Visualisation et analyse quantitative de l'angiogenèse embryonnaire dans
25 mai 2017
Ce protocole démontre une méthode à base de fluorescence pour visualiser le système vasculaire et pour quantifier sa complexité chez Xenopus tropicalis . Les vaisseaux sanguins peuvent être imagés quelques minutes après l'injection d'un colorant fluorescent dans le coeur battant d'un embryon après des manipulations génétiques et / ou pharmacologiques pour étudier le développement cardiovasculaire in vivo .
L'objectif général de cette procédure est de visualiser le système vasculaire des têtards de Xenopus tropicalis. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cardiovasculaire, comme la régulation de l'angiogenèse. Le principal avantage de cette technique réside dans la possibilité de visualiser les vaisseaux sanguins d'un embryon entier de type sauvage intact par une simple injection de colorant fluorescent.
Commencez par utiliser un micro-chargeur pour remplir une micropipette en verre effilée avec environ cinq microlitres de solution de LDL marquée au diI acétylé claire, en prenant soin de ne pas charger de particules précipitées. Sous un microscope stéréo, utilisez une paire de fines pinces n°55 pour couper l'extrémité de la pipette afin d'ajuster le volume du complexe chargé et réglez le système d'injection contrôlé par pression pour éjecter environ cinq nanolitres de solution par injection. Ensuite, immergez l'extrémité de la pipette dans du MS-222 à 0,04 % dans du tampon salin de Barth modifié 0,1X ou MBS, contenu dans un moule en Sylgard sur mesure.
Transférez ensuite l'embryon de Xenopus tropicalis dans le moule en Sylgard et confirmez la sédation complète par l'absence de réponse à la stimulation de la nageoire dorsale. Sous le microscope stéréoscopique, placez l'embryon, côté ventral vers le haut, dans l'encoche en forme de V du moule, en position légèrement oblique. Insérez fermement deux épingles minutieuses de 0,1 millimètre dans un support d'épingles et utilisez une épingle pour percer la peau au-dessus du cœur, qui doit être visiblement pulsant.
Insérez l'aiguille à travers le trou situé dans l'espace entre le cœur et la peau sans percer le cœur, et positionnez la pointe insérée dans la région où sera faite l'incision. Faites ensuite glisser la deuxième aiguille contre la première pour réaliser une incision linéaire, puis utilisez les deux aiguilles ensemble pour élargir doucement l'incision, exposant ainsi le cœur. Pour injecter la solution de LDL acétylée marquée au DiI, insérez la pointe de la pipette en verre dans le cœur et injectez entre 50 et 60 nanolitres de LDL acétylée marquée au DiI en environ 10 impulsions d'éjection.
Lorsque toute la solution de colorant a été administrée, vérifiez que le cœur bat encore et transférez l'embryon dans une nouvelle boîte de Pétri contenant du MBS à 0,1X. Après cinq à dix minutes, le têtard devrait se réveiller de l'anesthésie et commencer à bouger. Une fois qu'un nombre suffisant d'embryons a été injecté, examinez visuellement les embryons anesthésiés correctement étiquetés au microscope à fluorescence, en écartant les individus dont d'autres organes sont marqués.
Les embryons qui ont été insuffisamment marqués peuvent être injectés à nouveau. Ensuite, capturer des images des embryons correctement marqués. Pour une observation plus complète des vaisseaux sanguins, fixer les embryons réanesthésiés dans du paraformaldéhyde 4 % pendant une heure à température ambiante, à l'abri de la lumière, en vue d'une visualisation par microscopie confocale.
Si une quantité suffisante de LDL acétylé diI est injectée dans le cœur, la veine cardinale postérieure, ou VCP, doit devenir immédiatement visible au microscope à fluorescence. Les veines inter-somitiques, ou VIS, émergent de façon dorsale à partir de la VCP selon une progression antéro-postérieure commençant au stade 36 et se terminant vers les stades 40 à 41, devenant légèrement ramifiées vers le stade 43. La VCP et les VIS se développent selon un schéma angiogénique stéréotypé soumis à un contrôle développemental strict.
De manière intéressante, l'inhibition de la signalisation de TIE-2 par des morpholinos antisens diminue la longueur et la complexité des vaisseaux intersegmentaires (ISV), tandis que l'expression de la forme constitutivement active de TIE-2 induit un ramification excessive des ISV. Un indice de complexité veineuse peut être calculé pour évaluer la complexité des ISV, et des trajets rendus peuvent être générés afin de visualiser l'architecture globale du système vasculaire de l'embryon de Xenopus tropicalis. Le protocole original a été décrit pour l'utilisation de Xenopus laevis par Levin et Colics, et nous l'avons adapté à Xenopus tropicalis.
Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en une heure si elle est correctement exécutée. Avant cette procédure, des manipulations génétiques et pharmacologiques peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme par exemple quels gènes et voies de signalisation régulent le développement vasculaire. Grâce à cette procédure, la vascularisation marquée peut être observée en temps réel chez un animal intact, offrant ainsi un outil puissant pour étudier la dynamique du développement vasculaire.
Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment injecter la LDL marquée au diI acétylé dans le cœur d'une larve de Xenopus tropicalis afin de visualiser son système vasculaire.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Ce protocole décrit une méthode basée sur la fluorescence permettant de visualiser le système vasculaire et de quantifier sa complexité chez Xenopus tropicalis. Cette technique permet l'imagerie des vaisseaux sanguins peu de temps après l'injection d'un colorant fluorescent dans le cœur de l'embryon, facilitant ainsi l'étude du développement cardiovasculaire in vivo.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie cardiovasculaire
- Angiogenèse
- Biologie du développement
Contexte
- Xenopus tropicalis est un organisme modèle pour l'étude du développement vertébré.
- Comprendre le développement vasculaire est essentiel pour obtenir des informations sur diverses maladies.
- Les techniques d'imagerie fluorescente améliorent la visualisation des structures biologiques.
- Cette méthode permet l'observation en temps réel des modifications vasculaires.
Objectif de l'étude
- Visualiser le système vasculaire des têtards de Xenopus tropicalis.
- Étudier la régulation de l'angiogenèse.
- Fournir une méthode simple et efficace pour l'étude du développement cardiovasculaire.
Méthodes utilisées
- Injection d'un colorant fluorescent dans le cœur de l'embryon.
- Utilisation d'un micro-chargeur et d'une micropipette en verre effilée pour une délivrance précise du colorant.
- Visualisation des vaisseaux sanguins au microscope stéréoscopique.
- Application de manipulations génétiques et pharmacologiques pour étudier leurs effets sur la vascularisation.
Résultats principaux
- Visualisation réussie des vaisseaux sanguins dans des embryons intacts.
- Quantification de la complexité vasculaire obtenue par imagerie.
- Apercus obtenus sur la dynamique du développement cardiovasculaire.
- Efficacité démontrée de la méthode d'injection de colorant fluorescent.
Conclusions
- Le protocole fournit une méthode fiable pour l'étude du développement vasculaire.
- L'imagerie fluorescente est un outil puissant pour l'analyse en temps réel.
- Cette approche peut faciliter des recherches supplémentaires en biologie cardiovasculaire.
Questions fréquemment posées
Pertinence industrielle pour les cadres
Cette méthode permet une visualisation directe et une quantification de la complexité vasculaire dans un modèle de vertébré, soutenant la validation précoce de cibles dans les voies d'angiogenèse. En fournissant des mesures quantitatives de la formation de bourgeons vasculaires et du ramification, elle facilite l'analyse mécanistique et la réduction des risques associés aux cibles vasculaires avant d'engager des campagnes d'identification de composés leaders. Le système Xenopus tropicalis offre une plateforme pertinente pour évaluer des phénotypes angiogéniques avec une confiance prédictive dans la recherche cardiovasculaire préclinique.
Applications stratégiques en recherche et développement en biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Valeur scientifique : Permet d'interroger des hypothèses thérapeutiques concernant les régulateurs angiogéniques, tels que la signalisation de TIE-2, grâce à l'observation directe des motifs de bourgeonnement vasculaire.
- Valeur opérationnelle : Offre un flux de travail rapide, d'une semaine, pour évaluer l'impact d'un gène ou d'une voie sur le développement vasculaire, sans nécessiter de modèles génétiquement modifiés.
- Valeur prédictive : Des sorties quantifiables telles que l'indice de complexité veineuse permettent une évaluation objective des effets de la modulation de cibles, en appui aux décisions de tri des projets.
Développement de criblages et de tests
- Prêt-à-l’emploi du test : Génère un marquage vasculaire standardisé et reproductible, compatible avec les pipelines d’imagerie et d’analyse en aval.
- Données quantitatives : Permet la mesure de la longueur des veines intersomitiques et de la complexité des branchements comme paramètres sensibles à la dose pour le criblage de composés.
- Extensibilité : Une procédure simple d’injection de colorant et d’imagerie permet une évaluation à débit moyen de perturbations pharmacologiques ou génétiques.
Recherche translationnelle et préclinique
- Pertinence pour les maladies : Modélise l'angiogenèse stéréotypique chez Xenopus tropicalis, offrant un aperçu des voies du développement vasculaire humain.
- Continuité translationnelle : Relie les découvertes initiales à la validation préclinique grâce à des mécanismes angiogéniques conservés.
- Réduction des risques mécanistiques : Permet de tester rapidement des modulateurs de voies afin de clarifier la biologie cible avant d'investir dans des études sur des modèles mammaliens.
Intégration du pipeline et du flux de travail
La méthode s'inscrit dans le continuum de découverte allant du test d'hypothèses sur une cible jusqu'à l'identification d'un composé précurseur, en fournissant des données sur le phénotype vasculaire qui éclairent les décisions d'aller ou de ne pas aller plus loin dans les programmes centrés sur l'angiogenèse.
- Biologie de la découverte : Facilite l'élucidation des voies biologiques en reliant des perturbations génétiques ou pharmacologiques à des modifications quantifiables de l'architecture vasculaire.
- Criblage : Fournit des lectures reproductibles basées sur l'imagerie, adaptées à l'évaluation des effets de composés sur la formation de nouveaux vaisseaux sanguins.
- Analytique : Propose des métriques quantitatives de la complexité vasculaire permettant des comparaisons objectives entre différentes conditions expérimentales.
- Recherche translationnelle : S'appuie sur des mécanismes d'angiogenèse conservés pour assurer une continuité entre les modèles embryonnaires et les systèmes vasculaires des mammifères.
- Réutilisation en entreprise : Met en place une plateforme reutilisable de phénotypage vasculaire applicable à plusieurs projets ciblant l'angiogenèse.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Réduit l'ambiguïté mécanistique dans la validation des cibles angiogéniques grâce à une visualisation directe et quantitative des réseaux vasculaires.
- Valeur opérationnelle : Standardise l'évaluation vasculaire par une simple injection de colorant et un imagerie reproductible, minimisant ainsi la variabilité entre expériences.
- Valeur stratégique : Améliore l'efficacité du capital en permettant une réduction précoce des risques associés aux cibles vasculaires, diminuant le risque d'échec en phase avancée des programmes cardiovasculaires.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des modulateurs de l'angiogenèse en se basant sur des résultats phénotypiques quantitatifs.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en techniques de microchirurgie pour la manipulation des embryons et l'injection cardiaque microchirurgicale.
- Dépend d'une infrastructure de microscopie à fluorescence pour la visualisation des vaisseaux et la capture d'images.
- Exige une standardisation du stade embryonnaire et du moment des injections afin d'obtenir un marquage vasculaire reproductible.
- Implique des considérations d'adaptation lors de l'extrapolation des résultats à d'autres systèmes modèles ou à des contextes de pertinence humaine.
- Les limites pratiques incluent la dépendance à l'égard de l'accès aux embryons et la nécessité d'une optimisation rigoureuse de la concentration du colorant afin d'éviter un marquage non spécifique.
