Visualisation et analyse quantitative de l'angiogenèse embryonnaire dans Xenopus tropicalis
May 25th, 2017
Ce protocole démontre une méthode à base de fluorescence pour visualiser le système vasculaire et pour quantifier sa complexité chez Xenopus tropicalis . Les vaisseaux sanguins peuvent être imagés quelques minutes après l'injection d'un colorant fluorescent dans le coeur battant d'un embryon après des manipulations génétiques et / ou pharmacologiques pour étudier le développement cardiovasculaire in vivo .
L’objectif global de cette procédure est de visualiser le système vasculaire des têtards de Xenopus tropicalis. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cardiovasculaire, telles que la régulation de l’angiogenèse. Le principal avantage de cette technique est que les vaisseaux sanguins d’un embryon intact de type puits peuvent être visualisés par une simple injection de colorant fluorescent.
Commencez par utiliser un micro-chargeur pour remplir une micro-pipette en verre effilé avec environ cinq microlitres de solution LDL acétylée diI claire, en veillant à ce qu’aucune particule précipitée ne soit chargée. Sous un microscope à dissection, utilisez une fine paire de pinces numéro 55 pour couper l’extrémité de la pipette afin d’ajuster le volume du complexe téléchargé et réglez le système d’injection à pression contrôlée pour éjecter environ cinq nanolitres de solution par injection. Ensuite, immergez la pointe de la pipette dans 0,04 % de MS-222 dans une solution saline de Barth modifiée 0,1X ou un MBS dans un moule Sylgard sur mesure.
Ensuite, transférez l’embryon de Xenopus tropicalis dans le moule Sylgard et confirmez la sédation complète avec une absence de réponse à la stimulation de la nageoire dorsale. Sous le microscope de dissection, chargez l’embryon face ventrale vers le haut dans l’indentation en forme de V du moule dans une position légèrement oblique. Ajustez bien deux broches minutieuses de 0,1 millimètre à un porte-épingle et utilisez une goupille pour percer la peau du cœur qui doit pulser visiblement.
Insérez la goupille dans le trou de l’espace entre le cœur et la peau sans perforer le cœur et positionnez l’embout inséré dans la région où l’incision sera pratiquée. Frottez ensuite la deuxième goupille contre la goupille insérée pour faire une incision linéaire et utilisez les deux broches ensemble pour élargir doucement l’incision, exposant le cœur. Pour injecter la solution de LDL acétylé DiI, insérez l’embout de pipette en verre dans le cœur et injectez 50 à 60 nanolitres de LDL acétylé DiI en environ 10 impulsions d’éjection.
Lorsque toute la solution de colorant a été administrée, confirmez que le cœur bat toujours et transférez l’embryon dans une nouvelle boîte de Pétri contenant 0,1 fois le MBS. Après cinq à 10 minutes, le têtard devrait se remettre de l’anesthésie et commencer à bouger. Après qu’un nombre approprié d’embryons a été injecté, examinez visuellement les embryons anesthésiés correctement étiquetés au microscope à fluorescence, en éliminant tous les animaux dont d’autres organes ont été marqués.
Les embryons qui n’ont pas été suffisamment marqués peuvent être injectés à nouveau. Capturez ensuite des images des embryons correctement étiquetés. Pour une imagerie plus poussée des vaisseaux sanguins, fixer les embryons anesthésiés dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant une heure à température ambiante à l’abri de la lumière pour une visualisation par microscopie confocale.
Si une quantité suffisante de LDL diI acétylé est injectée dans le cœur, la veine cardinale postérieure, ou PCV, devrait être immédiatement visible au microscope à fluorescence. Les veines intersomitiques, ou ISV, émergent dorsalement du PCV dans une onde antérieure à postérieure commençant au stade 36 et se terminant vers les stades 40 à 41, devenant légèrement ramifiées vers le stade 43. Le PCV et les ISV se développent selon un schéma angiogénique stéréotypé qui est sous un contrôle étroit du développement.
Il est intéressant de noter que l’inhibition de la signalisation TIE-2 par les morphalinos antisens diminue la longueur et la complexité des ISV, tandis que l’expression de la forme constitutivement active de TIE-2 induit une ramification excessive des ISV. Un indice de complexité veineuse peut être calculé pour évaluer la complexité des ISV et des chemins rendus peuvent être générés pour visualiser l’architecture globale du système vasculaire embryonnaire de Xenopus tropicalis. Le protocole original a été décrit pour l’utilisation de Xenopus laevis par Levin et Colics et nous l’avons adapté pour Xenopus tropicalis.
Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si elle est exécutée correctement. Avant cette procédure, des manipulations génétiques et pharmacologiques peuvent être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que les gènes et les voies de signalisation qui régulent le développement vasculaire. Grâce à cette procédure, le système vasculaire marqué peut être imagé chez un animal intact en temps réel, ce qui constitue un outil puissant pour étudier la dynamique du développement vasculaire.
Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’injecter du LDL acétylé dans le cœur d’un têtard de Xenopus tropicalis pour visualiser son système vasculaire.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Aperçu
Ce protocole démontre une méthode basée sur la fluorescence pour visualiser le vasculature et quantifier sa complexité chez Xenopus tropicalis. La technique permet l'imagerie des vaisseaux sanguins peu après l'injection d'un colorant fluorescent dans le cœur de l'embryon, facilitant les études sur le développement cardiovasculaire in vivo.
Composants clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cardiovasculaire
- Angiogénèse
- Biologie du développement
Contexte
- Xenopus tropicalis est un organisme modèle pour étudier le développement des vertébrés.
- Comprendre le développement vasculaire est crucial pour mieux comprendre diverses maladies.
- Les techniques d'imagerie fluorescente améliorent la visualisation des structures biologiques.
- Cette méthode permet l'observation en temps réel des changements vasculaires.
Objectif de l'étude
- Visualiser le vasculature des têtards de Xenopus tropicalis.
- Investiguer la régulation de l'angiogenèse.
- Fournir une méthode simple et efficace pour étudier le développement cardiovasculaire.
Méthodes utilisées
- Injection d'un colorant fluorescent dans le cœur de l'embryon.
- Utilisation d'un micro chargeur et d'une micro pipette en verre effilée pour une livraison précise du colorant.
- Visualisation des vaisseaux sanguins sous un microscope de dissection.
- Application de manipulations génétiques et pharmacologiques pour étudier les effets sur le vasculature.
Principaux résultats
- Visualisation réussie des vaisseaux sanguins dans des embryons intacts.
- Quantification de la complexité vasculaire réalisée par imagerie.
- Aperçus obtenus sur la dynamique du développement cardiovasculaire.
- Efficacité démontrée de la méthode d'injection de colorant fluorescent.
Conclusions
- Le protocole fournit une méthode fiable pour étudier le développement vasculaire.
- L'imagerie fluorescente est un outil puissant pour l'analyse en temps réel.
- Cette approche peut faciliter d'autres recherches en biologie cardiovasculaire.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
This method enables direct visualization and quantification of vascular complexity in a vertebrate model, supporting early-stage target validation in angiogenesis pathways. By providing quantitative readouts of vessel sprouting and branching, it facilitates mechanistic de-risking of vascular targets before committing to lead identification campaigns. The Xenopus tropicalis system offers a disease-relevant platform for assessing angiogenic phenotypes with predictive confidence in preclinical cardiovascular research.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses regarding angiogenic regulators such as TIE-2 signaling through direct observation of vessel sprouting patterns.
- Operational Value: Provides a rapid, one-week workflow to assess gene or pathway impact on vascular development without requiring genetically engineered models.
- Predictive Value: Quantifiable outputs like the Vein Complexity Index support objective assessment of target modulation effects for portfolio triage decisions.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates standardized, reproducible vascular labeling compatible with downstream imaging and analysis pipelines.
- Quantitative Output: Enables measurement of intersomitic vein length and branching complexity as dose-responsive readouts for compound screening.
- Scalability: Simple dye injection and imaging procedure supports medium-throughput evaluation of pharmacological or genetic perturbations.
Translational & Preclinical Research
- Disease Relevance: Models stereotypic angiogenesis in Xenopus tropicalis, offering insight into human vascular development pathways.
- Translational Continuity: Connects early discovery findings to preclinical validation through conserved angiogenic mechanisms.
- Mechanistic De-risking: Allows rapid testing of pathway modulators to clarify target biology before investing in mammalian model studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification, providing vascular phenotype data that informs go/no-go decisions in angiogenesis-focused programs.
- Discovery Biology: Supports pathway clarification by linking genetic or pharmacological perturbations to quantifiable changes in vascular architecture.
- Screening: Delivers reproducible, imaging-based readouts suitable for evaluating compound effects on angiogenic sprouting.
- Analytics: Provides quantitative vascular complexity metrics that enable objective comparison across experimental conditions.
- Translational Research: Leverages conserved angiogenesis mechanisms to support continuity from embryonic models to mammalian vascular systems.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable vascular phenotyping platform applicable across multiple angiogenesis target projects.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Reduces mechanistic ambiguity in angiogenic target validation through direct, quantitative visualization of vascular networks.
- Operational Value: Standardizes vascular assessment via simple dye injection and reproducible imaging, minimizing inter-experiment variability.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of vascular targets, reducing late-stage failure risk in cardiovascular programs.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization of angiogenesis modifiers based on quantitative phenotypic outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microsurgical techniques for embryo handling and cardiac microinjection.
- Dependent on fluorescence microscopy infrastructure for vessel visualization and image capture.
- Necessitates standardization of embryo staging and injection timing for consistent vascular labeling.
- Involves adaptation considerations when extending findings to other model systems or human relevance contexts.
- Practical limitations include reliance on embryonic accessibility and the need for careful optimization of dye concentration to avoid non-specific labeling.
