Imagerie Neurones dans les sections du cerveau épais Utilisation du Golgi-Cox Méthode

L’objectif global de cette procédure est de déterminer le traitement efficace sur la morphologie des neurones dans le cerveau des rongeurs. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des neurosciences, telles que la morphologie normale et manipulée expérimentalement des neurones dans diverses régions du cerveau des rongeurs. Cette technique présente le principal avantage d’augmenter la probabilité d’identifier et de visualiser des neurones marqués qui sont entièrement contenus dans des échantillons histologiques uniques.

Commencez la coloration Golgi-Cox en plaçant un cerveau de souris frais dans un flacon à scintillation en verre de 20 millilitres contenant 17 millilitres de solution Golgi-Cox. Protéger de la lumière et incuber à température ambiante pendant 25 jours. Une fois la période d’incubation écoulée, Cryo protège le cerveau en le plaçant dans 40 millilitres de cryoprotecteur de saccharose, et incube dans l’obscurité à 4 degrés Celsius pendant 24 heures.

Après l’incubation dans du saccharose, le cerveau peut être congelé pour un stockage à long terme, ou immédiatement bloqué pour la section, comme le montre la section suivante de la vidéo. En cas de congélation, immergez tout le cerveau dans 200 millilitres d’isopentane pré-refroidi sur de la glace sèche. Placez ensuite le cerveau congelé dans un tube conique de 50 millilitres et conservez-le dans l’obscurité à moins 80 degrés Celsius.

Pour commencer, retirez le cerveau du saccharose. Et utilisez une lame de rasoir pour le bloquer pour la section en coupant le cervelet, laissant un bord plat à l’extrémité caudale restante du cerveau. Le cerveau doit être bloqué à un angle précis pour s’assurer que les neurones d’intérêt sont entièrement contenus dans les sections résultantes.

Par exemple, nous utilisons un plan coronal parfaitement perpendiculaire à l’axe caudal rostral pour les neurones pyramidaux du cortex cérébral. Ensuite, faites chauffer la gélose jusqu’à ce qu’elle soit fondue. Et laissez-le refroidir jusqu’à ce qu’il soit légèrement au-dessus de son point de fusion.

Placez ensuite le cerveau dans un petit plat de pesée jetable avec l’extrémité caudale vers le bas. Ajouter de la gélose fondue pour couvrir le cerveau. Une fois que la gélose s’est solidifiée, coupez l’excédent en laissant environ deux à quatre millilitres autour du cerveau.

Ensuite, utilisez une petite quantité de cyanoacrylate d’éthyle pour coller le cerveau à l’étape d’un vibratome avec son extrémité caudale face vers le bas. Remplissez la zone de la scène du vibratome avec suffisamment de cryoprotecteur de saccharose pour couvrir le cerveau. Ensuite, sectionnez le cerveau à une épaisseur de tranche de 400 à 500 microns selon la région du cerveau à examiner.

À l’aide d’un petit pinceau, placez des sections de cerveau dans les puits d’une plaque de culture tissulaire à six puits contenant des inserts inférieurs en maille et préremplie de tampon de phosphate de saccharose M. Protéger de la lumière pendant le sectionnement. Une fois la section terminée, incubez les sections dans l’obscurité à quatre degrés Celsius pendant la nuit.

À l’aide des inserts inférieurs en maille, transférez les sections cérébrales dans un nouveau puits contenant cinq millilitres de paraformaldéhyde dans un tampon de phosphate. Incuber sur une bascule se déplaçant à vitesse lente à température ambiante dans l’obscurité pendant 15 minutes. Lavez les sections deux fois en les transférant dans de nouveaux puits contenant cinq millilitres d’eau.

Protéger de la lumière et laver à vitesse modérée à température ambiante pendant cinq minutes. Ensuite, transférez les sections dans un nouveau puits contenant cinq millilitres d’hydroxyde d’ammonium. Balancez-vous lentement dans l’obscurité à température ambiante pendant 15 minutes.

Lavez les sections deux fois en les transférant dans de nouveaux puits contenant cinq millilitres d’eau. Lavez sur une bascule se déplaçant à vitesse modérée dans l’obscurité à température ambiante pendant cinq minutes. Transférez les sections dans un nouveau puits contenant cinq millilitres de fixateur A. Incubez sur une bascule se déplaçant à vitesse lente dans l’obscurité à température ambiante pendant 25 minutes.

Lavez les sections à l’eau deux fois comme avant. Utilisez un petit pinceau pour placer les sections sur une lame de microscope, puis utilisez une pince à épiler et un petit mouchoir pour enlever l’excès d’eau et de gélose. Assurez-vous que toute la gélose est retirée avant de procéder aux étapes de déshydratation.

Laissez les sections sécher à l’air libre à température ambiante à l’abri de la lumière. Le temps de séchage approprié est essentiel et doit être déterminé pour chaque laboratoire. Un temps trop court peut entraîner la chute de sections des lames pendant les étapes de déshydratation, et un temps trop long peut entraîner la fissuration de sections.

Après le séchage, placez d’abord les lames dans un agent nettoyant pendant cinq minutes. Placez les lames dans de l’éthanol à 100 % pendant cinq minutes. Ensuite, passez par une série de concentrations décroissantes d’éthanol pendant deux minutes chacune.

Après la série d’alcool, placez les lames dans l’eau pendant cinq minutes. Ensuite, colorez avec du violet crésylique à 0,5 % dans de l’eau pendant sept minutes. Après la coloration au violet crésyl, placez les lames dans l’eau pendant deux minutes.

Ensuite, déshydratez les sections à travers une série de concentrations d’alcool croissantes pendant deux minutes chacune. Ensuite, deux lavages à 100 % éthanol pendant cinq minutes. Placez dans l’agent nettoyant pendant cinq minutes.

Enfin, ajoutez un support de montage anhydre et placez une lamelle sur les sections. Laissez les lames sécher horizontalement dans l’obscurité à température ambiante pendant au moins cinq jours. Pour capturer des piles d’images haute résolution de la zone contenant le neurone d’intérêt, sélectionnez d’abord un objectif d’immersion d’huile de silicone 30X 1,05 NA sur le microscope.

Appliquez ensuite trois à quatre gouttes d’huile d’immersion de silicone sur la lame. Placez l’objectif sur la glissière, en assurant le contact entre l’objectif et l’huile. Faites la mise au point de l’image et ajustez les paramètres de l’appareil photo, y compris l’exposition et la balance des blancs dans le logiciel d’imagerie.

Définissez ensuite les limites supérieure et inférieure de la pile d’images en vous concentrant sur le haut de la section, puis en sélectionnant Définir en regard du haut de la pile dans la fenêtre d’acquisition d’images. Ensuite, concentrez-vous sur le bas de la section et sélectionnez définir en regard du bas de la pile. Réglez la distance de pas à un micron en saisissant un micron à côté de la distance entre les images dans la fenêtre d’acquisition d’image.

Enfin, capturez la pile d’images en sélectionnant Acquérir la pile d’images dans la fenêtre d’acquisition d’images. Répétez les étapes précédentes pour capturer toute la zone d’intérêt, en vous assurant que toutes les piles d’images se chevauchent d’au moins 10 % sur les axes X et Y. Cette image du cortex cérébral est une projection Z fusionnée d’empilements d’images acquises à partir d’une section de 500 microns d’épaisseur à l’aide d’un objectif 10X.

Le tissu de cette image a été traité à l’aide du protocole principal All Fresh. La zone indiquée par le carré rouge a été imagée à l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile de silicium 30X et une pile d’images de projection Z fusionnée de plus haute résolution a été acquise. La flèche rouge montre la projection Z bidimensionnelle d’un neurone qui a été tracée à partir de la pile d’images haute résolution 30X.

Ici, la variante de protocole fraîche avec coloration au violet crésyl a été utilisée. Cette image à plus haute résolution montre la section colorée en violet crésyl. Et c’est le tracé des neurones obtenu.

Enfin, ce tissu a été traité à l’aide de la variante du protocole dans laquelle les cerveaux sont congelés après imprégnation de Golgi-Cox. Ici, le tissu précédemment congelé est vu à une résolution plus élevée. Et une fois de plus, une projection Z bidimensionnelle de haute qualité du tracé des neurones est obtenue.

Cette technique peut être réalisée en un mois et les étapes de traitement et d’imagerie peuvent être achevées au cours de la dernière semaine. Les cerveaux peuvent également être congelés après l’imprégnation de Golgi-Cox, ce qui permet de terminer le traitement et l’imagerie à une date ultérieure. À la suite de cette procédure, les neuroscientifiques peuvent utiliser les images capturées pour effectuer des analyses morphologiques détaillées telles que la complexité des dendrites ou la densité de la colonne vertébrale afin de déterminer comment une manipulation expérimentale peut modifier la structure des neurones dans le cerveau.