Name: Différenciation dirigée de cellules endothéliales hémogéniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-03-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 4 min 23 s
Description: Découvrez la différenciation de cellules endothéliales hémogéniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Cette méthode sans sérum ni cellules nourricières permet d'étudier la transition endothélio-hématopoïétique en une semaine.

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L’auteur n’a rien à divulguer.

Les étapes de production de cellules endothéliales hémogéniques à partir de cellules souches embryonnaires humaines en environ 1 semaine à l’aide d’un système de culture 2D murin sans alimentation et sans sérum (Figure 1) sont décrites. Ce protocole développe une méthode décrite par Sriram et al. (2015) pour obtenir des CE primordiales38. La nature primordiale et le potentiel de spécification des CD31+ CD45- EC sont démontrés en cultivant ces cel...

Les cellules endothéliales (CE) sont une population hétérogène de cellules qui remplissent de multiples fonctions dans tout le corps humain et dans les tissus modifiés. En plus de soutenir et de réguler d’autres types de cellules (c.-à-d. cardiomyocytes1, cellules ostéoblastiques2), ces fonctions comprennent la formation d’une barrière sélective entre le sang et les tissus et l’aide à la formation des tissus3. La différenciation des EC matures au cours du développement normal nécessite diverses voies de signalisation. Les CE primordiaux sont dérivés des progéniteurs du mésoderme, et sont ensuite spécifiés vers les phénotypes artériels, veineux, capillaires et lymphatiques matures4. En outre, un petit sous-ensemble de CE dans le sac vitellin extraembryonnaire et la région embryonnaire Aorte-Gonade-Mésonéphros (AGM) sont également spécifiés pour devenir des CE hémogènes, qui donnent naissance à des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC) qui migrent vers le foie fœtal et la moelle osseuse fœtale, où elles restent postnatales et génèrent tous les types de cellules sanguines tout au long de la vie4. La diversité des phénotypes EC est essentielle pour tout développement et entretien tissulaire.
Ainsi, les CE et leurs dérivés sont des composantes essentielles des études visant à modéliser et à élucider les mécanismes du développement humain et/ou des maladies, ainsi que les applications de la médecine régénérative et de l’ingénierie tissulaire 5,6,7,8. Cependant, la principale limite de ces types d’études est le manque de disponibilité des EC humaines primaires dans la quantité requise. Il a été estimé qu’un minimum de 3 x 108 EC serait nécessaire pour la majorité des applications thérapeutiques6. Pour résoudre ce problème, l’utilisation de cellules souches embryonnaires humaines (CSEh) et de cellules souches pluripotentes induites par l’homme (CSPhi) a été proposée en raison de leur potentiel de lignée diversifiée et de leur capacité à générer un grand nombre de descendants 6,9.
En effet, l’utilité des cellules dérivées des CSEh ou des CSPh a été démontrée dans de multiples études axées sur la modélisation de la maladie et le dépistage de médicaments10,11,12. La technologie Organ-on-a-Chip (OOC) a été utilisée pour récapituler plus fidèlement la physiologie du corps humain en intégrant des cellules et des tissus dans des échafaudages tridimensionnels. En outre, la connexion de plusieurs OOC individuels (un soi-disant corps ou humain sur puce, BOC / HOC) peut être réalisée via la microfluidique pour permettre la diaphonie entre les organes d’intérêt13,14,15. Les tissus de soutien, tels que le système vasculaire, sont des composants essentiels des COO et des BOC/HOC; L’incorporation du système vasculaire permet le transport des nutriments, de l’oxygène et des facteurs paracrines dans les tissus, favorisant ainsi le microenvironnement tissulaire spécifique requis 3,12. Ainsi, les méthodes de dérivation des CE humains matures, telles que les CE artérielles, veineuses, lymphatiques et hémogènes, sont cruciales pour faire progresser ces approches d’ingénierie tissulaire.
Plusieurs protocoles ont été publiés détaillant les étapes pour la dérivation des CE primordiales ou progénitrices humaines à partir de CSEh ou de CSPh 5,16,17,18,19,20,21,22,23,24,25,26 . Bon nombre de ces protocoles reposent sur la formation de corps embryoïdes (EB) ou la co-culture d’ESC/CSPi avec une couche nourricière murine de cellules stromales. Ces stratégies ont tendance à être difficiles et à prendre beaucoup de temps, avec de faibles rendements EC et/ou une contamination des CE humaines par des cellules murines. Les protocoles qui reposent strictement sur la culture 2D sans l’utilisation de cellules stromales nécessitent souvent de longues inductions, utilisent des combinaisons complexes de facteurs de croissance et / ou d’inhibiteurs pour l’induction, ont des périodes d’expansion prolongées après la séparation cellulaire, ou une combinaison de ces facteurs. L’avancement des connaissances sur les voies de signalisation et les facteurs impliqués dans la dérivation des types EC matures in vivo jette les bases d’un protocole de différenciation in vitro simple et robuste.
Auparavant, les rôles clés des voies de signalisation Notch et de l’acide rétinoïque (RA) dans la spécification des CE artérielles et hémogéniques murines, respectivement, au cours du développement ont été identifiés. La voie de signalisation Notch joue de multiples rôles dans la spécification et le maintien du phénotype EC artériel. Les travaux utilisant le modèle de vascularisation rétinienne murine ont identifié une voie dans laquelle la contrainte de cisaillement des fluides induit un axe de signalisation Notch-Cx37-p27, favorisant l’arrêt du cycle cellulaire G1, ce qui permet la spécification EC artérielle27. On a émis l’hypothèse que les états du cycle cellulaire jouent un rôle dans les décisions relatives au devenir cellulaire en fournissant des fenêtres d’opportunité distinctes dans lesquelles les cellules sont réceptives à certains signaux qui peuvent induire l’expression des gènes et des changements phénotypiques28. Cet arrêt G1 médié par Notch a permis l’expression de gènes enrichis en EC artériels, notamment ephrinB2, Cx40, DLL4, Notch1 et Notch 4 (examinés dans29,30). Il a également été démontré que la spécification CE hémogénique est encouragée in vivo via la signalisation RA31,32. Des études supplémentaires ont identifié que, en aval de la signalisation RA, l’expression de c-Kit et Notch régule p27, ce qui permet une spécification hémogénique dans le sac vitellin murin et AGM33. Les CE hémogènes murins peuvent être identifiés de manière minimale par l’expression des marqueurs endothéliaux (CD31, KDR) et hématopoïétiques (c-à-d. c-Kit, CD34)4. Enfin, les CE hémogènes subissent une transition endothéliale-hématopoïétique (EHT) pour former des HSPC, qui peuvent donner naissance à tous les types de cellules sanguines 4,34,35.
Des travaux récents ont testé si cette même hiérarchie de signalisation peut promouvoir la spécification EC hémogénique humaine. Pour ce faire, un protocole de culture 2D sans sérum et sans alimentation pour dériver des CE hémogènes à partir de CSEh a été développé, et ces CE hémogéniques ont été caractérisés au niveau cellulaire comme CD31+ KDR+ c-Kit + CD34+ VE-Cadhérine- CD45-. Cette étude a également tiré parti du rapporteur FUCCI (Fluorescent Ubiquitination Cell Cycle Indicator), qui identifie différents états du cycle cellulaire, en utilisant des CSEh H9 qui expriment la construction du rapporteur FUCCI (H9-FUCCI-hESC)36. Dans des études avec ces cellules, il a été démontré que la PR favorise l’arrêt précoce du cycle cellulaire G1 dans les CE, et que l’état G1 précoce permet une spécification hémogénique in vitro37. Ici, un protocole détaillé pour la différenciation de ces cellules endothéliales hémogènes humaines et des tests confirmant leur identité sont fournis. Cette méthode simple fournit un moyen utile de générer ce sous-ensemble spécialisé de CE pour de futures études sur les mécanismes du développement des cellules sanguines humaines.

<table><tbody><tr><td>Boîtes de 15 cm</td><td>Corning</td><td>430599</td><td>traitées pour la culture tissulaire</td></tr><tr><td>Boîtes de 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>traitées pour la culture tissulaire</td></tr><tr><td>Plaques 6 puits</td><td>Corning</td><td>3516</td><td>traitées pour la culture tissulaire</td></tr><tr><td>Réactif antimicrobien Nom de marque : Normocin</td><td>Invitrogen</td><td>ant-nr-1</td><td></td></tr><tr><td>bFGF</td><td>R& D systems</td><td>233-FB-025</td><td>à 50 ng/mL</td></tr><tr><td>BMP4</td><td>BioLegend</td><td>595202</td><td>utilisation à 25 ng/mL</td></tr><tr><td>d’albumine sérique bovine (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1600-1</td><td></td></tr><tr><td>Cell Detachment Solution Marque : Accutase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7920</td><td></td></tr><tr><td>Dimethyl Sulfoxide (DMSO)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>D2650-100mL</td><td></td></tr><tr><td>Dispase</td><td>Stemcell Technologies</td><td>7913</td><td></td></tr><tr><td>DLL4</td><td>R& D systèmes</td><td>1506-D4/CF</td><td>recombinant humain ; utilisation à 10 &mu ; g/mL</td></tr><tr><td>DMEM :F12</td><td>Gibco</td><td>11320-033</td><td></td></tr><tr><td>Sérum physiologique tamponné au phosphate (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de croissance des cellules endothéliales Nom de marque : EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit (EGM-2)</td><td>Lonza</td><td>CC-3162</td><td></td></tr><tr><td>Tubes FACS</td><td>Corning</td><td>352235</td><td>fond rond en polystyrène avec capuchon filtrant</td></tr><tr><td>Sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Gemini Bio</td><td>100-106</td><td></td></tr><tr><td>Fibronectine</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>33016015</td><td>utilisation à 4 &mu ; g/cm2</td></tr><tr><td>GSK3i/CHIR99021</td><td>Stemgent</td><td>04-0004-02</td><td>10 mM de stock ; utiliser à 5 &mu ; </td></tr><tr><td>M Hanks Solution saline équilibrée (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14175-095</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique (HCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144S-500</td><td></td></tr><tr><td>Protéine matricielle&nbsp ; Nom de marque : Matrigel</td><td>Corning</td><td>356230</td><td>Facteur de croissance réduit. Reportez-vous au certificat d’analyse du lot pour déterminer la concentration en protéines (Matrigel). Cette concentration est nécessaire pour calculer le volume de Matrigel qui contient 1 mg de protéines.</td></tr><tr><td>Milieu à base de méthylcellulose Nom de marque : MethoCult H4435 Enriched</td><td>Stemcell Technologies</td><td>4435</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de différenciation des cellules souches pluripotentes Nom de marque : STEMdiff APEL 2</td><td>Stemcell Technologies</td><td>5270</td><td></td></tr><tr><td>Cellules souches pluripotentes : H1, H9, H9-FUCCI</td><td>WiCell</td><td>WA09 (H9), WA01 (H1)</td><td>humain ; Les H9-FUCCI ont été obtenus dans le laboratoire du Dr Ludovic Vallier au Cambridge Stem Cell Institute</td></tr><tr><td>Protein-Free Hybridoma Medium (PFMH)</td><td>Gibco</td><td>12040077</td><td></td></tr><tr><td>Retinoic Acid</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R2625-50mg</td><td>utilisation à 0,5 &mu ; M</td></tr><tr><td>Reverse transcription master mix Nom de marque : iScript Reverse Transcription Supermix BioRad</td><td></td><td>1708840</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’extraction d’ARN Nom de marque : RNeasy Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>74104</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de sodium (NaOH)</td><td>Fisher Scientific</td><td>SS255-1</td><td></td></tr><tr><td>Milieu de croissance de cellules souches Nom de marque : mTeSR1</td><td>Stemcell Technologies</td><td>85850</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Green master mix Nom de marque : iTaq Universal SYBR Green Master Mix</td><td>BioRad</td><td>1725121</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25299956</td><td>0,25 %</td></tr><tr><td>VEGF165 (VEGF-A)</td><td>PeproTech</td><td>100-20</td><td>à utiliser à 50 ng/mL</td></tr><tr><td>&alpha ;-CD31-FITC</td><td>BioLegend</td><td>303104</td><td>2 &mu ; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha ;-CD34-Pacific Blue</td><td>BioLegend</td><td>343512</td><td>2 &mu ; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha ;-CD45-APC/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>304014</td><td>2 &mu ; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha ;-c-Kit-APC</td><td>BioLegend</td><td>313206</td><td>2 &mu ; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha ;-Flk-1-PE/Cy7</td><td>BioLegend</td><td>359911</td><td>2 &mu ; g/mL*</td></tr><tr><td>&alpha ;-VE-Cadherin-PE</td><td>BioLegend</td><td>348506</td><td>2 &mu ; g/mL*</td></tr><tr><td>* Les conjugués fluorescents d’anticorps doivent être optimisés en fonction du trieur de cellules utilisé. Les concentrations finales utilisées dans cette étude sont présentées ici.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

différenciation dirigée de cellules endothéliales hémogéniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Directed Differentiation of Hemogenic Endothelial Cells from Human Pluripotent Stem Cells

Les vaisseaux sanguins sont omniprésents dans tous les tissus du corps et remplissent diverses fonctions. Ainsi, la dérivation de cellules endothéliales vasculaires matures, qui tapissent les lumières des vaisseaux sanguins, à partir de cellules souches pluripotentes humaines est cruciale pour une multitude d’applications d’ingénierie tissulaire et de régénération. In vivo, les cellules endothéliales primordiales sont dérivées de la lignée mésodermique et sont spécifiées vers des sous-types spécifiques, y compris artériel, veineux, capillaire, hémogène et lymphatique. Les cellules endothéliales hémogènes présentent un intérêt particulier car, au cours du développement, elles donnent naissance à des cellules souches et progénitrices hématopoïétiques, qui génèrent ensuite toutes les lignées sanguines tout au long de la vie. Ainsi, la création d’un système pour générer des cellules endothéliales hémogènes in vitro fournirait l’occasion d’étudier la transition endothéliale-hématopoïétique et pourrait conduire à la production ex vivo de produits sanguins humains et à une réduction de la dépendance à l’égard des donneurs humains. Bien qu’il existe plusieurs protocoles pour la dérivation des cellules endothéliales progénitrices et primordiales, la génération de cellules endothéliales hémogènes bien caractérisées à partir de cellules souches humaines n’a pas été décrite. Ici, une méthode de dérivation de cellules endothéliales hémogènes à partir de cellules souches embryonnaires humaines en environ 1 semaine est présentée: un protocole de différenciation avec des cellules de stries primitives formées en réponse à l’inhibiteur de GSK3β (CHIR99021), puis induction de la lignée mésodermique médiée par le FGFb, suivie du développement des cellules endothéliales primordiales favorisé par BMP4 et VEGF-A, et enfin de la spécification des cellules endothéliales hémogènes induite par l’acide rétinoïque. Ce protocole produit une population bien définie de cellules endothéliales hémogènes qui peuvent être utilisées pour mieux comprendre leur régulation moléculaire et leur transition endothéliale-hématopoïétique, ce qui pourrait être appliqué à des applications thérapeutiques en aval.

La figure 1 présente un schéma décrivant la spécification des CE primordiales et des CE hémogènes à partir des CSEh, ainsi qu’une image représentative des cellules 24 h après le placage. Conformément aux spécifications, les EC primordiaux et les EC hémogènes sont purifiés FACS aux jours 5 et 8, respectivement. Les EC primordiaux sont définis comme CD31+ CD45- et les EC hémogènes sont définis comme CD31+ KDR+ c-Kit+ CD34+ VE-Cadhérine- CD45</su...

Présenté ici est un protocole simple pour la différenciation dirigée des cellules endothéliales hémogènes à partir de cellules souches pluripotentes humaines en environ 1 semaine.

Différenciation dirigée de cellules endothéliales hémogéniques à partir de cellules souches pluripotentes humaines

Blood vessels are ubiquitously distributed within all tissues of the body and perform diverse functions. Thus, derivation of mature vascular endothelial ...

Ce protocole détaille une méthode pour générer une population bien caractérisée de cellules endothéliales hémogènes humaines. Ces cellules peuvent être utilisées pour étudier la régulation moléculaire et la transition endothéliale-hématopoïétique. Commencez par cultiver des cellules souches embryonnaires humaines pendant quatre jours pour les différencier en cellules endothéliales primordiales.Le cinquième jour, aspirez le milieu au-dessus des cellules. Ensuite, lavez doucement les cellules avec un millilitre de DMEM / F-12 par puits. Ajouter un millilitre de milieu de différenciation des cellules endothéliales hémogènes fraîchement préparé par puits et incuber les cellules pendant 24 heures à 37 degrés Celsius et 5% de dioxyde de carbone.Le sixième et le septième jour, remplacez le milieu au-dessus des cellules par un millilitre de milieu de différenciation des cellules endothéliales homogènes fraîchement préparé par puits, et incuber les cellules pendant 24 heures supplémentaires. Le huitième jour. Après avoir détaché et lavé les cellules, divisez-les uniformément en tubes de microcentrifugeuses sur de la glace, chacun contenant un minimum de 600 microlitres de cellules à une densité de 1 fois 10 à la 5ème cellule par millilitre.Ajouter des anticorps aux tubes contenant les cellules, le cas échéant, et incuber sur de la glace à l’abri de la lumière pendant 30 minutes. Enduire les cellules par centrifugation à 1000 fois G et 4 degrés Celsius pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et remettez les granulés en suspension dans 600 microlitres de tampon de tri glacé.Filtrer les échantillons à travers le capuchon filtrant des tubes FACS de cinq millilitres et stocker les cellules sur de la glace à l’abri de la lumière pour un tri cellulaire immédiat. Pour isoler les cellules endothéliales hémogènes par FACS, commencez par la population de cellules CD45 négatives. Ensuite, au sein de la population CD45-négative, porte les cellules CD31-positives.Suivant dans la population CD31-positive, porte pour la population de cellules VE-cadhérine-négative. Et puis au sein de la population VE-cadhérine-négative, porte pour les cellules c-Kit-positives. De la population c-Kit-positive, porte la population de cellules CD34-positives.Et enfin, à partir de la population de cellules CD34-positives, identifier et collecter les cellules KDR-positives. Après l’ensemencement des cellules endothéliales hémogènes dans un milieu à base de méthylcellulose formulé pour la croissance des cellules progénitrices hématopoïétiques, les colonies d’unités érythroïdes formant des colonies et les colonies d’unités érythroïdes formant des explosions sont comptées au huitième jour. Unité formant colonie-granulocytes-macrophages et unité formant colonie-granulocytes, érythroïdes, macrophages et mégacaryocytes.Les colonies progénitrices hématopoïétiques multipotentes sont comptées au jour 14. Pour 1000 cellules endothéliales hémogènes plaquées, environ 20 unités formant colonie sont générées. Les cellules ayant une morphologie de cellules endothéliales sont également visibles dans les cultures.Ce sont les cellules endothéliales hémogènes qui donnent naissance à des progéniteurs hématopoïétiques multilignés au niveau unicellulaire. Ce protocole est un système de culture 2D sans sérum et sans alimentation murine qui peut générer des cellules endothéliales hémogènes humaines en une semaine environ.

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JoVE Journal

Developmental Biology

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