Évaluation de la complexité dendritique de l'hippocampe chez les souris vieillies utilisant la méthode de Golgi-Cox

L’objectif global de cette méthodologie est de colorer correctement le tissu cérébral de Golgi afin d’examiner et de quantifier la morphologie et la complexité dendritiques. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en neurosciences. Étant donné que la coloration de Golgi ne colore qu’un petit sous-ensemble de cellules, cette technique pourrait être utilisée pour tracer la structure des neurones.

Le principal avantage de cette technique est que les sections du cerveau peuvent être facilement tachées sans risque de se dessécher ou de tomber pendant l’une des étapes de lavage. Fred Kiffer, Tyler Alexander et Julie Anderson, étudiants diplômés dans le laboratoire du Dr Allen, feront la démonstration de la procédure. Commencez par immerger des demi-cerveaux de rongeurs fraîchement récoltés et non fixés dans cinq millilitres ou une solution à base de chlorure mercurique.

Comme la solution de chlorure mercurique est sensible à la lumière, couvrez le tube d’une feuille d’aluminium. Conservez les échantillons dans l’obscurité et à température ambiante. Le lendemain, décantez lentement la solution dans un récipient temporaire avant de la jeter correctement dans un conteneur de déchets biologiques.

Ajoutez cinq millilitres de solution fraîche de chlorure mercurique et assurez-vous que le cerveau est immergé. Remettez les échantillons dans l’obscurité à température ambiante pendant 13 jours supplémentaires. Après 14 jours, préparez le tampon de post-imprégnation en ajoutant 30 grammes de tampon de post-imprégnation alimenté à 90 millilitres d’eau distillée ou désionisée, DH2O.

Remplissez chaque puits de la plaque à six puits avec 6,5 millilitres de tampon de post-imprégnation, un puits par cerveau. Ensuite, retirez la solution de chlorure mercurique du tissu cérébral comme précédemment. Rincez le tissu avec du DH2O, puis transférez le tissu sur les plaques à six puits avec un tampon de post-imprégnation.

Couvrez les assiettes de papier d’aluminium et conservez-les à température ambiante dans l’obscurité. Le lendemain, aspirez et remplacez le tampon de post-imprégnation. Couvrez à nouveau l’assiette et conservez-la dans un réfrigérateur à quatre degrés Celsius.

Préparez deux ou trois plaques de 12 puits par cerveau en étiquetant d’abord les plaques sur leurs couvercles avec des numéros dans l’ordre croissant de gauche à droite et de haut en bas. Ajoutez le numéro d’identification du cerveau sectionné. Pipetez deux millilitres de 1X PBS dans chaque puits de chaque plaque, puis installez la platine et allumez le vibratome.

Ensuite, mettez du ruban adhésif sur le bloc de tissu du porte-échantillon et ajoutez un peu de colle cyanoacrylate sur le dessus. Retirez un cerveau de la plaque à six puits et placez-le sur un plat en plastique ou en verre. Utilisez une lame à double tranchant en acier inoxydable pour couper le cervelet dans le sens caudal, en vous assurant que la partie du cervelet restant sur le cerveau est plate.

Ensuite, placez la surface plane du cervelet restant sur la colle. Une fois la colle sèche, placez le porte-échantillon avec le tissu dans le bain d’échantillons. Placez le bain d’échantillon sur le vibratome et recouvrez l’échantillon de tissu de PBS.

Ensuite, fixez la lame au porte-lame du vibratome et abaissez lentement la lame dans le bain d’échantillon jusqu’à ce qu’elle soit complètement immergée et légèrement en dessous du haut du tissu. Ensuite, réglez la vitesse du vibratome sur sept, l’amplitude sur six et l’angle de coupe sur 12 degrés. Démarrez la vibration et coupez des sections de 200 microns.

À l’aide d’un grand pinceau, déplacez les sections de tissu du bain d’échantillon dans chaque puits désigné des plaques à 12 puits. Continuez à couper le tissu jusqu’à ce que le nombre souhaité de sections de tissu soit atteint. Après la section, utilisez une pipette de transfert pour aspirer le PBS des puits de la plaque à 12 puits, puis ajoutez deux millilitres de PBS-T et lavez pendant 30 minutes en agitant.

Vers la fin de la période de lavage, diluez trois parties de solution d’hydroxyde d’ammonium avec cinq parties de DH2O. Ensuite, après avoir retiré le PBS-T, ajoutez la solution d’hydroxyde d’ammonium diluée. Protégez de la lumière à l’aide d’une feuille d’aluminium et teignez les sections pendant 19 à 21 minutes.

Ensuite, après avoir retiré en toute sécurité la solution d’hydroxyde d’ammonium, ajoutez un tampon de post-coloration. Protéger avec du papier d’aluminium et tacher pendant encore 19 à 21 minutes. Enfin, rincez les sections dans PBS-T trois fois pendant cinq à 10 minutes à chaque fois.

Montez les sections sur des lames recouvertes de gélatine à 1 % avec le grand pinceau. Laissez-les sécher pendant 20 à 30 minutes à température ambiante, puis placez-les dans un bocal Coplin et laissez-les reposer toute la nuit. Retirez les lames du bocal Coplin et placez-les dans une grille en plastique dans la hotte.

Placer dans un plat de coloration contenant 100 % d’éthanol pendant cinq minutes. Déshydratez les sections en deux autres lavages à l’éthanol de cinq minutes. Ensuite, placez les lames dans un support en verre et utilisez une poignée en métal pour abaisser le support dans un plat de coloration en verre contenant 99 % de xylène.

Lavez les lames en deux changements de xylène pendant cinq minutes chacune. Une fois le temps écoulé pour le deuxième lavage, retirez les lames du xylène une par une et couvrez rapidement le tissu avec environ 0,25 millilitre de support de montage. Ensuite, prenez un couvercle de diapositive et posez-le sur le support.

Poussez toutes les bulles d’air emprisonnées sous les couvercles de diapositives vers le bord avec un objet contondant, tel que l’extrémité du pinceau. Placez les lames dans un endroit à l’abri de la lumière directe du soleil et laissez-les sécher pendant deux à trois jours. Après le séchage, procédez à l’acquisition de l’image à l’aide d’un microscope et à l’analyse avec le logiciel approprié.

Cette image en fond clair montre un neurone coloré par Golgi qui répond aux critères d’imagerie et d’analyse plus approfondie. Les trois types de colonne vertébrale sont facilement visibles. La coloration est constante sur toute la longueur de la dendrite et la dendrite est isolée des autres neurones.

Cette figure montre que les neurones colorés de Golgi dans le gyrus denté ont montré une diminution de la longueur aux quatrième et sixième ordres après un traitement au 5-fluorouracile par rapport au groupe traité au sérum physiologique. La coloration de Golgi peut être utilisée pour détecter des différences significatives dans la densité de la colonne vertébrale. Dans les dendrites pyramidales apicales CA1, l’administration de 5-fluorouracile à des souris vivantes a considérablement diminué la densité de la colonne vertébrale.

Dans les dendrites basales, il n’y a pas eu de changements significatifs dans la densité globale des épines. L’analyse par sholl des dendrites pyramidales apicales CA1 a révélé que le traitement au 5-fluorouracile diminuait significativement l’arborisation dendritique à des distances comprises entre 40 et 160 microns du soma. Dans les dendrites basales, le traitement au 5-fluorouracile a diminué l’arborisation dendritique de 30 à 110 microns du soma.

Une fois maîtrisée, cette technique, qui tient compte à la fois du processus de coloration de Golgi et du montage, du nettoyage et du revêtement, peut être effectuée en trois heures par cerveau si elle est effectuée correctement. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la neurobiologie pour explorer les connexions neuroanatomiques dans un modèle murin. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de ne conserver les sections dans une solution d’hydroxyde d’ammonium que pendant 19 à 21 minutes afin de ne pas trop colorer les neurones.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de colorer, sectionner et rincer correctement les tissus cérébraux. N’oubliez pas que travailler avec la solution à base de chlorure mercurique, la solution d’hydroxyde d’ammonium et le xylène peut être extrêmement dangereux, alors prenez des précautions et portez des gants de laboratoire et travaillez dans une hotte lorsque vous effectuez cette procédure.