Étude de l'expression génétique régulée par un cycle cellulaire par deux protocoles complémentaires de synchronisation cellulaire

L’objectif général de ce protocole est de fournir un contexte pour l’analyse de l’expression des gènes d’une manière spécifique au cycle cellulaire. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du cancer liées aux événements transcriptionnels dépendants du cycle cellulaire qui sous-tendent la transformation maligne ainsi que le traitement anticancéreux. Le principal avantage de ce protocole est qu’il établit avec précision des modèles d’expression génique spécifiques à la phase du cycle cellulaire à la fois dans les conditions numéro deux et après une exposition à la chimiothérapie.

Des cellules U2OS sont utilisées pour cette expérience et doivent être ensemencées dans des boîtes de 100 millimètres le soir vers sept heures afin que les étapes suivantes puissent être effectuées pendant les heures de travail. Laissez les cellules se fixer en incubant les plats à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2 pendant 24 heures.

Le lendemain, examinez les cellules pour confirmer qu’elles sont à 50 % de confluence. Pour le bloc de thymidine, ajoutez 100 microlitres d’un stock de thymidine de 200 millimolaires fraîchement préparé dans chaque plat de culture de 100 millimètres. Incuber les cellules avec de la thymidine à 37 degrés Celsius dans une atmosphère humidifiée avec 5 % de CO2 pendant 20 heures.

Le lendemain, vers 14 h, libérez les cellules du bloc de thymidine en retirant le milieu de croissance contenant de la thymidine. Lavez les cellules deux fois avec du PBS 1X préchauffé.

Et puis ajoutez 10 millilitres de milieu complet à chaque plat de 100 millimètres. Incuber des cellules à 37 degrés Celsius pendant cinq heures. Pour l’arrêt cellulaire mitotique, ajoutez du nocodazole à une concentration finale de 50 nanogrammes par millilitre.

Incuber des cellules avec du nocodazole pendant 10 à 11 heures au maximum. Le lendemain matin, entre six et sept heures, vérifiez les cellules au microscope pour confirmer qu’elles sont bien bloquées dans G2-M, ce qui est indiqué par leur aspect arrondi.

Détachez les cellules mitotiques en secouant chaque plaque et en pipetant doucement le milieu de croissance contenant du nocodazole avec des cellules détachées de chaque plaque de 100 millimètres. Combinez les cellules mitotiques de toutes les boîtes dans un tube stérile de 50 millilitres. Centrifugez 300 fois g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius.

Laver les cellules deux fois en ajoutant du 1X PBS froid, suivi d’une centrifugation. Après avoir retiré le PBS du deuxième lavage, remettre les cellules mitotiques en suspension dans un milieu de culture complet. Économisez deux millilitres pour l’extraction de l’ARN et deux millilitres pour l’analyse FACS pour le point de temps zéro heure.

Replaquez les cellules mitotiques restantes pour les points temporels suivants dans des plaques à six puits. Pour commencer cette procédure, ensemencez 0,25 fois 10 à la sixième cellule U2OS par puits dans six plaques de puits. Sur le couvercle de chaque plaque de six puits, écrivez la condition expérimentale de chaque puits.

Par exemple, non traité ou traité avec une concentration différente du médicament et des points temporels. Laissez les cellules se fixer en incubant les six plaques de puits pendant la nuit. Le lendemain matin, examinez les cellules pour confirmer qu’elles sont à 50 % de confluence.

Retirez le milieu complet des puits et ajoutez deux millilitres de milieu DMEM-Glutamine préchauffé et sans FBS par puits. Incuber les cellules pendant 24 heures supplémentaires. Pour arrêter les cellules avec de l’hydroxyurée, retirez le milieu des puits et remplacez-le par un milieu complet contenant de l’hydroxyurée à quatre micromolaires fraîchement préparé.

Incuber les cellules dans un milieu contenant de l’hydroxyurée pendant 24 heures. Avant de libérer les cellules de l’arrêt médié par l’hydroxyurée, vérifiez les cellules pour confirmer qu’elles sont arrêtées. Retirez le milieu contenant de l’hydroxyurée des puits et rincez les puits deux fois avec du PBS 1X préchauffé.

Après avoir retiré le PBS du deuxième lavage, ajoutez deux millilitres de milieu complet par puits. Conservez les plaques dans l’incubateur jusqu’au prélèvement de l’échantillon. Les échantillons des deux protocoles de synchronisation sont collectés de la même manière pour l’analyse FACS et pour l’extraction de l’ARN.

Pour l’analyse FACS, rincez bien chaque puits avec deux millilitres de PBS 1X préchauffé, puis ajoutez 0,3 millilitre de solution de trypsine-EDTA préchauffée pour détacher les cellules. Après cinq minutes, inactivez la trypsine-EDTA en ajoutant un millilitre de milieu complet. Prélevez chaque échantillon dans un tube séparé de 15 millilitres.

Centrifuger les cellules à 300 fois G à température ambiante pendant cinq minutes. Jetez le surnageant, lavez avec 1X PBS et essorez à nouveau. Retirez le PBS et conservez la pastille cellulaire.

Afin de fixer les cellules, remettez en suspension chaque pastille cellulaire dans un millilitre d’éthanol réfrigéré à 70 % en tourbillonnant doucement. Placez les cellules sur de la glace pendant environ 15 minutes avant la coloration à l’iodure de propidium et l’analyse FACS. Pour l’extraction de l’ARN, retirez le milieu et rincez bien chaque avec deux millilitres de PBS 1X préchauffé.

Apportez la plaque dans une armoire de sécurité et ajoutez un millilitre de réactif d’isolement d’ARN approprié par puits. Pipetez de haut en bas pour pipeter et lyser les cellules, puis transférez chaque lysat cellulaire dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes.

Commencez la procédure d’extraction de l’ARN en récupérant du congélateur les tubes de microcentrifugation contenant des échantillons dans le réactif d’isolement de l’ARN, et en les décongelant à température ambiante à l’intérieur d’une enceinte de sécurité pour les produits chimiques. Ajoutez 400 microlitres de chloroforme à chaque échantillon et agitez vigoureusement sans tourbillonner jusqu’à ce que le tout soit complètement mélangé. Incuber les échantillons à température ambiante pendant cinq minutes.

Centrifugez les tubes pendant 15 minutes dans une microcentrifugeuse de paillasse. Transférez la phase aqueuse de chaque échantillon dans un nouveau tube de microcentrifugation de 1,5 millimètre. Ajoutez lentement un volume d’éthanol à 100 %, goutte à goutte, à la phase aqueuse tout en mélangeant.

Ne pas centrifuger. Transférez jusqu’à 700 microlitres de chaque échantillon, y compris tout précipité qui aurait pu se former dans une colonne de spin dans un tube de prélèvement de deux millilitres fourni par un kit de mini-préparation d’ARN commercial, et fermez le couvercle. Centrifuger pendant 15 secondes.

Jetez le flux continu. Si vous partez de plus de 700 microlitres par échantillon, transférez l’échantillon restant dans la colonne de centrifugation et centrifugez-le à nouveau. Après avoir lavé l’ARN selon les instructions du fabricant, éluez chaque échantillon en pipetant 30 à 40 microlitres d’eau libre de nucléases dans la colonne de spin et en centrifugeant à température ambiante pendant une minute.

Déterminer la concentration et la pureté de l’ARN des échantillons à l’aide de mesures d’absorbance. Conservez les échantillons d’ARN à moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils soient utilisés pour l’analyse de l’expression génique. Le traitement par le protocole Thymidine-Nocodazole arrête les cellules U2OS en entrée en phase m, et fournit une population cellulaire qui progresse de manière synchrone à travers G1 et en phase S, comme le montre l’analyse par cytométrie en flux.

Le traitement par le protocole Hydroxyurea arrête les cellules à la limite G1/S. Lors de la libération, les cellules passent de manière synchrone par les phases S et G2. Le protocole Thymidine-Nocodazole est le plus adapté pour analyser les profils d’ARNm des gènes avec un pic d’expression pendant la phase G1.

Comme illustré pour l’expression E2F1. En revanche, le protocole Hydroxyurea fonctionne mieux pour l’analyse des gènes avec une expression préférentielle en S ou G2, comme illustré pour l’expression de E2F7. Le cycle cellulaire est généralement perturbé par les médicaments antitumoraux, comme en témoigne l’arrêt permanent de la phase G2 imposé par la mitomycine C dans les cellules synchronisées avec l’hydroxyurée.

La sychronisation cellulaire aide à distinguer les gènes qui répondent à l’agent antitumoral de ceux qui sont uniquement affectés par les perturbations du cycle cellulaire imposées par l’agent, par exemple, une réduction des niveaux d’ARNm E2F1 après un traitement à la mitomycine C est probablement un effet indirect du médicament sur la dynamique du cycle cellulaire. En revanche, le pic d’expression de l’ARNm p21-Cip1 après un traitement à la mitomycine C est directement le résultat d’un programme transcriptionnel déclenché par ce médicament. À la suite de cette procédure, une analyse transcriptomique et protéomique à l’échelle du génome peut être effectuée, afin de démêler les changements globaux d’expression génique affectant des phases spécifiques du cycle cellulaire.

Soit dans les conditions numéro deux, soit lors de traitements anti-tumoraux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des procédures requises pour effectuer une analyse de l’expression génique dans des cultures cellulaires synchronisées. N’oubliez pas que travailler avec des réactifs d’isolement d’iodure de propidium ou d’ARN peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que des gants et une enceinte de sécurité pour les produits chimiques doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.