Différenciation dirigée de cellules endothéliales hémogéniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines
31 mars 2021
Présenté ici est un protocole simple pour la différenciation dirigée des cellules endothéliales hémogènes à partir de cellules souches pluripotentes humaines en environ 1 semaine.
Ce protocole détaille une méthode pour générer une population bien caractérisée de cellules endothéliales hémogènes humaines. Ces cellules peuvent être utilisées pour étudier la régulation moléculaire et la transition endothéliale-hématopoïétique. Commencez par cultiver des cellules souches embryonnaires humaines pendant quatre jours pour les différencier en cellules endothéliales primordiales.
Le cinquième jour, aspirez le milieu au-dessus des cellules. Ensuite, lavez doucement les cellules avec un millilitre de DMEM / F-12 par puits. Ajouter un millilitre de milieu de différenciation des cellules endothéliales hémogènes fraîchement préparé par puits et incuber les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.
Le sixième et le septième jour, remplacez le milieu au-dessus des cellules par un millilitre de milieu de différenciation des cellules endothéliales homogènes fraîchement préparé par puits, et incuber les cellules pendant 24 heures supplémentaires. Le huitième jour. Après avoir détaché et lavé les cellules, divisez-les uniformément en tubes de microcentrifugeuses sur de la glace, chacun contenant un minimum de 600 microlitres de cellules à une densité de 1 fois 10 à la 5ème cellule par millilitre.
Ajouter des anticorps aux tubes contenant les cellules, le cas échéant, et incuber sur de la glace à l’abri de la lumière pendant 30 minutes. Enduire les cellules par centrifugation à 1000 fois G et 4 degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et remettez les granulés en suspension dans 600 microlitres de tampon de tri glacé.
Filtrer les échantillons à travers le capuchon filtrant des tubes FACS de cinq millilitres et stocker les cellules sur de la glace à l’abri de la lumière pour un tri cellulaire immédiat. Pour isoler les cellules endothéliales hémogènes par FACS, commencez par la population de cellules CD45 négatives. Ensuite, au sein de la population CD45-négative, porte les cellules CD31-positives.
Suivant dans la population CD31-positive, porte pour la population de cellules VE-cadhérine-négative. Et puis au sein de la population VE-cadhérine-négative, porte pour les cellules c-Kit-positives. De la population c-Kit-positive, porte la population de cellules CD34-positives.
Et enfin, à partir de la population de cellules CD34-positives, identifier et collecter les cellules KDR-positives. Après l’ensemencement des cellules endothéliales hémogènes dans un milieu à base de méthylcellulose formulé pour la croissance des cellules progénitrices hématopoïétiques, les colonies d’unités érythroïdes formant des colonies et les colonies d’unités érythroïdes formant des explosions sont comptées au huitième jour. Unité formant colonie-granulocytes-macrophages et unité formant colonie-granulocytes, érythroïdes, macrophages et mégacaryocytes.
Les colonies progénitrices hématopoïétiques multipotentes sont comptées au jour 14. Pour 1000 cellules endothéliales hémogènes plaquées, environ 20 unités formant colonie sont générées. Les cellules ayant une morphologie de cellules endothéliales sont également visibles dans les cultures.
Ce sont les cellules endothéliales hémogènes qui donnent naissance à des progéniteurs hématopoïétiques multilignés au niveau unicellulaire. Ce protocole est un système de culture 2D sans sérum et sans alimentation murine qui peut générer des cellules endothéliales hémogènes humaines en une semaine environ.
Consultez la transcription complète et accédez à des milliers de vidéos scientifiques
Aperçu
Cet article présente un protocole détaillé pour obtenir des cellules endothéliales hémogènes à partir de cellules souches embryonnaires humaines en environ une semaine. La méthode permet aux chercheurs de générer une population bien caractérisée de ces cellules, essentielles pour l'étude de la transition endothéliale vers hématopoïétique, et possédant des applications potentielles en médecine régénérative et dans la production de dérivés sanguins.
Composantes clés de l'étude
Domaine scientifique
- Biologie des cellules souches
- Biologie vasculaire
- Hématopoïèse
- Ingénierie tissulaire
Contexte
- Les vaisseaux sanguins sont essentiels au fonctionnement des tissus et sont tapissés de cellules endothéliales vasculaires.
- Les cellules endothéliales hématogènes sont un sous-type spécialisé qui donne naissance aux cellules souches et progénitrices hématopoïétiques pendant le développement.
- La génération de ces cellules in vitro est utile pour l'étude du développement des cellules sanguines et pour des applications thérapeutiques potentielles.
- Les protocoles existants de différenciation des cellules endothéliales ne permettent pas d'obtenir des cellules endothéliales hématogènes bien caractérisées à partir de cellules souches humaines.
Objectif de l'étude
- Établir un protocole reproductible pour générer des cellules endothéliales hématogènes à partir de cellules souches embryonnaires humaines.
- Permettre l'étude de la régulation moléculaire et de la transition endothéliale vers hématopoïétique in vitro.
- Fournir un système sans cellules nourricières et sans sérum, adapté aux applications en aval.
Méthodes utilisées
- Culture de cellules souches embryonnaires humaines et différenciation progressive sur huit jours.
- Induction des lignées mésodermiques et endothéliales à l'aide de facteurs de croissance spécifiques et de petites molécules (par exemple, inhibiteur de GSK3β, bFGF, BMP4, VEGF-A, acide rétinoïque).
- Cytométrie en flux (FACS) pour le tri séquentiel et l'isolement de cellules endothéliales hématogènes selon des marqueurs d'expression membranaire (CD45-, CD31+, VE-cadhérine-, c-Kit+, CD34+, KDR+).
- Évaluation fonctionnelle par des tests de formation de colonies en milieu à base de méthylcellulose afin d'analyser le potentiel hématopoïétique.
Résultats principaux
- Le protocole permet d'obtenir une population définie de cellules endothéliales hémogènes en une semaine.
- Environ 20 unités formant des colonies par 1000 cellules endothéliales hémogènes sont générées, ce qui indique un potentiel hématopoïétique élevé.
- Des colonies dérivées de progéniteurs hématopoïétiques érythroïdes et multipotents sont observées.
- La morphologie des cellules endothéliales est maintenue en culture, confirmant l'identité cellulaire.
Conclusions
- Ce protocole sans cellules nourricières ni sérum génère efficacement des cellules endothéliales hémogéniques humaines à partir de cellules souches embryonnaires.
- La méthode facilite l'étude in vitro de la transition endothéliale vers hématopoïétique et de sa régulation moléculaire.
- Elle offre une plateforme pour la production potentielle de produits sanguins ex vivo et réduit la dépendance aux donneurs humains.
Questions fréquemment posées
Pertinence professionnelle pour l'industrie
La différenciation dirigée de cellules endothéliales hématogènes à partir de cellules souches pluripotentes humaines répond à un goulot d'étranglement critique dans la modélisation du développement hématopoïétique et la génération de lignées sanguines ex vivo. Cette capacité permet une détection mécanistique des risques associés à la transition endothéliale-hématopoïétique et renforce la fiabilité prédictive des pipelines de thérapie cellulaire et de médecine régénérative en phase précoce. La conception du protocole, sans cellules nourricières ni sérum, améliore la reproductibilité et la montée en échelle pour les portefeuilles de recherche et développement industriels.
Applications stratégiques en recherche et développement biopharmaceutique
Début de la découverte et validation de la cible
- Permet l'analyse des voies moléculaires régissant la transition endothéliale-hématopoïétique.
- Permet la validation fonctionnelle des cibles pour les facteurs influençant la spécification de la lignée sanguine.
- Facilite la détection prédictive des risques associés aux cibles candidates dans le développement hématopoïétique.
Développement de tests et criblage
- Fournit une population cellulaire standardisée et bien caractérisée pour des tests fonctionnels en aval.
- Permet une évaluation quantitative de la formation de colonies hématopoïétiques à partir de progéniteurs définis.
- Permet un criblage reproductible de modulateurs influant sur le destin endothélial ou hématopoïétique.
Recherche translationnelle et préclinique
- Établit une plateforme pour modéliser in vitro des défauts hématopoïétiques pertinents pour la maladie.
- Permet une continuité entre la découverte et la validation préclinique de stratégies de production de cellules sanguines.
- Prend en charge l'avancement ajusté au risque de concepts thérapeutiques cellulaires.
Intégration des pipelines et des flux de travail
Ce protocole s'intègre à la continuité découverte-préclinique en permettant la génération robuste et l'isolement de cellules endothéliales hématogènes pour des études mécanistiques et des tests fonctionnels.
- Biologie de la découverte : Permet la vérification d'hypothèses sur la régulation moléculaire de l'émergence des lignées sanguines.
- Essais de dépistage : Fournit des résultats quantitatifs reproductibles en matière de formation de colonies pour des analyses comparatives.
- Analytique : Propose un tri par cytométrie en flux et une quantification des colonies pour des lectures objectives.
- Recherche translationnelle : Établit un lien entre la modélisation in vitro et l'évaluation préclinique du potentiel hématopoïétique.
- Réutilisation en milieu professionnel : Offre un système évolutif, sans cellules nourricières, adaptable à différentes lignées de cellules souches et modèles de maladies.
Impact opérationnel et organisationnel
- Valeur scientifique : Augmente la confiance prédictive dans la modélisation de la lignée hématopoïétique et la validation des cibles.
- Valeur opérationnelle : Améliore la standardisation, la reproductibilité et l'évolutivité des flux de travail de différenciation cellulaire.
- Valeur stratégique : Améliore la prise de décision « aller/ne pas aller » pour les programmes de thérapie cellulaire et de médecine régénérative.
- Impact sur le portefeuille : Permet une priorisation ajustée au risque des candidats thérapeutiques cellulaires en phase précoce.
Considérations relatives à la mise en œuvre
- Nécessite une expertise en culture de cellules souches pluripotentes humaines et en protocoles de différenciation.
- Exige un accès à un équipement de cytométrie en flux pour le tri cellulaire multiparamétrique.
- Implique une standardisation inter-équipes des stratégies de sélection des événements et de la quantification des colonies.
- Adaptable à diverses lignées de cellules souches humaines moyennant une optimisation du protocole.
- Dépend de panels d'anticorps validés et de tests fonctionnels basés sur la méthylcellulose.
