td> L-Glutamine </td><td> 146 mg / mL </td></tr><tr><td> Amino MEM non essentiels Acides Solution (100x) </td><td> 1 fois </td></tr><tr><td> 2-mercaptoéthanol </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td> Pénicilline / Streptomycine </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> FGF basique humain </td><td> 4 ng / ml </td></tr><tr><td rowspan="6"> milieu de culture Imef </td><td> DMEM Haut Glucose </td><td></td></tr><tr><td> sérum de veau fœtal (FBS) </td><td> 15% </td></tr><tr><td> Pénicilline- streptomycine </td><td> 0,1% </td></tr><tr><td> L-Glutamine 200 mM </td><td> 4 mM </td></tr><tr><td> Amino MEM non essentielsSolution Acides (100x de) </td><td> 2x </td></tr><tr><td> 2-mercaptoéthanol </td><td> 0,1 mM </td></tr><tr><td rowspan="2"> Placage moyen </td><td> moyen CSEh </td><td> 100% </td></tr><tr><td> inhibiteur de ROCK (Y-27632) </td><td> 10 pm </td></tr></tbody></table> Tableau 1. Composition des médias. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td> Essai </td><td colspan="2"> Vers l&#39;avant </td><td colspan="2"> Sens inverse </td><td> amplicon </td><td> cycle PCR </td></tr><tr><td> 5&#39;JA MCL </td><td colspan="2"> CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC </td><td colspan="2"> CGTTACTATGGGAACATACGTCA </td><td> 1.1 Kb </td><td> 95 ºC, 5 &#39;- [95 ºC, 30&#39; &#39;- 68 ºC (-0,5 ºC / cycle), 1&#39; 30 &#39;&#39;] X15 - [95 ºC, 30 &#39;&#39; - 58 ºC, 30 &#39;&#39; - 72 ºC, 1 &#39;30&#39; &#39;] X25 - 72 ºC, 5&#39; </td></tr><tr><td> 3&#39;JA MCL </td><td colspan="2"> TAACTGAAACACGGAAGGAG </td><td colspan="2"> AAGGCAGCCTGGTAGACA </td><td> 1,4 Kb </td><td> 95 ºC, 5 &#39;- [95 ºC, 30&#39; &#39;- 68 ºC (-0,5 ºC / cycle), 1&#39; 30 &#39;&#39;] X15 - [95 ºC, 30 &#39;&#39; - 58 ºC, 30 &#39;&#39; - 72 ºC, 1 &#39;30&#39; &#39;] X25 - 72 ºC, 5&#39; </td></tr><tr><td> 5&#39;JA RMCEL </td><td colspan="2"> CACTTTGAGCTCTACTGGCTTC </td><td colspan="2"> CATGTTAGAAGACTTCCTCTGC </td><td> 1.1 Kb </td><td> 95 ºC, 5 &#39;- [95 ºC, 30&#39; &#39;- 68 ºC (-0,5 ºC / cycle), 1&#39; 30 &#39;&#39;] X15 - [95 ºC, 30 &#39;&#39; - 58 ºC, 30 &#39;&#39; -72 ºC, 1 &#39;30&#39; &#39;] X25 - 72 ºC, 5&#39; </td></tr><tr><td> 3&#39;JA RMCEL </td><td colspan="2"> TTCACTGCATTCTAGTTGTGG </td><td colspan="2"> AAGGCAGCCTGGTAGACA </td><td> 1,5 Kb </td><td> 95 ºC, 5 &#39;- [95 ºC, 30&#39; &#39;- 68 ºC (-0,5 ºC / cycle), 1&#39; 30 &#39;&#39;] X15 - [95 ºC, 30 &#39;&#39; - 58 ºC, 30 &#39;&#39; - 72 ºC, 1 &#39;30&#39; &#39;] X25 - 72 ºC, 5&#39; </td></tr><tr><td> 5&#39;RI DONATEURS </td><td colspan="2"> GTACTTTGGGGTTGTCCAG </td><td colspan="2"> TTGTAAAACGACGGCCAG </td><td> 0,5 Kb </td><td> 95 ºC, 5 &#39;- [95 ºC, 30&#39; &#39;- 60 ºC, 30&#39; &#39;- 72 ºC, 30&#39; &#39;] X25 - 72 ºC, 5&#39; </td></tr><tr><td> 3&#39;RI DONATEURS </td><td colspan="2"> CCTGAGTTCTAACTTTGGCTC </td><td colspan="2"> ACACAGGAAACAGCTATGAC </td><td> 0,5 Kb </td><td&gt; 95 ° C, 5 &#39;- [95 ºC, 30&#39; &#39;- 60 ºC, 30&#39; &#39;- 72 ºC, 30&#39; &#39;] X25 - 72 ºC, 5&#39; </td></tr><tr><td> RI FLPe </td><td colspan="2"> CCTAGCTACTTTCATCAATTGTG </td><td colspan="2"> GTATGCTTCCTTCAGCACTAC </td><td> 0,65 Kb </td><td> 95 ºC, 5 &#39;- [95 ºC, 30&#39; &#39;- 60 ºC, 30&#39; &#39;- 72 ºC, 30&#39; &#39;] X25 - 72 ºC, 5&#39; </td></tr></tbody></table> Tableau 2. jeux d&#39;amorces utilisées pour le génotypage par PCR. Modifiée de Ordovas et al., 2015 13.

Nous rapportons ici une méthode d&#39;édition de gène rapide et efficace basée sur CREM dans le locus AAVS1 des cellules souches pluripotentes humaines (hPSCs) qui améliore les systèmes décrits précédemment. En utilisant cette technique, les lignes isogéniques peuvent être rapidement et de manière fiable générés pour des études comparatives appropriées, ce qui facilite la recherche en transgénèse médiée avec hPSCs.

Génération rapide et efficace des Recombinant pluripotentes humaines cellules souches par recombinase médiée Cassette Exchange dans le<em&gt; AAVS1</em&gt; Locus

Even with the revolution of gene-targeting technologies led by CRISPR-Cas9, genetic modification of human pluripotent stem cells&#160;(hPSCs)&#160;is ...

L'objectif général de cette procédure est de réaliser une édition ciblée rapide et efficace du génome dans le locus AAVS1 de cellules souches pluripotentes humaines, ou PSC humaines, en utilisant une approche d'échange de cassette médiée par une flippase et une recombinase, ou RMCE. Le RMCE améliore l'insertion ciblée d'une séquence dans le locus AAVS1, ce qui revêt une grande importance en biologie des cellules souches, car il permet de tester rapidement la fonction d'une molécule par surexpression ou inhibition. Le principal avantage de cette technique est qu'elle permet de créer en seulement 15 jours des lignées de PSC humaines exemptes d'événements d'intégration aléatoire, toujours pluripotentes et possédant un caryotype normal.Cette méthode fournit un outil utile pour la transgénèse au niveau du locus AAVS1, mais peut également être appliquée à d'autres locus humains perméables. Pour commencer, cultivez des lignées cellulaires souches humaines maîtresses selon les procédures standard, en présence ou en absence de fibroblastes embryonnaires de souris inactivés ou iMEFs, dans des plaques à six puits. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 60 % à 70 %, ensemencez les iMEFs résistants aux antibiotiques en utilisant d'abord une solution de gélatine à 0,1 % pour recouvrir les puits nécessaires d'une plaque à 12 puits, puis incubez la plaque à température ambiante pendant cinq minutes.Ensuite, répartir 125 000 iDR4 par puits et incuber les cultures toute la nuit dans du milieu iMEF. Le jour suivant, préincuber les cultures de PSC humaines avec du milieu frais contenant 10 micromolaire d'inhibiteur de la ROCK à 37 degrés Celsius pendant une heure. Pendant ce temps, porter la solution de transfection pour ESC humaines et l'agent de dissociation cellulaire à température ambiante.Préparez un millilitre de milieu de mise en culture pour la nucléofection par condition de nucléofection. Ensuite, retirez le milieu iDR4 des puits, lavez les cellules avec un millilitre de PBS à température ambiante et ajoutez le milieu de mise en culture pour la nucléofection. Transférez 500 microlitres par échantillon de milieu de culture dans des tubes stériles de 1,5 millilitre et conservez-les à 37 degrés Celsius jusqu'à la mise en culture.Pour détacher les CSP humaines en suspension simple de cellules, retirez le milieu, utilisez du PBS à température ambiante pour laver les cellules et ajoutez un millilitre de trypsine 0,05 % ou d'Accutase sur des cultures de CSPh avec ou sans cellules nourricières, respectivement. Incubez les cultures à 37 degrés Celsius. Ensuite, retirez délicatement la plaque de l'incubateur et, sans laisser les cellules se détacher, aspirez l'agent de dissociation et ajoutez 1 millilitre de milieu pour CSP humaines.Dissocier les cellules lâches en rinçant doucement le milieu sur la surface de la plaque, tout en évitant la formation d'écume. Récolter les cellules sous forme de suspension monocellulaire dans un tube stérile et propre de 15 ou 50 millilitres. Ensuite, utiliser 1 millilitre de milieu hESC pour laver les cellules et les récolter dans le même tube.Prélevez un aliquot de 50 microlitres de la suspension cellulaire pour le comptage et centrifugez les cellules restantes à 300 × g pendant cinq minutes à température ambiante. Comptez les cellules à l’aide d’un dispositif de comptage cellulaire pendant que la suspension est en cours de centrifugation. Éliminez le surnageant et utilisez du PBS à température ambiante pour resuspendre doucement le culot cellulaire à une concentration de 10⁶ cellules par millilitre.Transférez ensuite deux millilitres par condition expérimentale dans des tubes stériles propres de 15 millilitres et répétez la centrifugation. Pendant que les échantillons tournent, préparez des mélanges de plasmides dans trois tubes propres de 1,5 millilitre avec des rapports moléculaires de donneur flippase de 0:1, 2:1 et 2:0 en utilisant 2,5 microgrammes de plasmide flippase. Pour poursuivre la nucléofection, retirez la plaque iDR4 et le tube de 1,5 millilitre contenant le milieu de culture de l’incubateur.Un tube à la fois, sans perturber le culot, aspirez soigneusement le PBS en éliminant autant que possible le tampon. Utilisez 100 microlitres de solution de transfection pour resuspendre le culot en pipetant délicatement. Ensuite, transférez la suspension cellulaire dans le tube de 1,5 millilitre contenant les mélanges de plasmides et mélangez doucement.Transférez le mélange d'ADN cellulaire dans la cuvette de transfection, en prenant soin de ne pas introduire de bulles. Insérez la cuvette dans l'appareil de nucléofection et lancez le programme A13 pour les cellules cultivées sur des cellules nourricières ou le programme F16 pour la transfection sans cellules nourricières. Retirez la cuvette et utilisez les pipettes jetables fournies dans le kit pour ajouter délicatement, mais rapidement et d'un seul mouvement, 0,5 millilitre de milieu de mise en culture dans la cuvette.Ensuite, récupérez le volume de la même manière et déposez-le goutte à goutte dans la plaque 12 puits contenant les iDR4 et le milieu de culture. Placez la boîte de culture sur une étagère de l’incubateur et déplacez-la lentement d’avant en arrière et de côté à côté afin de répartir uniformément la suspension cellulaire. Incubez la boîte pendant 24 heures avant de changer le milieu.Deux à trois jours après la transfection, commencer la sélection. Aspirer le milieu, laver les cellules avec 1 millilitre de PBS, puis ajouter du milieu pour cellules souches embryonnaires humaines contenant 100 nanogrammes par millilitre de puromycine. Observer la croissance cellulaire et augmenter la concentration de puromycine en conséquence, jusqu'à un maximum de 250 nanogrammes par millilitre, en poursuivant la sélection par la puromycine pendant sept jours.Après trois à quatre jours de sélection à la puromycine, commencer la sélection avec 0,5 micromolaire de fialuridine ou FIAU. Changer le milieu quotidiennement et maintenir le FIAU pendant un maximum de sept jours consécutifs. Après la fin de la sélection, vers les jours 14 à 15, des colonies RMCE résistantes seront présentes et constitueront la nouvelle lignée RMCE.Diviser les cellules selon un rapport de 1:2 en suivant les procédures standard. Lorsque les puits du point clé 1 sont prêts à être divisés, dissocier le puits destiné à la caractérisation en une suspension monocellulaire comme décrit précédemment dans la vidéo et recueillir les cellules dans un tube de 15 millilitres. Centrifuger les cellules à 300 ×g à température ambiante pendant cinq minutes.Ensuite, utilisez un millilitre de PBS pour resuspendre les cellules et diviser l'échantillon en deux. L'un est filtré à l'aide d'un tamis cellulaire pour réaliser la cytométrie en flux et l'autre pour l'analyse de l'ADN selon le protocole décrit dans le texte. Après transfection avec la recombinase flippase et le donneur RMCE tdT, les hPSC ont formé de petits groupes de cellules uniformément répartis sur la couche de MEF iDR4 et exprimé de manière constitutive la GFP ainsi que le tdT de façon transitoire.La sélection positive à la puromycine favorise l’insertion du donneur RMCE, puis la sélection négative à l’FIAU sélectionne uniquement les événements de recombinaison médiés par FRT et dépourvus de TK. Vers le sixième jour après la transfection, de petits groupes de cellules RMCE négatives pour la GFP et positives pour la tdT peuvent être identifiés. Comme illustré ici, les colonies RMCE négatives pour la GFP et positives pour la tdT sont présentes uniquement lorsque le donneur RMCE et la flippase sont utilisés simultanément, tandis que le RMCE n’a pas lieu en l’absence de flippase. La caractérisation par cytométrie en flux des nouvelles lignées RMCE, constituées des colonies résistantes à la puromycine et à l’FIAU, combinées en une population cellulaire non clonale, confirme que 100 % des cellules présentent le phénotype RMCE négatif pour la GFP et positif pour la tdT.Lorsque des donneurs RMCE sans activité de registreur dans les hPSC sont utilisés, 100 % des cellules sont négatives pour la GFP. La caractérisation par PCR présentée ici de la lignée RMCE non clonale démontre l'échange complet du cassette et que le programme de sélection utilisé produit des lignées exemptes d'intégration aléatoire, tant du donneur RMCE que du vecteur exprimant la flippase. En résumé, cette méthode RMCE simplifie considérablement l'édition génique dans les hPSC pour un locus défini, par rapport aux nucléases ciblées.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 15 jours. Par conséquent, l'ERM est un outil d'édition génique très rapide qui permettra des études comparatives dans un contexte isogénique. Lors de l'utilisation de cette procédure, il est important d'obtenir des efficacités de transfection supérieures à 30 % et de réaliser une sélection appropriée avec l'agent de sélection du noyau.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment réaliser une RMCE au niveau du locus AAVS1 des CSP humaines et comment caractériser la lignée recombinante.

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