Imagerie Neurones dans les sections du cerveau épais Utilisation du Golgi-Cox Méthode

L'objectif général de cette procédure est de déterminer le traitement efficace sur la morphologie des neurones dans le cerveau du rongeur. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que la morphologie normale et modifiée expérimentalement des neurones dans différentes régions du cerveau du rongeur. Cette technique présente l'avantage principal d'augmenter la probabilité d'identifier et de visualiser des neurones marqués qui sont entièrement contenus dans des échantillons histologiques uniques.

Commencez la coloration Golgi-Cox en plaçant un cerveau frais de souris dans un flacon en verre de 20 millilitres contenant 17 millilitres de solution Golgi-Cox. Protégez de la lumière et incubez à température ambiante pendant 25 jours. Une fois la période d'incubation terminée, cryoprotégez le cerveau en le plaçant dans 40 millilitres de cryoprotecteur au saccharose, puis incubez à l'obscurité à 4 degrés Celsius pendant 24 heures.

Après l'incubation dans le saccharose, le cerveau peut être congelé pour un stockage à long terme ou immédiatement découpé pour la sectionnement, comme indiqué dans la section suivante de la vidéo. En cas de congélation, plongez l'ensemble du cerveau dans 200 millilitres d'isopentane prérefroidi sur de la glace sèche. Ensuite, placez le cerveau congelé dans un tube conique de 50 millilitres et conservez-le à l'abri de la lumière à moins 80 degrés Celsius.

Pour commencer, retirez le cerveau du saccharose. Utilisez une lame de rasoir pour le bloquer en vue de la coupe, en sectionnant le cervelet de manière à laisser une surface plane à l'extrémité caudale restante du cerveau. Le cerveau doit être bloqué selon un angle précis afin de garantir que les neurones d'intérêt soient entièrement inclus dans les sections obtenues.

Par exemple, nous utilisons un plan coronal parfaitement perpendiculaire à l'axe rostro-caudal pour les neurones pyramidaux du cortex cérébral. Ensuite, chauffez l'agar jusqu'à ce qu'il soit fondu. Et laissez-le refroidir jusqu'à ce qu'il soit légèrement au-dessus de son point de fusion.

Ensuite, placer le cerveau dans un petit plat de pesée jetable, l'extrémité caudale vers le bas. Ajouter de l'agar fondu pour recouvrir le cerveau. Une fois que l'agar est solidifié, retirer l'excédent de manière à laisser environ deux à quatre millilitres d'agar autour du cerveau.

Ensuite, utilisez une petite quantité de cyanoacrylate d'éthyle pour coller le cerveau sur la platine d'un vibratome, avec son extrémité caudale orientée vers le bas. Remplissez la zone de la platine du vibratome avec suffisamment de cryoprotectant au saccharose pour recouvrir entièrement le cerveau. Procédez ensuite à la sectionnement du cerveau avec une épaisseur de tranches comprise entre 400 et 500 microns, selon la région cérébrale à examiner.

À l’aide d’un petit pinceau, déposer les sections cérébrales dans les puits d’une plaque de culture tissulaire à six puits contenant des inserts à fond de maille et préremplis avec un tampon phosphate de saccharose M. Protéger de la lumière pendant la section. Une fois la section terminée, incuber les sections à l’abri de la lumière à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

À l’aide des inserts à fond en treillis, transférer les sections cérébrales dans un nouveau puits contenant cinq millilitres de paraformaldéhyde dans un tampon phosphate. Incuber sur un agitateur à vitesse lente, à température ambiante et à l’abri de la lumière pendant 15 minutes. Laver les sections deux fois en les transférant dans des puits neufs contenant cinq millilitres d’eau.

Protéger de la lumière et laver à vitesse modérée à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, transférer les sections dans un nouveau puits contenant cinq millilitres d'hydroxyde d'ammonium. Agiter lentement à l'abri de la lumière à température ambiante pendant 15 minutes.

Lavez les sections deux fois en les transférant dans de nouveaux puits contenant cinq millilitres d'eau. Effectuez le lavage sur un agitateur à vitesse modérée, à l'obscurité et à température ambiante, pendant cinq minutes. Transférez les sections dans un nouveau puits contenant cinq millilitres de fixateur A dilué. Incubez sur un agitateur à vitesse lente, à l'obscurité et à température ambiante, pendant 25 minutes.

Laver les sections dans l'eau deux fois comme précédemment. Utiliser un petit pinceau pour placer les sections sur une lame de microscope, puis utiliser des pinces et un petit morceau de papier essuie-tout pour éliminer l'excès d'eau et d'agar. S'assurer que tout l'agar a été retiré avant de passer aux étapes de déshydratation.

Laisser sécher les sections à l'air à température ambiante, à l'abri de la lumière. La durée de séchage appropriée est critique et doit être déterminée pour chaque laboratoire. Un temps trop court peut entraîner la chute des sections des lames lors des étapes de déshydratation, tandis qu'un temps trop long peut provoquer des fissures dans les sections.

Après séchage, placez d'abord les lames dans l'agent de clarification pendant cinq minutes. Plongez les lames dans de l'éthanol à 100 % pendant cinq minutes. Puis faites-les passer successivement dans des concentrations décroissantes d'éthanol, deux minutes chacune.

Après la série alcoolique, placer les lames dans l'eau pendant cinq minutes. Ensuite, colorer avec du violet de crésyle à 0,5 % dans l'eau pendant sept minutes. Après la coloration au violet de crésyle, placer les lames dans l'eau pendant deux minutes.

Ensuite, déshydratez les sections à l'aide d'une série d'alcools de concentrations croissantes pendant deux minutes chacune. Puis effectuez deux lavages dans de l'éthanol à 100 % pendant cinq minutes. Placez dans un agent de clarification pendant cinq minutes.

Ajouter enfin un milieu de montage anhydre et poser une lamelle sur les sections. Laisser sécher les lames horizontalement à l'abri de la lumière à température ambiante pendant au moins cinq jours. Pour acquérir des séries d'images haute résolution de la zone contenant le neurone d'intérêt, sélectionner d'abord un objectif à immersion dans l'huile de silicone de 30X avec une ouverture numérique de 1,05 sur le microscope.

Appliquez ensuite trois à quatre gouttes d'huile à immersion au silicone sur la lame. Placez l'objectif au-dessus de la lame en veillant à ce qu'il y ait contact entre l'objectif et l'huile. Mettez au point l'image et ajustez les paramètres de la caméra, notamment l'exposition et la balance des blancs, dans le logiciel d'acquisition d'images.

Définissez ensuite les limites supérieure et inférieure de la pile d'images en mettant au point sur le haut de la section, puis en sélectionnant « définir » à côté de « haut de la pile » dans la fenêtre d'acquisition d'image. Mettez ensuite au point sur le bas de la section et sélectionnez « définir » à côté de « bas de la pile ». Réglez la distance de pas à un micron en entrant un micron à côté de « distance entre les images » dans la fenêtre d'acquisition d'image.

Enfin, capturer la pile d'images en sélectionnant l'acquisition de la pile d'images dans la fenêtre d'acquisition d'image. Répéter les étapes précédentes afin de capturer toute la zone d'intérêt, en veillant à ce que toutes les piles d'images se chevauchent d'au moins 10 % selon les axes X et Y. Cette image du cortex cérébral correspond à une projection Z fusionnée de piles d'images acquises à partir d'une section de 500 microns d'épaisseur à l'aide d'un objectif 10X.

Le tissu présenté sur cette image a été traité selon le protocole principal tout frais. La zone indiquée par le carré rouge a été imagée à l’aide d’un objectif à immersion dans l’huile de silicone 30X, et un empilement d’images en projection Z fusionnée à haute résolution a été acquis. La flèche rouge montre la projection Z en deux dimensions d’un neurone qui a été tracé à partir de l’empilement d’images haute résolution 30X.

Ici, la variante fraîche du protocole avec coloration au violet de crésyl a été utilisée. Cette image à plus haute résolution montre la coupe colorée au violet de crésyl. Et ceci est le tracé des neurones obtenu.

Enfin, ce tissu a été traité selon la variante de protocole dans laquelle les cerveaux sont congelés après l'imprégnation au Golgi-Cox. Ici, le tissu précédemment congelé est observé avec une résolution plus élevée. Et une fois encore, une projection Z bidimensionnelle de haute qualité du tracé du neurone est obtenue.

Cette technique peut être réalisée en un mois, les étapes de traitement et d'imagerie étant effectuées au cours de la dernière semaine. Les cerveaux peuvent également être congelés après l'imprégnation au Golgi-Cox, ce qui permet d'effectuer ultérieurement le traitement et l'imagerie. Après cette procédure, les neuroscientifiques peuvent utiliser les images obtenues pour réaliser des analyses morphologiques détaillées, telles que la complexité des dendrites ou la densité des épines, afin de déterminer comment une manipulation expérimentale peut modifier la structure des neurones dans le cerveau.