Name: Étude de lexpression génétique régulée par un cycle cellulaire par deux protocoles complémentaires de synchronisation cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-06T15:45:00.000+00:00
Duration: 12 min 2 s
Description: Découvrez deux protocoles de synchronisation cellulaire pour analyser l'expression génique spécifique au cycle cellulaire dans les cellules U2OS. Ces méthodes permettent d'étudier les événements transcriptionnels liés au cancer et aux traitements chimiothérapeutiques.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Nous remercions les membres des laboratoires Zubiaga et Altmeyer pour des discussions utiles et pour un soutien technique. Ce travail a été soutenu par des subventions du ministère espagnol (SAF2015-67562-R, MINECO / FEDER, UE), du gouvernement basque (IT634-13 et KK-2015/89) et de l&#39;Université du Pays Basque UPV / EHU ( UFI11 / 20).

1. Synchronisation cellulaire, libération et surveillance de la progression du cycle cellulaire <ol><li> Synchronisation à base de thymidine et de nododazole (Thy-Noc) et libération de cellules U2OS à partir de la mitose <ol><li> Préparer le milieu de culture cellulaire requis. Les cellules U2OS sont habituellement cultivées dans du milieu DMEM-Glutamine complété par 10% (vol / vol) FBS (facultatif: 1% de pénicilline / streptomycine). Effectuer toute la préparation et la manipulation du milieu dans des conditions stériles et réchauffer le support complémentaire (désormais appelé «support complet») à 37 ° C avant utilisation. </li><li> Graine 2 x 10 6 cellules U2OS par plat 100 mm dans 10 mL de milieu de culture complet. Pour calculer le nombre de vaisselles nécessaires, prenez en compte que chaque plat 100 mm fournit généralement suffisamment de cellules mitotiques pour recharger environ 5 puits d&#39;une plaque de 6 puits (0,2 à 0,25 x 10 6 cellules / puits) (voir la figure 1B ). Deux puits par point de temps sélectionné sont requisDans l&#39;expérience (1 puits pour l&#39;extraction de l&#39;ARN et 1 puits pour la surveillance du cycle cellulaire). En outre, un troisième puits peut être collecté par point de temps pour l&#39;analyse des protéines. REMARQUE: les cellules de plaque dans la soirée (vers 19 heures) afin que les étapes suivantes puissent être effectuées pendant les heures de travail les jours suivants. Inclure 2 puits supplémentaires de cellules de croissance asynchrone pour définir les paramètres de compensation d&#39;analyse FACS. </li><li> Laisser les cellules se fixer en incubant des plats de 100 mm à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO 2 pendant 24 h. </li><li> Pour le bloc de thymidine, préparer une solution mère de thymidine 200 mM en dissolvant 145,2 mg de poudre de thymidine dans 3 ml de H2O (ou des quantités équivalentes) et stériliser la solution par filtration à travers un filtre de taille de pores de 0,2 μm. Un léger réchauffement pourrait aider à dissoudre la thymidine. Ajouter 100 μL du stock 200 mM fraîchement préparé à chaque plat de culture 100 mm (concentration finale 2 mM). Incuber les cellules avec de la thymidine pendant 20 h à 37 ° C76; C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO 2 . REMARQUE: traiter les cellules le soir (vers 19 heures), avoir le temps d&#39;effectuer la libération de la thymidine et le blocage du nocodazole le lendemain. </li><li> Pour libérer du bloc de thymidine, retirer le milieu de croissance contenant de la thymidine dans l&#39;après-midi du lendemain (15 heures); Laver les cellules deux fois avec 1x PBS préchauffé et ajouter 10 ml de milieu complet à chaque plat de 100 mm. Incuber les cellules pendant 5 h à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO 2 . </li><li> Pour l&#39;arrêt des cellules mitotiques, ajouter du nocodazole à une concentration finale de 50 ng / mL (20 h). Préparer une solution mère en dissolvant la poudre de nocodazole dans du DMSO ( par ex. 5 mg / mL) et conserver congelé à -20 ° C. Incuber les cellules avec du nocodazole pendant plus de 10 à 11 h à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO 2 . </li><li> Libération de l&#39;arrestation médiée par nocodazole au début de la phase M (mitotic shake-off) et collecte d&#39;échantillons à plusieurs reprises poiNts (à partir de 6-7 heures). <ol><li> Détachez les cellules arrondies (mitotiques) en secouant chaque plaque et en pipetteant doucement le milieu de croissance contenant du nocodazole. Recueillir le milieu avec des cellules détachées de chaque plaque de 100 mm dans des tubes stériles de 50 ml, centrifuger (300 xg, 5 min, température ambiante (RT)) et les cellules de lavage deux fois en ajoutant 1x PBS puis centrifuger. L&#39;utilisation de PBS froid ou PBS plus nocodazole est recommandée pour éviter le glissement mitotique (voir la section Discussion). </li><li> Remettre en suspension les cellules mitotiques recueillies à partir de chaque plaque de 100 mm dans 10 ml de milieu complet. Économisez 2 mL pour l&#39;extraction de l&#39;ARN et 2 mL pour l&#39;analyse FACS pour le point de temps 0 h (environ 0,2-0,25 x 10 6 cellules par échantillon). </li><li> Remplacer les cellules mitotiques restantes pour les points de temps suivants dans des plaques à 6 puits (2 ml / puits, 0,2-0,25 x 10 6 cellules / puits). REMARQUE: Rappelez-vous que 2 puits sont requis par point de temps sélectionné (1 pour l&#39;ARN et 1 pour l&#39;analyse FACS). </li></ol></li><li> Collecter des échantillons à selPoints de temps écoulés. Toutes les 1,5 à 3 h sont recommandées afin d&#39;obtenir un profil adéquat de la progression du cycle cellulaire. <ol><li> Pour l&#39;extraction de l&#39;ARN, retirer le milieu, rincer bien avec 2 mL de préchauffage 1x PBS et ajouter 1 mL de réactif d&#39;isolement d&#39;ARN approprié ( p. Ex . TRIzol) dans le puits (effectuer cette dernière étape dans une armoire de sécurité pour les produits chimiques). Pipeter vers le haut et vers le bas pour détacher et lyse les cellules, transférer le lysat cellulaire dans un tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL, incuber 5 min à la RT et conserver le tube à -80 ° C jusqu&#39;à l&#39;utilisation ultérieure. </li><li> Pour l&#39;analyse FACS, rincer bien avec 2 mL de pré-chaud 1x PBS, ajouter une solution de trypsine-EDTA préalablement chauffée (0,3 mL / puits) pour détacher les cellules, bloquer la trypsine-EDTA en ajoutant 1 mL de milieu complet et collecter chaque échantillon séparément Tube de 15 mL. <ol><li> Centrifuger les cellules (300 xg, 5 min, RT), sauver la granulation cellulaire et éliminer le surnageant. Afin de corriger les cellules, remettre à neuf les cellules dans 1 ml d&#39;éthanol refroidi à 70% (v / v) dans 1x PBS par des tubes à vortex doux et les placer sur la glace pour l&#39;applicationEnviron 15 min avant le stockage à 4 ° C ou à la coloration pour une analyse plus approfondie par FACS (décrit dans les étapes 1.4 à 1.5). </li></ol></li></ol></li></ol></li><li> Synchronisation et publication de cellules U2OS basées sur HU à partir de la frontière G1 / S <ol><li> Préparer un milieu de culture cellulaire complet comme décrit à l&#39;étape 1.1. </li><li> Graine 0,25 x 10 6 cellules U2OS par puits dans des plaques à 6 puits (2 ml de milieu de culture complet par puits). Afin de calculer le nombre de puits nécessaires à l&#39;expérience, prendre en compte que 2 puits seront requis par point de temps sélectionné (1 puits pour l&#39;extraction de l&#39;ARN et 1 puits pour la surveillance du cycle cellulaire) et que 2 puits supplémentaires de cellules de croissance asynchrone sont Nécessaire pour définir les paramètres de compensation d&#39;analyse FACS. </li><li> Laisser les cellules se fixer en incubant des plaques à 6 puits pendant une nuit (O / N) à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO 2 . </li><li> Enlever le milieu complet des puits le lendemain matin et ajouter 2 mLDe milieu DMEM-Glutamine pré-réchauffé sans FBS par puits. Incuber les cellules pendant 24 h supplémentaires à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO 2 . REMARQUE: effectuez cette étape dans tous les puits à l&#39;exception de 2 (ceux sauvegardés pour définir les paramètres FACS). L&#39;étape de retrait du sérum peut être omise si une synchronisation efficace est obtenue en incubant simplement des cellules avec HU. </li><li> Arrêt du cycle cellulaire G1 / S avec HU. <ol><li> Préparer une solution mère de HU fraîche (500 mM) avant chaque utilisation. Ajouter 2 mL de H 2 O à 76,06 mg de poudre HU et mélanger jusqu&#39;à dissolution complète. Stériliser la solution par filtration à travers un filtre de taille de pores de 0,2 μm. Mélanger 50 mL de milieu complet avec 400 μL de solution mère HU stérilisée pour une concentration finale en HU de 4 mM. </li><li> Supprimez le milieu de tous les puits, à l&#39;exception des 2 puits nécessaires à la définition des paramètres FACS et remplacez-les par un milieu complet 4 mM contenant de l&#39;HU (2 ml / puits). </li><li> Incuber les cellules pendant 24 h dansLe milieu contenant HU à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO 2 . </li></ol></li><li> Libération des cellules de l&#39;arrestation médiée par l&#39;HU. Retirer le milieu contenant HU des puits et rincer les puits deux fois avec 1x PBS préchauffé (2 ml à chaque fois). Ajouter 2 ml de milieu complet par puits. Collectez 2 échantillons pour le point de temps de 0 h (1 pour l&#39;extraction de l&#39;ARN et 1 pour la vérification de l&#39;arrêt du cycle cellulaire par FACS) ainsi que 2 échantillons sauvegardés pour les paramètres FACS. Placez les puits restants dans l&#39;incubateur. </li><li> Recueillir des échantillons tous les 1,5 à 3 h afin d&#39;obtenir une répartition adéquate de la progression du cycle cellulaire. À chaque fois, effectuez un traitement d&#39;échantillons (pour l&#39;extraction de l&#39;ARN et pour l&#39;analyse FACS) comme décrit au 1.1.8.1-1.1.8.2. </li></ol></li><li> Traitement avec des agents nuisibles à l&#39;ADN REMARQUE: chaque fois que l&#39;objectif est d&#39;élucider l&#39;effet d&#39;un composé ( par exemple , des agents nuisibles à l&#39;ADN) dans les événements du cycle cellulaire, l&#39;une des méthodes de synchronisation décrites précédemment peut êtreCombiné avec le traitement des cellules avec l&#39;agent génotoxique. Afin de sélectionner la méthode de synchronisation, il est important de considérer la phase du cycle cellulaire que nous aimerions analyser. En général, la procédure Thy-Noc peut être appropriée pour étudier l&#39;effet d&#39;un composé en phase G1 ou en entrée de phase S, tandis que la synchronisation médiée par l&#39;HU peut être plus appropriée pour étudier l&#39;impact dans les phases S à G2 ou dans l&#39;entrée à la mitose. <ol><li> Analyse de l&#39;effet des agents génotoxiques en phase G1 ou en entrée de phase S <ol><li> Synchronisez les cellules comme décrit dans 1.1.2. À 1.1.6. </li><li> Libérer les cellules du nocodazole et les re-plaquer comme décrit au 1.1.7. Incuber les à 37 ° C dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO 2 pendant 3 h pour les laisser s&#39;attacher avant l&#39;ajout d&#39;agent (la période d&#39;incubation requise peut varier en fonction de la ligne cellulaire). </li><li> Ajouter un agent et collecter des échantillons comme décrit précédemment au 1.1.8. </li></ol></li><li> Analyse de l&#39;effet des agents génotoxiques dans SG2 phases ou M entrée <ol><li> Synchronisez les cellules comme décrit dans 1.2.2. À 1.2.5. </li><li> Libérer les cellules de HU comme décrit dans 1.2.6. Et ajoutez immédiatement l&#39;agent. </li><li> Recueillir des échantillons comme décrit précédemment dans 1.8. </li></ol></li></ol></li><li> Surveillance de la synchronisation cellulaire et de la progression à travers le cycle cellulaire par coloration au iodure de propidium (PI) et analyse FACS REMARQUE: les échantillons collectés en tous les temps avec ceux requis pour définir les paramètres FACS peuvent être conservés à 4 ° C une fois qu&#39;ils ont été corrigés (comme indiqué au 1.1.8.2). Effectuer une coloration avec une solution PI suivie d&#39;une analyse FACS pour tous les échantillons de l&#39;expérience simultanément. L&#39;IP s&#39;accumule dans la rainure principale de l&#39;ADN bicaténaire produisant un signal fortement fluorescent lorsqu&#39;il est excité à 535 nm avec un pic d&#39;émission large autour de 600 nm. Puisque l&#39;IP peut également se lier à l&#39;ARN bicaténaire, il est nécessaire de traiter les cellules avec RNase pour une résolution optimale de l&#39;ADN. <ol><li> Préparez une solution de coloration IP fraîchement préparée. Une solution mère PI peut être préparée en dissolvant de la poudre PI dans du PBS ( par exemple 5 mg / mL). Conserver la solution stock à 4 ° C (dans l&#39;obscurité). La solution de coloration est composée de PI (140 μM), de citrate de sodium (38 mM) et de Triton X-100 (0,01% v / v). </li><li> Réchauffer une surface appropriée ( par exemple un four) à 37 ° C. </li><li> Centrifuger les cellules fixées (450 xg, 5 min, RT), décanter le surnageant (éthanol) et laver une fois avec 1x PBS. </li><li> Centrifuger les cellules à nouveau, enlever PBS et ajouter 300 μL de solution de coloration PI par échantillon (sauf à l&#39;un des échantillons pour les paramètres FACS, ajouter PBS à cet échantillon). </li><li> Transférer des cellules dans des tubes FACS (5 ml de tubes en polystyrène à fond rond). </li><li> Ajouter 1 μL de RNase A à chaque échantillon, mélanger et incuber les échantillons pendant 30 min dans l&#39;obscurité à 37 ° C. Les échantillons peuvent être stockés protégés contre la lumière à 4 ° C pendant un maximum de 2 à 3 jours. </li><li> Analyser le contenu d&#39;ADN dans les échantillons par fluxLa cytométrie. Définir les paramètres de compensation d&#39;analyse FACS avec un échantillon asynchrone coloré par PI. Utilisez un échantillon vide (sans solution de coloration IP) pour vérifier l&#39;autofluorescence. Les bases de l&#39;analyse de la teneur en ADN par la cytométrie en flux ont été décrites précédemment 9 . </li></ol></li><li> Détermination de l&#39;indice mitotique par double coloration phospho-H3 (Ser 10) / PI NOTE: Les cellules soumises à la mitoses peuvent être facilement détectées par cytométrie en flux avec des anticorps spécifiques de phospho-histone H3 dans Serine 10 (pH3). Une coloration concomitante de PI est utile pour déterminer la distribution basée sur l&#39;ADN de la population cellulaire. 5 échantillons sont nécessaires pour les configurations optimales des paramètres FACS: blanc, PI-seulement, pH3 seulement, anticorps secondaire et double coloration. <ol><li> Centrifuger les cellules fixées (450 xg, 5 min, 4 ° C) et jeter le surnageant. Les étapes suivantes sont décrites pour effectuer une coloration dans des tubes de 15 mL. </li><li> Nettoyer les cellules en ajoutant 1Ml de PBS-T (PBS + 0,05% de Tween-20) sur la pastille et la centrifugeuse (450 xg, 5 min, 4 ° C). Retirer le surnageant. </li><li> Ajouter un anticorps anti-pH3 dilué (1: 500) dans 100-200 μL de PBS-T + 3% de BSA, et incuber avec un balancement pendant 2 h à TA (ou O / N à 4 ° C). </li><li> Ajouter 2 ml de PBS-T (PBS + 0,05% de Tween-20) et centrifuger (450 xg, 5 min, 4 ° C). Retirer le surnageant. </li><li> Laver encore une fois en ajoutant 2 ml de PBS-T à la pastille, centrifuger et jeter le surnageant. </li><li> Ajouter un anticorps secondaire (AlexaFluor 488 anti-lapin dans le cas d&#39;un anticorps pH3 sélectionné) dilué (1: 500) dans 100-200 μL de PBS-T + 3% BSA et incuber avec un balancement pendant 1 h à TA (ou O / N À 4 ° C). Protégez les échantillons de la lumière. </li><li> Laver deux fois avec du PBS-T (2 ml) par centrifugation comme décrit à l&#39;étape 1.5.4. </li><li> Effectuez la coloration PI comme décrit (étapes 1.4.1 à 1.4.6). </li></ol></li></ol> 2. Collecte et traitement des échantillons pour l&#39;analyse des expressions génétiques <ol><li> PrendreDes échantillons de microcentrifugation de 1,5 mL dans le réactif d&#39;isolement de l&#39;ARN hors du congélateur et les laisser décongeler à la RT à l&#39;intérieur d&#39;une armoire de sécurité pour les produits chimiques. </li><li> Ajouter 400 μL de chloroforme à chaque échantillon et agiter vigoureusement (mais ne pas tourbillonner) jusqu&#39;à mélange complet. Incuber les échantillons pendant 5 min à la RT. </li><li> Centrifuger les tubes pendant 15 min (≥8,000 xg, 4 ° C) dans une microcentrifugeuse de banc. </li><li> Transférer la phase aqueuse (supérieure) à un nouveau tube de microcentrifugeuse de 1,5 mL et enregistrer le volume transféré (afin de simplifier la procédure, il est recommandé de collecter des volumes égaux dans tous les échantillons de l&#39;expérience). </li><li> Ajouter 1 volume d&#39;éthanol à 100% lentement (goutte à goutte) à la phase aqueuse tout en mélangeant. Ne pas centrifuger. </li><li> Effectuez les prochaines étapes avec le kit de préparation mini RNA commercial. Pipeter jusqu&#39;à 700 μl de chaque échantillon, y compris tout précipité qui s&#39;est formé, dans une colonne de spin dans un tube de collecte de 2 mL (fourni par le fabricant). </li><li> Fermer laCouvercle et centrifugeuse (≥ 8 000 g, RT) pendant 15 s. Jeter l&#39;écoulement. Répétez l&#39;étape précédente avec l&#39;échantillon restant (le cas échéant). </li><li> Suivre les instructions de fabrication pour le lavage et l&#39;élimination d&#39;ARN (élucider chaque échantillon dans 30 à 40 μl d&#39;H 2 O sans nucléase pour obtenir une concentration d&#39;ARN appropriée pour l&#39;étape suivante). </li><li> Déterminer la concentration d&#39;ARN et la pureté des échantillons par des mesures d&#39;absorbance (un rapport 260/280 de 2,0-2,1 indique une bonne pureté de l&#39;échantillon d&#39;ARN). Stocker les échantillons d&#39;ARN à -80 ° C jusqu&#39;à l&#39;utilisation pour l&#39;analyse RT-qPCR. </li><li> Pour la conversion de l&#39;ARN en ADNc et la PCR quantitative subséquente, prendre 1 μg d&#39;ARN par échantillon et préparer une réaction rétrotranscriptase selon les instructions du fabricant. Les échantillons d&#39;ADNc obtenus peuvent être stockés à 4 ° C (pendant quelques jours) ou à -20 ° C (pour de plus longues périodes). REMARQUE: la préparation des échantillons, la conception des amorces et d&#39;autres considérations pour le PCR en temps réel ont été exDécrite de manière résolue dans la littérature 22 , 23 . </li></ol>

<ol><li>Beato, M., Sánchez-Aguilera, A., Piris, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+cycle+deregulation+in+B-cell+lymphomas%5BTitle%5D)+AND+%22Blood%22%5BJournal%5D)">Cell cycle deregulation in B-cell lymphomas.</a> Blood. 101 (4), 1220-1235 (2003).</li>
<li>Chen, H. Z., Tsai, S. Y., Leone, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Emerging+roles+of+E2Fs+in+cancer%3A+an+exit+from+cell+cycle+control%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Emerging roles of E2Fs in cancer: an exit from cell cycle control.</a> Nat Rev Cancer. 9 (11), 785-797 (2009).</li>
<li>Cho, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptional+regulation+and+function+during+the+human+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Genet%22%5BJournal%5D)">Transcriptional regulation and function during the human cell cycle.</a> Nat Genet. 27 (1), 48-54 (2001).</li>
<li>Peña-Diaz, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcription+profiling+during+the+cell+cycle+shows+that+a+subset+of+Polycomb-targeted+genes+is+upregulated+during+DNA+replication%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Transcription profiling during the cell cycle shows that a subset of Polycomb-targeted genes is upregulated during DNA replication.</a> Nucleic Acids Res. 41 (5), 2846-2856 (2013).</li>
<li>Grant, G. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+cell+cycle-regulated+genes+periodically+expressed+in+U2OS+cells+and+their+regulation+by+FOXM1+and+E2F+transcription+factors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of cell cycle-regulated genes periodically expressed in U2OS cells and their regulation by FOXM1 and E2F transcription factors.</a> Mol Biol Cell. 24 (23), 3634-3650 (2013).</li>
<li>Minderman, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+and+in+vivo+irinotecan-induced+changes+in+expression+profiles+of+cell+cycle+and+apoptosis-associated+genes+in+acute+myeloid+leukemia+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">In vitro and in vivo irinotecan-induced changes in expression profiles of cell cycle and apoptosis-associated genes in acute myeloid leukemia cells.</a> Mol Cancer Ther. 4 (6), 885-900 (2005).</li>
<li>McKenna, E., Traganos, F., Zhao, H., Darzynkiewicz, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Persistent+DNA+damage+caused+by+low+levels+of+mitomycin+C+induces+irreversible+cell+senescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Persistent DNA damage caused by low levels of mitomycin C induces irreversible cell senescence.</a> Cell Cycle. 11 (16), 3132-3140 (2012).</li>
<li>Infante, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2F2+represses+cell+cycle+regulators+to+maintain+quiescence%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">E2F2 represses cell cycle regulators to maintain quiescence.</a> Cell Cycle. 7 (24), 3915-3927 (2008).</li>
<li>Cecchini, M. J., Amiri, M., Dick, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+cycle+position+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell cycle position in mammalian cells.</a> J Vis Exp. (59), (2012).</li>
<li>Schorl, C., Sedivy, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+cell+cycle+phases+and+progression+in+cultured+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of cell cycle phases and progression in cultured mammalian cells.</a> Methods. 41 (2), 143-150 (2007).</li>
<li>Lalande, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+reversible+arrest+point+in+the+late+G1+phase+of+the+mammalian+cell+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A reversible arrest point in the late G1 phase of the mammalian cell cycle.</a> Exp Cell Res. 186 (2), 332-339 (1990).</li>
<li>Park, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mimosine+arrests+the+cell+cycle+prior+to+the+onset+of+DNA+replication+by+preventing+the+binding+of+human+Ctf4%2FAnd-1+to+chromatin+via+Hif-1%CE%B1+activation+in+HeLa+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Mimosine arrests the cell cycle prior to the onset of DNA replication by preventing the binding of human Ctf4/And-1 to chromatin via Hif-1α activation in HeLa cells.</a> Cell Cycle. 11 (4), 761-766 (2012).</li>
<li>Ikegami, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aphidicolin+prevents+mitotic+cell+division+by+interfering+with+the+activity+of+DNA+polymerase-alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Aphidicolin prevents mitotic cell division by interfering with the activity of DNA polymerase-alpha.</a> Nature. 275 (5679), 458-460 (1978).</li>
<li>Baranovskiy, A. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+basis+for+inhibition+of+DNA+replication+by+aphidicolin%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Structural basis for inhibition of DNA replication by aphidicolin.</a> Nucleic Acids Res. 42 (22), 14013-14021 (2014).</li>
<li>Adams, R. L., Lindsay, J. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hydroxyurea+reversal+of+inhibition+and+use+as+a+cell-synchronizing+agent%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Hydroxyurea reversal of inhibition and use as a cell-synchronizing agent.</a> J Biol Chem. 242 (6), 1314-1317 (1967).</li>
<li>Mitxelena, J., Apraiz, A., Vallejo-Rodríguez, J., Malumbres, M., Zubiaga, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2F7+regulates+transcription+and+maturation+of+multiple+microRNAs+to+restrain+cell+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">E2F7 regulates transcription and maturation of multiple microRNAs to restrain cell proliferation.</a> Nucleic Acids Res. , (2016).</li>
<li>Bootsma, D., Budke, L., Vos, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+synchronous+division+of+tissue+culture+cells+initiated+by+excess+thymidinE%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Studies on synchronous division of tissue culture cells initiated by excess thymidinE.</a> Exp Cell Res. 33, 301-309 (1964).</li>
<li>Galgano, P. J., Schildkraut, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((G1%2FS+Phase+Synchronization+using+Double+Thymidine+Synchronization%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">G1/S Phase Synchronization using Double Thymidine Synchronization.</a> CSH Protoc. (2), (2006).</li>
<li>Edwin Taylor, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+inhibition+and+the+binding+of+h3-colchicine%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Kinetics of inhibition and the binding of h3-colchicine.</a> J Cell Biol. 25, 145-160 (1965).</li>
<li>Zieve, G. W., Turnbull, D., Mullins, J. M., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+large+numbers+of+mitotic+mammalian+cells+by+use+of+the+reversible+microtubule+inhibitor+nocodazole.+Nocodazole+accumulated+mitotic+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Production of large numbers of mitotic mammalian cells by use of the reversible microtubule inhibitor nocodazole. Nocodazole accumulated mitotic cells.</a> Exp Cell Res. 126 (2), 397-405 (1980).</li>
<li>Matsui, Y., Nakayama, Y., Okamoto, M., Fukumoto, Y., Yamaguchi, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enrichment+of+cell+populations+in+metaphase%2C+anaphase%2C+and+telophase+by+synchronization+using+nocodazole+and+blebbistatin%3A+a+novel+method+suitable+for+examining+dynamic+changes+in+proteins+during+mitotic+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Enrichment of cell populations in metaphase, anaphase, and telophase by synchronization using nocodazole and blebbistatin: a novel method suitable for examining dynamic changes in proteins during mitotic progression.</a> Eur J Cell Biol. 91 (5), 413-419 (2012).</li>
<li>Nolan, T., Hands, R. E., Bustin, S. A. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/17406449">Quantification of mRNA using real-time RT-PCR.</a> Nat Protoc. 1 (3), 1559-1582 (2006).</li>
<li>Thornton, B., Basu, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+PCR+%28qPCR%29+primer+design+using+free+online+software%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+Mol+Biol+Educ%22%5BJournal%5D)">Real-time PCR (qPCR) primer design using free online software.</a> Biochem Mol Biol Educ. 39 (2), 145-154 (2011).</li>
<li>Abbas, T., Dutta, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((p21+in+cancer%3A+intricate+networks+and+multiple+activities%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">p21 in cancer: intricate networks and multiple activities.</a> Nat Rev Cancer. 9 (6), 400-414 (2009).</li>
<li>Kung, A. L., Sherwood, S. W., Schimke, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+line-specific+differences+in+the+control+of+cell+cycle+progression+in+the+absence+of+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Cell line-specific differences in the control of cell cycle progression in the absence of mitosis.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87 (24), 9553-9557 (1990).</li>
<li>Borel, F., Lacroix, F. B., Margolis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prolonged+arrest+of+mammalian+cells+at+the+G1%2FS+boundary+results+in+permanent+S+phase+stasis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci.+115+%28Pt%22%5BJournal%5D)">Prolonged arrest of mammalian cells at the G1/S boundary results in permanent S phase stasis.</a> J Cell Sci. 115 (Pt. 14, 2829-2838 (2002).</li>
<li>Knehr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+critical+appraisal+of+synchronization+methods+applied+to+achieve+maximal+enrichment+of+HeLa+cells+in+specific+cell+cycle+phases%29%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">A critical appraisal of synchronization methods applied to achieve maximal enrichment of HeLa cells in specific cell cycle phases).</a> Exp Cell Res. 217 (2), 546-553 (1995).</li>
<li>Zhu, W., Giangrande, P. H., Nevins, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((E2Fs+link+the+control+of+G1%2FS+and+G2%2FM+transcription%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">E2Fs link the control of G1/S and G2/M transcription.</a> EMBO J. 23 (23), 4615-4626 (2004).</li>
<li>Whitcomb, E. A., Dudek, E. J., Liu, Q., Taylor, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+control+of+S+phase+of+the+cell+cycle+by+ubiquitin-conjugating+enzyme+H7%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Novel control of S phase of the cell cycle by ubiquitin-conjugating enzyme H7.</a> Mol Biol Cell. 20 (1), 1-9 (2009).</li>
<li>Bruinsma, W., Macurek, L., Freire, R., Lindqvist, A., Medema, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bora+and+Aurora-A+continue+to+activate+Plk1+in+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Sci%22%5BJournal%5D)">Bora and Aurora-A continue to activate Plk1 in mitosis.</a> J Cell Sci. 127, 801-811 (2014).</li>
<li>Thomas, D. B., Lingwood, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+model+of+cell+cycle+control%3A+effects+of+thymidine+on+synchronous+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">A model of cell cycle control: effects of thymidine on synchronous cell cultures.</a> Cell. 5 (1), 37-42 (1975).</li>
<li>Whitfield, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+genes+periodically+expressed+in+the+human+cell+cycle+and+their+expression+in+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Identification of genes periodically expressed in the human cell cycle and their expression in tumors.</a> Mol Biol Cell. 13 (6), 1977-2000 (2002).</li>
<li>Lim, S., Cdks Kaldis, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((cyclins+and+CKIs%3A+roles+beyond+cell+cycle+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">cyclins and CKIs: roles beyond cell cycle regulation.</a> Development. 140 (15), 3079-3093 (2013).</li>
<li>Tapia, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Two+mitosis-specific+antibodies%2C+MPM-2+and+phospho-histone+H3+%28Ser28%29%2C+allow+rapid+and+precise+determination+of+mitotic+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Surg+Pathol%22%5BJournal%5D)">Two mitosis-specific antibodies, MPM-2 and phospho-histone H3 (Ser28), allow rapid and precise determination of mitotic activity.</a> Am J Surg Pathol. 30 (1), 83-89 (2006).</li>
<li>Andreassen, P. R., Martineau, S. N., Margolis, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+induction+of+mitotic+checkpoint+override+in+mammalian+cells+results+in+aneuploidy+following+a+transient+tetraploid+state%5BTitle%5D)+AND+%22Mutat+Res%22%5BJournal%5D)">Chemical induction of mitotic checkpoint override in mammalian cells results in aneuploidy following a transient tetraploid state.</a> Mutat Res. 372 (2), 181-194 (1996).</li>
<li>Wei, F., Xie, Y., He, L., Tao, L., Tang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ERK1+and+ERK2+kinases+activate+hydroxyurea-induced+S-phase+checkpoint+in+MCF7+cells+by+mediating+ATR+activation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Signal%22%5BJournal%5D)">ERK1 and ERK2 kinases activate hydroxyurea-induced S-phase checkpoint in MCF7 cells by mediating ATR activation.</a> Cell Signal. 23 (1), 259-268 (2011).</li>
<li>Kubota, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activation+of+the+prereplication+complex+is+blocked+by+mimosine+through+reactive+oxygen+species-activated+ataxia+telangiectasia+mutated+%28ATM%29+protein+without+DNA+damage%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Activation of the prereplication complex is blocked by mimosine through reactive oxygen species-activated ataxia telangiectasia mutated (ATM) protein without DNA damage.</a> J Biol Chem. 289 (9), 5730-5746 (2014).</li>
<li>Hartwell, L. H., Weinert, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Checkpoints%3A+controls+that+ensure+the+order+of+cell+cycle+events%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Checkpoints: controls that ensure the order of cell cycle events.</a> Science. 246 (4930), 629-634 (1989).</li>
<li>St-Denis, N. A., Derksen, D. R., Litchfield, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Evidence+for+regulation+of+mitotic+progression+through+temporal+phosphorylation+and+dephosphorylation+of+CK2alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Evidence for regulation of mitotic progression through temporal phosphorylation and dephosphorylation of CK2alpha.</a> Mol Cell Biol. 29 (8), 2068-2081 (2009).</li>
<li>Min, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RAD51C-deficient+cancer+cells+are+highly+sensitive+to+the+PARP+inhibitor+olaparib%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cancer+Ther%22%5BJournal%5D)">RAD51C-deficient cancer cells are highly sensitive to the PARP inhibitor olaparib.</a> Mol Cancer Ther. 12 (6), 865-877 (2013).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

L&#39;analyse des gènes régulés par ajustement précis impliqués dans des rôles transitoires et spécifiques dans le cycle cellulaire nécessite une population cellulaire uniforme. Beaucoup de chercheurs utilisent couramment des lignées de cellules tumorales établies de longue date à cette fin, et une variété de méthodes ont été développées pour obtenir des populations de cellules synchrones (ou partiellement synchrones), dans le but d&#39;accumuler autant de cellules que possible dans des phases de cycle cellulaire défini...

La transition à travers toutes les phases du cycle cellulaire est couplée à un programme d&#39;expression génique étroitement réglementé. Ce «aller et à quitter» coordonné de la transcription des gènes tout au long du cycle cellulaire est censé être sous le contrôle de systèmes de régulation transcriptionnels complexes, en régulant non seulement le moment mais aussi les niveaux d&#39;expression des gènes. La dérégulation des composants clés du cycle cellulaire est connue pour contribuer au développement de plusieurs maladies et est une caractéristique bien établie de la tumorigénèse 1 , 2 . Les analyses transcriptomiques à l&#39;échelle du génome réalisées dans des cellules de levure et de mammifères ont révélé qu&#39;un grand nombre de gènes présentent des schémas périodiques d&#39;expression des gènes dans le cycle cellulaire, ce qui suggère que la fluctuation de la transcription pendant le cycle cellulaire reflète l&#39;exigence temporelle d&#39;un produit génique donné Dans une phase précise 3 , 4 , </suP&gt; 5 . Une tâche majeure dans l&#39;étude de l&#39;expression des gènes régulés par un cycle cellulaire est la synchronisation des cellules dans des phases spécifiques du cycle cellulaire. La synchronisation cellulaire aide à interpréter l&#39;association d&#39;un motif d&#39;expression génique à une transition de phase de cycle cellulaire particulière et a permis de mieux comprendre la régulation et la fonction de nombreux gènes. La synchronisation cellulaire est également importante pour étudier le mécanisme d&#39;action des médicaments anticancéreux, car les agents chimiothérapeutiques sont connus pour affecter à la fois l&#39;expression des gènes ainsi que la cinétique du cycle cellulaire 6 , 7 . Néanmoins, il est souvent difficile de déterminer si les différences d&#39;expression des gènes résultant du traitement avec ces agents sont une réponse directe au traitement ou sont simplement la conséquence de changements dans les profils du cycle cellulaire. Pour distinguer ces possibilités, l&#39;expression des gènes doit être analysée dans les cellules qui ont été sYnchronisé avant l&#39;addition du médicament chimiothérapeutique. À l&#39;exception de certaines cellules primaires telles que les cellules lymphoïdes fraîchement isolées - qui constituent une population cellulaire homogène synchronisée dans G0 8 -, les lignées cellulaires établies in vitro croissent de manière asynchrone en culture. Dans des conditions de croissance régulières, ces cellules cycliques asynchrones se retrouvent dans toutes les phases du cycle cellulaire mais, de préférence, dans G1 9 . Par conséquent, ce contexte ne fournit pas un scénario optimal pour les analyses d&#39;expression fonctionnelle ou génétique dans une phase de cycle cellulaire spécifique ( p. Ex. G1, S, etc.). Les lignées cellulaires immortalisées non transformées ( p. Ex . Les fibroblastes) peuvent être synchronisées avec les méthodes dites physiologiques 10 . Ces méthodes sont basées sur les caractéristiques de cellules primaires retenues des cellules non transformées, telles que l&#39;inhibition du contact cellulaire et la dépendance du facteur de croissance afin de continuer à faire du vélo. SuppressionDe sérum en combinaison avec une inhibition de contact rend les cellules non transformées arrêtées à G0 / G1. Cependant, l&#39;entrée et la progression du cycle cellulaire synchronisée nécessitent souvent une sous-culture, qui implique également un détachement artificiel des cellules et une régénération 10 . Plus important encore, cette méthode n&#39;est pas adaptée à la synchronisation des lignées cellulaires transformées, la grande majorité des lignées cellulaires établies actuellement utilisées, caractérisées par manque d&#39;inhibition de la croissance médiée par contact cellulaire ou de réponse au retrait du facteur de croissance. Ainsi, il est clair que des méthodes alternatives sont nécessaires pour une synchronisation cellulaire efficace dans des phases spécifiques du cycle cellulaire. En termes généraux, les méthodes de synchronisation les plus fréquemment utilisées sont basées sur une inhibition chimique ou pharmacologique transitoire d&#39;un point défini du cycle cellulaire, typiquement la synthèse de l&#39;ADN ou la formation de la broche mitotique. L&#39;inhibition de la synthèse de l&#39;ADN synchronise les cellules en les arrêtant à la fin de la phase G1 ou début de la S. Cela peut être achevéPar addition de composés tels que la mimosine, un inhibiteur de la biosynthèse des nucléotides 11 , 12 , de l&#39;aphidicoline, un inhibiteur des ADN polymerases 13 , 14 , de l&#39;hydroxyurée, un inhibiteur de la ribonucléotide réductase 15 , 16 ou des quantités excessives de thymidine 17 , 18 . D&#39;autre part, les inhibiteurs de la polymérisation des microtubules, tels que la colchicine ou le nocodazole, peuvent bloquer la formation de la broche mitotique conduisant à une synchronisation cellulaire au début de la phase M 19 , 20 , 21 . Dans ce travail, nous décrivons une méthode impliquant deux protocoles de synchronisation complémentaires basés sur l&#39;inhibition chimique transitoire pour étudier l&#39;expression de gènes régulés par cycle cellulaire à l&#39;ARNmniveau. Cette méthode est fondamentale pour définir le rôle des gènes du cycle cellulaire dans les processus spécifiques du cycle cellulaire. En outre, il fournit un cadre général pour étudier l&#39;impact des traitements anticancéreux afin de détecter avec précision les gènes sensibles aux médicaments et de minimiser les mauvaises interprétations dérivées des perturbations de la progression du cycle cellulaire générées par ces médicaments.

<table><tbody><tr><td>DMEM, hyperglycémie, supplément GutaMAX</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>61965-059</td><td></td></tr><tr><td>FBS, qualifié, approuvé par l’UE, origine Amérique du Sud</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>10270-106</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>0,25 % Trypsine-EDTA (1x), rouge phénol</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>25200-072</td><td></td></tr><tr><td>Thymidine</td><td>SIGMA</td><td>T1895-5G</td><td>Fraîchement préparé. Un léger réchauffement peut aider à dissoudre la thymidine.</td></tr><tr><td>Nocodazole</td><td>SIGMA</td><td>M-1404</td><td>Solution mère dans DMSO stockée à -20 &ordm ; C dans de petites aliquotes</td></tr><tr><td>Hydroxyurée</td><td>SIGMA</td><td>H8627</td><td></td></tr><tr><td>Mitomycine C fraîchement préparée à partir de Streptomyces caespitosus</td><td>SIGMA</td><td>M4287</td><td>Solution mère de 1,5 mM dans un H<2 stérile, protégée de la lumière et stockée à 4 &>ordm ; C</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>SIGMA</td><td>D2650</td><td></td></tr><tr><td>Iodure de propidium</td><td>SIGMA</td><td>P4170</td><td>Solution mère dans du PBS stérile à 5 mg/ml, stockée à 4 &ordm ; C à l’abri de la lumière.</td></tr><tr><td>PBS pH 7,6</td><td></td><td></td><td>Éthanol fait maison</td></tr><tr><td></td><td>PANREAC</td><td>A3678,2500</td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>SIGMA</td><td>C2432</td><td></td></tr><tr><td>Citrate de sodium</td><td>PANREAC</td><td>131655</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>SIGMA</td><td>T8787</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EN0531</td><td></td></tr><tr><td>Réactif</td> <td>TRIzolLifeTechnologies</td><td>15596018</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini kit</td><td>QIAGEN</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>Kit de transcription inverse d’ADNc haute capacité</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4368814</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps anti-cycline E1</td><td>Signalisation cellulaire</td><td>4129</td><td>Dilution 1:1000 dans du lait à 5 %, non/n, 4 &ordm ; C</td></tr><tr><td>Signalisation cellulaire de l’anticorps</td><td>anti-cycline B1</td><td>4135</td><td>dilution 1:1000 dans du lait à 5 %, non/n, 4 & ordm ; C</td></tr><tr><td>Anti-&bêta ;-actine</td><td>SIGMA</td><td>A-5441</td><td>dilution 1:3000 dans du lait à 5 %, 1 h, RT</td></tr><tr><td>Anti-pH3 (Ser 10) antiboty</td><td>Millipore</td><td>06-570</td><td>Spécifié dans le protocole</td></tr><tr><td>Anticorps anti-lapin secondaire AlexaFluor 488</td><td>Invitrogen</td><td>R37116</td><td>Spécifié dans le protocole</td></tr><tr><td>Anticorps secondaire anti-souris-HRP</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3697</td><td>dilution 1:3000 dans du lait à 5 %, 1 h,</td></tr><tr><td>anticorps RT Forward E2F1 (humain)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; </td><td>Biolegio</td><td></td><td>Conçu par l’outil PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Anticorps E2F1 inverse (humain)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; CTGTGCGAGGTCCTGGGTC</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Conçu par l’outil PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Anticorps E2F7 direct (humain)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; GGAAAGGCAACAGCAAACTCT</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Conçu par l’outil PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Anticorps E2F7 inverse (humain)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; </td><td></td><td></td> Conçu <td>par l’outil PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Forward p21Cip1 anticorps (humain)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; AGCAGAGGAAGACCATGTGGAC</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Conçu par l’outil PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Reverse p21Cip1 anticorps (humain)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; TTTCGACCCTGAGAGTCTCCAG</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Conçu par l’outil PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Gène de référence de l’anticorps TBP (humain)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Conçu par l’outil PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-TBP inverse (humain)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Conçu par l’outil PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Gène de référence de l’anticorps Oxa1L (humain)&nbsp ; &nbsp ; CACTTGCCAGAGATCCAGAAG&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Conçu par PrimerQuest outil (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Reverse Oxa1L &nbsp ; anticorps (humain)&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; CACAGGGAGAATGAGAGGTTTATAG&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Biolegio</td><td></td><td>Conçu par l’outil PrimerQuest (https://eu.idtdna.com/site)</td></tr><tr><td>Puissance SYBRGreen PCR Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4368702</td><td></td></tr><tr><td>TUBES FACS&nbsp ;</td><td>Sarstedt</td><td>551578</td><td></td></tr><tr><td>MicroAmp Optical 96-Well Reaction Plate</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>N8010560</td><td></td></tr><tr><td>Corning 100 mm TC-Treated Culture Dish</td><td>Corning</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Corning Costar Plaques de culture cellulaire 6 puits</td><td>Corning</td><td>3506</td><td></td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse de paillasse réfrigérée</td><td>Eppendorf</td><td>5415 R</td><td></td></tr><tr><td>Centrifugeuse de paillasse réfrigérée Jouan CR3.12</td><td>Jouan</td><td>743205604</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre NanoDrop Lite</td><td>Thermo Scientific</td><td>ND-LITE-PR</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSCalibur Flow Cytometer</td><td>BD Bioscience</td><td></td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 3 Système de PCR en temps réel</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>A28567</td><td></td></tr></tbody></table>

Étude de l&#39;expression génétique régulée par un cycle cellulaire par deux protocoles complémentaires de synchronisation cellulaire

Studying Cell Cycle-regulated Gene Expression by Two Complementary Cell Synchronization Protocols

Le programme d&#39;expression génique du cycle cellulaire représente une étape critique pour la compréhension des processus dépendants du cycle cellulaire et leur rôle dans des maladies telles que le cancer. L&#39;analyse d&#39;expression génique régulée par un cycle cellulaire dépend de la synchronisation cellulaire en phases spécifiques. Nous décrivons ici une méthode utilisant deux protocoles de synchronisation complémentaires qui sont couramment utilisés pour étudier la variation périodique de l&#39;expression des gènes pendant le cycle cellulaire. Les deux procédures sont basées sur le blocage transitoire du cycle cellulaire dans un point défini. Le protocole de synchronisation par le traitement par l&#39;hydroxyurée (HU) conduit à une arrestation cellulaire à la phase G1 / début S en retard, et la libération de l&#39;arrestation médiée par l&#39;HU fournit une population cellulaire progressant uniformément à travers S et G2 / M. Le protocole de synchronisation par le traitement par la thymidine et le nocodazole (Thy-Noc) bloque les cellules dans la mitose précoce et la libération de l&#39;arrestation médiée par Thy-Noc fournit une population cellulaire synchronisée adaptée à la phase G1 et à la phase S-enEssayer des études. L&#39;application des deux procédures nécessite une surveillance des profils de distribution du cycle cellulaire, qui est habituellement effectuée après la coloration par l&#39;iodure de propidium (PI) des cellules et l&#39;analyse de la teneur en ADN par cytométrie en flux. Nous montrons que l&#39;utilisation combinée de deux protocoles de synchronisation est une approche robuste pour déterminer clairement les profils transcriptionnels des gènes qui sont différentiellement réglementés dans le cycle cellulaire ( c.-à-d. E2F1 et E2F7) et par conséquent avoir une meilleure compréhension de leur rôle dans le cycle cellulaire Processus. En outre, nous montrons que cette approche est utile pour l&#39;étude des mécanismes sous-jacents aux thérapies à base de médicaments ( c&#39;est-à-dire la mitomycine C, un agent anticancéreux), car elle permet de discriminer les gènes qui réagissent à l&#39;agent génotoxique de ceux qui sont uniquement affectés par des perturbations du cycle cellulaire Imposé par l&#39;agent.

Représentation schématique des protocoles Thy-Noc et HU pour la synchronisation des cellules. La figure 1 résume les étapes requises pour la synchronisation des cellules U2OS et la collecte ultérieure des échantillons afin de vérifier la progression à travers le cycle cellulaire et d&#39;effectuer des analyses d&#39;expression des gènes. Les colorants Pho...

Nous rapportons deux protocoles de synchronisation cellulaire qui fournissent un contexte pour étudier les événements liés à des phases spécifiques du cycle cellulaire. Nous montrons que cette approche est utile pour analyser la régulation de gènes spécifiques dans un cycle cellulaire non perturbé ou lors de l&#39;exposition à des agents affectant le cycle cellulaire.

The gene expression program of the cell cycle represents a critical step for understanding cell cycle-dependent processes and their role in diseases such ...

L'objectif général de ce protocole est de fournir un contexte pour l'analyse de l'expression génique de manière spécifique au cycle cellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer, liées aux événements transcriptionnels dépendants du cycle cellulaire qui sous-tendent la transformation maligne ainsi que le traitement anticancéreux. Le principal avantage de ce protocole est qu'il établit avec précision les profils d'expression génique spécifiques aux phases du cycle cellulaire, tant dans deux conditions différentes qu'après exposition à une chimiothérapie.Les cellules U2OS sont utilisées pour cette expérience et doivent être semées dans des boîtes de 100 millimètres le soir vers 19 heures afin que les étapes suivantes puissent être réalisées pendant les heures de travail. Laisser les cellules s'attacher en incubant les boîtes à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée avec 5 % CO2 pendant 24 heures.Le jour suivant, examiner les cellules pour confirmer qu'elles sont à 50 % de confluence. Pour le blocage par thymidine, ajouter 100 microlitres d'une solution mère de thymidine fraîchement préparée à 200 millimolaire à chaque boîte de

studying-cell-cycle-regulated-gene-expression-two-complementary-cell

Research

Recherche

JoVE Journal

Genetics

Génétique

Déterminer la position du cycle cellulaire d'une population de cellules, ou de comprendre comment les signaux affectent la prolifération, peut être facilement mesurée par cytométrie en flux en utilisant ce protocole. Nous rapportons une approche expérimentale simple pour coloration des cellules et de quantifier leur position dans le cycle cellulaire.

Analyse de la situation du cycle cellulaire dans les cellules de mammifères

Suivi des changements subtils dans la progression et la cinétique des étapes du cycle cellulaire peut être accompli par l'utilisation d'une combinaison de marquage métabolique des acides nucléiques avec BrdU et totale coloration de l'ADN génomique par l'iodure de propidium. Cette méthode évite la nécessité de la synchronisation chimique des cellules de cyclisme, empêchant ainsi l'introduction de dommages à l'ADN non-spécifique, ce qui affecte à son tour la progression du cycle cellulaire.

Mesure cinétique cellulaire avec la progression du cycle marquage métabolique et cytométrie de flux

La synchronisation des cellules bactériennes est essentielle pour l’étude du cycle et du développement des cellules bactériennes.  Caulobacter crescentus est synchronisable par centrifugation de densité, ce qui en fait un outil rapide et puissant pour l’étude du cycle cellulaire bactérien.  Nous fournissons ici un protocole détaillé pour la synchronisation des cellules Caulobacter.

Synchronisation de<em&gt; Caulobacter crescentus</em&gt; Des enquêtes sur le cycle cellulaire bactérienne

Ce protocole décrit l'utilisation de bromodésoxyuridine (BrdU) absorption pour permettre le suivi temporel des cellules qui étaient en phase S à un moment précis dans le temps. Addition de colorants d'ADN et de l'étiquetage d'anticorps facilite l'analyse détaillée du sort des cellules en phase S au temps plus tard.

Suivi temporel de la progression du cycle cellulaire par cytométrie en flux, sans la nécessité pour la synchronisation

Nous présentons un protocole pour la synchronisation de la thymidine double de cellules HeLa suivie d’analyse à l’aide de la microscopie confocale haute résolution. Cette méthode est essentielle pour obtenir le grand nombre de cellules qui procèdent de façon synchrone de la phase S de mitose, permettant des études sur les rôles mitotiques de protéines multifonctionnelles qui possèdent également des fonctions de l’interphase.

Combinant la synchronisation cellulaire mitotique et microscopie confocale haute résolution pour étudier le rôle des protéines multifonctionnelles Cycle cellulaire au cours de la mitose

Ce protocole décrit une méthode non invasive pour identifier efficacement les cellules en phase S pour les études de microscopie en aval, telles que la mesure du recrutement des protéines de réparation de l’ADN par micro-irradiation laser.

Micro-irradiation laser pour étudier le recrutement de l’ADN pendant la phase S

L’un des défis de l’analyse des expériences de séries chronologiques synchronisées est que les expériences diffèrent souvent par la durée de récupération de la synchronie et la période du cycle cellulaire. Ainsi, les mesures de différentes expériences ne peuvent pas être analysées globalement ou facilement comparées. Ici, nous décrivons une méthode d’alignement des expériences pour permettre des comparaisons spécifiques à la phase.

Alignement de données de séries chronologiques synchronisées à l’aide du modèle de synchronisation de perte de cycle cellulaire caractérisant pour les comparaisons entre expériences

Le protocole suivant présente la détection de foyers d’ADN simple brin dans la phase G1 du cycle cellulaire en utilisant la synchronisation du cycle cellulaire suivie d’une coloration immunofluorescente RPA2.

Visualisation des foyers d’ADN monocaténaire dans la phase G1 du cycle cellulaire

Ce protocole détaille deux méthodes d’arrêt du cycle cellulaire de levure et de libération facultative, et développe l’utilisation de la microscopie à fluorescence pour étudier les processus dépendants du cycle cellulaire chez S. cerevisiae.

Manipulation et analyse des processus dépendants du cycle cellulaire chez les levures bourgeonnantes

Ici, nous décrivons les paramètres pour surveiller en parallèle la bioluminescence circadienne et l’activité sécrétoire des cellules d’îlots de Langerhans humains et des myotubes primaires. Pour cela, nous avons utilisé l’administration d’un gène lentiviral d’un rapporteur d’horloge à noyau de luciférase, suivie d’une synchronisation in vitro et d’une collecte du milieu d’écoulement par périfusion cellulaire continue.

Mesure parallèle d&#39;expression Circadian Clock génique et la sécrétion d&#39;hormones dans des cultures de cellules humaines primaires

Découvrez deux protocoles de synchronisation cellulaire pour analyser l'expression génique spécifique au cycle cellulaire dans les cellules U2OS. Ces méthodes permettent d'étudier les événements transcriptionnels liés au cancer et aux traitements chimiothérapeutiques.

Étude de lexpression génétique régulée par un cycle cellulaire par deux protocoles complémentaires de synchronisation cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal

Étude de l'expression génétique régulée par un cycle cellulaire par deux protocoles complémentaires de synchronisation cellulaire

Explorer plus de vidéos