Différenciation des chondrocytes provenant des cellules souches pluripotentes induites par le sang périphérique dérivé du sang

L’objectif global de cette procédure est de générer des cellules de lignée chondrogénique à partir de cellules souches pluripotentes induites dérivées du sang périphérique humain, ou cellules IPS. Cette méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de la régénération du cartilage sur l’utilisation de cellules sanguines périphériques dérivées de patients en tant que cellules C pour la génération de cellules IPS pour la réparation du cartilage. Les principaux avantages de cette technique sont qu’elle est facilement reproductible et que la différenciation des chondrocytes se produit dans des conditions sériques et sans xéno.

Commencez par plaquer des cellules IPS humaines dans un milieu IPSC humain de quatre millilitres sur une boîte de culture tissulaire de 60 millimètres contenant une monocouche de cellules nourricières de fibroblastes embryonnaires de souris irradiées. Cultivez les cellules à 37 degrés Celsius dans cinq pour cent de dioxyde de carbone. Lorsque les cellules souches sont confluentes à 80 à 90 pour cent, dissociez les cellules avec une solution de dispace pour la sous-culture.

Après deux à trois passages, utilisez une aiguille de verre dessinée au feu pour disséquer la colonie IPSC indifférenciée confluente de 80 à 90 pour cent en fragments plus petits, et ne transférez pas plus de 100 morceaux de culture cellulaire dans une nouvelle boîte de Pétri non adhérente de 100 millimètres contenant 10 millilitres de milieu de formation de corps embryoïde. La dissociation mécanique est meilleure que la digestion automatique car elle réduit les dommages cellulaires à de petits fragments de cellules à transférer dans le nouveau récipient de culture, et annonce l’élimination manuelle des cellules nourricières, qui répriment la différenciation des cellules IPS humaines. Retournez les cellules IPS humaines dans l’incubateur de culture cellulaire.

Après deux jours, inclinez la parabole pour laisser les corps embryoïdes se déposer, et remplacez soigneusement trois millilitres de milieu de formation du corps embryoïde par quatre millilitres de milieu de culture basal frais. Après 10 jours, des corps embryoïdes se seront formés. Enduire un nouveau plat de 100 millimètres de quatre millilitres de gélatine à 0,1 % pendant 30 minutes à 37 degrés Celsius.

Transférez les corps embryoïdes avec le surnageant dans un tube conique de 15 millilitres et laissez les corps se déposer pendant quatre à cinq minutes. Aspirez tous les 0,5 millilitres de milieu sauf les derniers et remettez en suspension les corps embryoïdes dans 10 millilitres de milieu de culture basal frais. Lorsque la gélatine s’est solidifiée, jetez la gélatine.

Ensuite, ensemencez les cellules dans la boîte recouverte de gélatine et placez la boîte dans l’incubateur de culture cellulaire. Après 10 jours de culture, les corps embryoïdes se seront différenciés en excroissances cellulaires fibroblastiques. Pour induire la différenciation des chondrocytes, lavez la culture avec du DPBS et détachez les cellules avec trois millilitres de trypsine EDTA à 0,25 % à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Lorsque les cellules se sont soulevées du bas de la plaque, neutralisez la réaction avec quatre millilitres de milieu de culture basal frais et titrez doucement la culture cinq à dix fois. Filtrez la suspension cellulaire à travers une crépine en maille de nylon de 70 microns et collectez les cellules par centrifugation. Ensuite, ensemencez les cellules sur une nouvelle plaque de 100 millimètres recouverte de gélatine dans 10 millilitres de milieu de culture basal frais.

Lorsque la culture atteint 90 à 100 % de confluence, récoltez les cellules avec trois millilitres de trypsine EDTA à 0,25 %, comme cela vient d’être démontré pour le comptage. Transférez une partie trois fois 10 à la cinquième aliquote de cellules dans un tube en polypropylène de 15 millilitres pour la centrifugation. Et remettre en suspension la pastille dans un millilitre de milieu de différenciation chondrogénique.

Ensuite, centrifugez à nouveau les cellules et placez le tube dans l’incubateur de culture cellulaire pendant 21 jours sans déranger la pastille. Les cellules chondrogéniques peuvent s’assembler in vitro, produisant des paramètres extracellulaires caractéristiques dans des conditions de culture à haute densité. Après 21 jours de culture, une pastille chondrogénique de cellules IPS humaines se sera formée.

Après 21 jours de culture, les cellules chondrogéniques IPSC humaines sont positives pour le bleu d’alcian et la toluidine dans la coloration bleue, indiquant une différenciation chondrogénique réussie de la pastille HIPSC. L’analyse immunohistochimique du collagène 2 et du collagène 10 confirme leur phénotype de type chondrocytaire. L’analyse des glycosaminoglycanes sulfatés révèle que la teneur en glycosaminoglycanes sulfatés des cellules est significativement régulée à la hausse dans les pastilles chondrogéniques IPSC humaines, par rapport aux cellules humaines de type fibroblastique IPSC, aux corps embryoïdes et aux cellules IPS humaines indifférenciées.

De plus, les cellules chondrogéniques IPSC humaines présentent un niveau élevé d’expression génique de la lignée des chondrogènes et des marqueurs chondrocytaires entièrement différenciés, suggérant la réalisation d’une différenciation chondrogénique réussie. Méthode de culture en plusieurs étapes utilisée pour différencier les IPSC humaines en chondrocytes, y compris la différenciation spontanée par la formation d’EB, l’excroissance cellulaire à partir d’EB, la culture cellulaire monocouche après la culture cellulaire et la culture de granulés 3D. Le phénotype des chondrocytes est évalué par analyse histologique, analyse biochimique et expression génique chondrogénique.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’utiliser une méthode de culture en plusieurs étapes pour induire la différenciation des cellules IPS humaines en chondrocytes. Cette technique pourrait être plus spécifique au patient et plus rentable.