Évaluation de la densité de la Synapse dans des tranches de cerveau de rongeurs hippocampe

L’objectif global de ce protocole d’immunomarquage est d’évaluer la densité synaptique dans des tranches de cerveau ex vivo. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences et est utile lors de l’étude des changements de densité des synapses, comme observé dans les maladies neurodégénératives. Le principal avantage de cette technique est qu’elle fournit une estimation semi-quantitative de la densité des synapses, qui peut être comparée entre des conditions expérimentales préparées en même temps.

Commencez par placer le cerveau de la souris sur une boîte de Pétri. Ensuite, retirez le cervelet et une petite section du cortex frontal à l’aide d’un scalpel, avant d’effectuer une héliscection sur la ligne médiane du cerveau. Retournez un hémisphère du côté qui vient d’être coupé et collez-le sur la platine d’un vibratome.

Versez de l’ACSF glacé dans la chambre du microtome et oxygénez la solution. Coupez des sections de 200 à 300 microns d’épaisseur de la région d’intérêt complète. Pour l’hippocampe, il faut obtenir environ trois à quatre tranches par hémisphère.

À l’aide d’une pipette Pasteur en plastique, transférez les tranches dans une chambre à température contrôlée immergée dans de l’ACSF oxygéné. Maintenir à 34 degrés Celsius pendant 30 minutes. Après 30 minutes, transférez les tranches dans une plaque à 24 puits contenant 4 % de paraformaldéhyde avec 4 % de saccharose, et fixez pendant 20 minutes à une heure à température ambiante.

Après la fixation, lavez les tranches trois fois dans 1x PBS pendant 10 minutes à chaque fois. Pour commencer la coloration immunofluorescente, remplacez le PBS dans les puits de tranche par un tampon de blocage et de perméabilisation, et incubez à température ambiante pendant quatre à six heures sur l’agitateur. Vers la fin de l’étape de blocage, diluez l’anticorps à vGlut1 de un à 2 000 dans un tampon de blocage et de perméabilisation.

Veuillez noter que cette dilution peut différer selon l’entreprise et le lot de l’anticorps utilisé. Incuber les tranches dans la solution d’anticorps primaire pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Utilisez une plate-forme secouante avec des mouvements vigoureux.

Une distribution uniforme des anticorps primaires et secondaires est importante pour une coloration optimale. D’après notre expérience, une agitation vigoureuse permet la meilleure pénétration de l’anticorps. Après l’incubation dans l’anticorps primaire, lavez les tranches trois fois dans du PBS pendant 10 minutes à chaque fois, comme précédemment.

Lors du dernier lavage, diluez les anticorps secondaires appropriés de un à 500 dans un tampon de blocage. Ensuite, incubez les tranches dans cette solution pendant deux à trois heures à température ambiante. Assurez-vous que les tranches sont protégées de la lumière, car les anticorps secondaires sont sensibles à la lumière.

Après avoir lavé les tranches, comme précédemment, utilisez une brosse pour retirer soigneusement les tranches de la plaque à 24 puits et placez-les uniformément sur des lames de verre pré-étiquetées. Ajoutez une goutte de support de montage sur chaque tranche. Et puis, placez délicatement une lamelle en verre sur les tranches, en prenant soin d’éviter la formation de bulles d’air.

Protégez-les de la lumière et laissez sécher les lames pendant au moins trois à quatre jours à température ambiante. Stockez les lames à quatre degrés Celsius à court terme. Mais pour un stockage à long terme, conservez-les à moins 20 degrés Celsius.

Commencez par utiliser un objectif 10x ou 20x pour identifier la région de l’hippocampe à imager, dans ce cas, les synapses entre les neurones pyramidaux CA1 et les axones collatéraux de Schaffer. Passez à un objectif d’immersion dans l’huile 40x ou 63x et assurez-vous que l’anatomie de la tranche est intacte en identifiant les neurites continues et une structure organisée. Utilisez un marqueur neuronal, tel que MAP2, comme référence.

Ajustez les paramètres de chaque canal pour obtenir un signal et un contraste optimaux avec une résolution de 1 024 x 1 024 pixels. Réglez l’intensité de chaque laser pour éviter la saturation des pixels. Évaluez la profondeur à laquelle la coloration est uniforme, puis réglez le logiciel pour qu’il acquière des piles d’images d’au moins huit plans équidistants de 250 nanomètres.

Ensuite, prenez trois piles d’images représentatives adjacentes de la même zone d’intérêt par tranche. Répétez l’acquisition dans au moins trois tranches par condition et de six à huit animaux par groupe de traitement. Les synapses excitatrices peuvent être identifiées par colocalisation entre vGlut1 et PSD95, comme l’indiquent les flèches blanches dans l’image à fort grossissement.

Le blocage de la signalisation Wnt dans l’hippocampe adulte en induisant l’antagoniste Wnt Dkk1 déclenche une perte de synapse excitatrice, en particulier dans la couche radiatum CA1. Le pourcentage de synapses excitatrices entre les souris témoins et les souris iDkk1 a été quantifié et s’est avéré significativement plus faible chez les animaux transgéniques iDkk1. Les synapses inhibitrices peuvent être identifiées par la colocalisation entre vGat et Gephyrin.

Le pourcentage de synapses inhibitrices entre les souris témoins et les souris iDkk1 a été quantifié, et aucune différence significative n’a été détectée. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de ne pas oublier de faire autant attention que possible avec les tranches. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’évaluer la densité synaptique dans des tranches de cerveau ex vivo.