Name: Visualisation des foyers d’ADN monocaténaire dans la phase G1 du cycle cellulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2023-12-22T13:40:00.000+00:00
Duration: 8 min 30 s
Description: Découvrez la visualisation des foyers d'ADN monocaténaire dans la phase G1 du cycle cellulaire en utilisant le marquage immunofluorescent de RPA2 sur des cellules RPE1. Cette méthode offre un meilleur rapport signal/bruit que l'approche BrdU traditionnelle.

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Les auteurs remercient Michele Pagano pour son soutien et ses idées utiles, Ashley Chui et Sharon Kaisari pour leur lecture critique du manuscrit, et Jeffrey Estrada et Vilma Diaz pour leur soutien continu. Ce travail a été soutenu par un supplément de diversité au GM136250 de subvention des National Institutes of Health.

1. Maintien des cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes immortalisées par hTERT (RPE1)
<ol><li>Maintenir les lignées cellulaires RPE1 dans le milieu Eagle modifié (DMEM) de Dulbecco, complétées par 10 % de sérum de veau fœtal inactivé par la chaleur (Hi-FBS) et 100 μg/mL de pénicilline-streptomycine (désormais appelée milieu de culture) dans un incubateur humidifié contenant 5 % de CO2 à 37 °C. Pour la culture de routine, cultivez les cellules RPE1 dans une boîte de 15 cm traitée par culture tissulaire et divisez-les lorsque vous atteignez une confluence de 80 à 90 % (~16-18 × 10 cellulesde 6 cellules par boîte de 15 cm).</li>
	<li>Lors de la fendillement, retirez le milieu et rincez les cellules avec 10 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x.</li>
	<li>Ajouter 3 mL de trypsine-EDTA à 0,05 % pour couvrir toute la surface du plat. Maintenez les cellules à 37 °C avec la trypsine jusqu’à ce qu’elles se détachent.</li>
	<li>Après la trypsinisation, remettre les cellules en suspension avec un milieu de culture et les faire tourner à 150 × g pendant 5 min à température ambiante (RT, 22-25 °C). Retirer le surnageant et remettre délicatement les cellules en suspension dans 10 mL de milieu de culture.</li>
	<li>Semez 1,6 à 1,8 × 106 cellules dans une nouvelle boîte de 15 cm (~1 mL de suspension cellulaire). REMARQUE : Tous les travaux de culture tissulaire doivent être effectués selon les niveaux de sécurité BSL-2. Le temps d’incubation de la trypsinisation dépend de la confluence cellulaire. Habituellement, le processus prend 2 à 3 minutes pour une plaque confluente à 90 %. Les cellules doivent faire l’objet d’un dépistage régulier de la contamination par les mycoplasmes à l’aide de trousses disponibles dans le commerce (voir les exemples dans le tableau des matériaux).</li>
</ol>2. Inactivation par l’ARNi du gène d’intérêt (GOI)
<ol><li>Semer 1,0 × 106 cellules RPE1 dans une plaque de 10 cm traitée pour la culture tissulaire avec 10 mL de milieu de culture la veille de la transfection.</li>
	<li>Le jour de la transfection, complexer le siRNA. Pour une plaque de 10 cm, utiliser une concentration finale de 20 nM siRPA2 et 12 μL de réactif de transfection à base de lipides dans 500 μL de milieu de transfection à faible teneur en sérum. Mélangez délicatement tous les composants en effleurant le tube et incubez à RT (22-25 °C) pendant 5 min.</li>
	<li>Ajouter le mélange d’ARNsi complexé aux cellules goutte à goutte et incuber les cellules avec l’ARNi pendant 48 h.</li>
</ol>3. Synchronisation des cellules RPE1 en phase G0
<ol><li>Trypsiniser les cellules RPE1 à partir de l’étape 2.3 comme indiqué dans la section 1 (~2 × 106 cellules).</li>
	<li>Transvaser la suspension cellulaire dans des tubes à centrifuger de 15 mL et la centrifuger à 150 × g, RT (22-25 °C) pendant 5 min.</li>
	<li>Retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans 12 mL de PBS. Centrifuger les cellules à 150 × g à RT (22-25 °C) pendant 5 min. Répétez l’élimination du surnageant et la centrifugation deux fois.</li>
	<li>Remettre les cellules en suspension dans 10 mL de DMEM sans sérum complété par 100 μg/mL de pénicilline-streptomycine,  1 mM de pyruvate de sodium, 15 mM d’HEPES, et les déposer sur une boîte de culture tissulaire de 10 cm. REMARQUE : Si les cellules ont tendance à s’agglutiner, remettez-les en suspension dans seulement 1 mL de DMEM sans sérum et pipetez-les de haut en bas 5 fois à l’aide d’un embout P1000 pour déloger les grumeaux avant de diluer la suspension jusqu’à un volume final de 10 mL.</li>
	<li>Après 24 h de privation de sérum, introduire le deuxième cycle de silençage en utilisant la même procédure que celle décrite dans la section 2 en ajoutant l’ARNi complexé aux cellules affamées de sérum.</li>
	<li>Conservez les cellules RPE1 dans un DMEM sans sérum pendant 72 h avant de procéder à la libération de G1.</li>
</ol>4. Revêtement de lamelles et libération des cellules en phase G1
<ol><li>Stérilisez la pince à épiler avec de l’éthanol à 70 % et placez une seule lamelle de verre (12 mm de diamètre et #1,5 d’épaisseur [0,17 mm]) dans un puits d’une plaque de 24 puits.</li>
	<li>Diluer la matrice d’enrobage de vitronectine avec du PBS pour obtenir une concentration finale de 10 μg/mL. Ajouter 500 μL de la solution de vitronectine dans chaque puits contenant les lamelles et incuber pendant 1 h à RT.</li>
	<li>Retirez la solution d’enrobage et lavez les lamelles avec 1 mL de PBS.</li>
	<li>Détacher les cellules RPE1 affamées de sérum de la plaque traitée de culture tissulaire de 10 cm en utilisant 1 mL de trypsine à 0,05 % après un lavage PBS pendant 1 min à 37 °C. REMARQUE : Les cellules se détachent beaucoup plus rapidement après la famine sérique. Soyez prudent lorsque vous lavez les cellules avec du PBS et utilisez des temps de trypsinisation courts.</li>
	<li>Pour inactiver la trypsine, remettre en suspension les cellules RPE1 dans un total de 6 mL de milieu de culture. Retirez la trypsine inactivée en faisant tourner les cellules à l’aide de 150 × g à RT (22-25 °C) pendant 5 min.</li>
	<li>Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu de culture et mesurer le nombre de cellules.</li>
	<li>Semer 4 × 104 cellules RPE1 sur la lamelle enrobée dans un total de 500 μL de milieu de culture. REMARQUE : Assurez-vous que la viabilité de la cellule est supérieure à 90% avant de passer aux étapes en aval. La viabilité cellulaire a pu être rapidement évaluée par coloration au bleu de trypan pendant l’étape de comptage cellulaire.</li>
	<li>Après 6 h de placage des cellules dans le milieu de culture, les cellules libérées par G0 seront en phase G1 précoce. Effectuez des expériences en G1 dans cette fenêtre de 6 à 12 h avant que les cellules ne commencent à entrer dans la phase S.</li>
	<li>Avant d’introduire des dommages à l’ADN, pulser les cellules avec 10 μM de 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) pendant 30 min à 37 °C, dilué dans un milieu de culture.</li>
	<li>Retirez le milieu contenant de l’EdU et poursuivez les cellules avec 10 μM de thymidine pendant 10 min à 37 °C pour empêcher l’incorporation restante d’EdU pendant l’induction des dommages à l’ADN.</li>
	<li>Retirer le milieu avec de la thymidine et traiter les cellules avec 250 μM H2O2 pendant 1 h, dilué dans un milieu de culture.</li>
</ol>5. Marquage par immunofluorescence de l’ADNss
<ol><li>Laver les cellules une fois avec 1 mL de RT (22-25 °C) PBS pour éliminer les composants du milieu et du sérum. REMARQUE : Soyez doux lorsque vous lavez les cellules pour éviter qu’elles ne se détachent et ne sèchent. Ne traitez pas plusieurs puits en même temps.</li>
	<li>Pré-extraction : Incuber les cellules lavées dans 1 mL de tampon d’extraction CSK (tableau 1) pendant 5 min à RT (22-25 °C). REMARQUE : La pré-extraction CSK élimine toutes les protéines non liées à la chromatine, y compris la RPA2 soluble. ATTENTION : Triton X-100 est nocif en cas d’ingestion et peut provoquer une irritation de la peau et des lésions oculaires.</li>
	<li>Retirez le tampon CSK des cellules et fixez-les directement en ajoutant 0,5 mL de solution de paraformaldéhyde à 3,6 % (dans du PBS) contenant 0,05 % de Triton X-100 pendant 10 min à RT (22-25 °C). ATTENTION : Il est important de préparer 3,6 % de PFA à partir de 32 % de PFA frais. Le paraformaldéhyde peut causer de graves lésions oculaires, une irritation de la peau et une irritation des voies respiratoires.</li>
	<li>Lavez les cellules une fois avec 1 mL de PBS contenant 0,05 % de Triton X-100 pour éliminer le PFA.</li>
	<li>Perméabiliser davantage les cellules à l’aide de 1 mL de PBS contenant 0,5 % de Triton X-100 pendant 15 min à RT (22-25 °C).</li>
	<li>Réaction EdU click-IT pour visualiser les cellules qui se répliquent (phase S)<ol><li>Retirez la solution de perméabilisation et lavez les cellules 2 fois avec 1 mL de tampon bloquant (tableau 1). ATTENTION : L’albumine sérique bovine (BSA) peut provoquer une irritation des voies respiratoires.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de tampon bloquant (tableau 1) et agiter doucement la plaque contenant la lamelle pendant 10 min à RT (22-25 °C).</li>
		<li>Retirer le tampon bloquant et ajouter 500 μL de cocktail de réaction par clic contenant de l’azoture de picolyle 647 (tableau 1). Incuber les lamelles pendant 30 min à RT (22-25 °C) en les berçant doucement et effectuer des incubations en aval dans l’obscurité. REMARQUE : Lors de l’utilisation d’anticorps BrdU, utilisez le double de la quantité (1 ml) et de la durée (60 min) de la réaction de clic recommandée par le fabricant pour vous assurer que la réaction est saturée et que l’EdU incorporé est étiqueté. Cela limite la réactivité croisée des anticorps BrdU27.</li>
	</ol></li>
	<li>Retirez le mélange de réaction d’encliquetage et lavez les cellules 2 fois avec du PBS avec 0,05 % de Triton X-100 pendant 10 min à RT (22-25 °C) (Figure 1 et Figure 2).</li>
	<li>Ajouter 1 mL de tampon bloquant et incuber à RT (22-25 °C) pendant 30 min. Vous pouvez également conserver les cellules dans un tampon bloquant à 4 °C pendant la nuit.</li>
	<li>Appliquer l’anticorps primaire (rat anti-RPA2, dilution de 1 :1 000) pendant 2 h à RT (22-25 °C) dans 250-500 μL de tampon bloquant avec un léger balancement.</li>
	<li>Lavez les cellules 2 fois avec du PBS contenant 0,05 % de Triton X-100 pour éliminer rapidement la majeure partie de la solution d’anticorps.</li>
	<li>Continuez à laver les cellules pendant 3 x 10 min avec un tampon de blocage à RT (22-25 °C).</li>
	<li>Appliquer l’anticorps secondaire (anti-rat Alexa-488, dilution 1 :1 000) dans 250-500 μL de tampon bloquant à RT (22-25 °C) pendant 2 h avec un léger balancement.</li>
	<li>Lavez les cellules avec un tampon bloquant 2 fois pour éliminer rapidement la majeure partie de l’anticorps secondaire. Continuez à laver les cellules pendant 3 x 10 min avec du PBS contenant 0,05 % de Triton X-100 à RT (22-25 °C).</li>
	<li>Pour contre-colorer les noyaux, laver les cellules une fois avec du PBS contenant 0,05 % de Triton X-100 et 1 μg/mL de 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) pendant 10 min à RT (22-25 °C). Laver les cellules une fois avec du PBS pendant 5 min à RT (22-25 °C).</li>
	<li>Montez la vitre de protection sur les lames de microscope à l’aide de 10 μL de support de montage/lamelle. Trempez les lamelles dans de l’eau distillée avant de les monter pour vous débarrasser des cristaux de sel. Visualisez les lames le lendemain et conservez-les à 4 °C pendant des semaines (figure 3).</li>
</ol>6. Acquisition et quantification d’images
<ol><li>Pour capturer des images, utilisez n’importe quel microscope à épifluorescence disponible équipé de jeux de filtres de routine pour imager les canaux DAPI, FITC et Cy5 avec un grossissement d’au moins 60 à 63x, une ouverture numérique élevée et des objectifs pétroliers afin de visualiser les foyers nucléaires. REMARQUE : L’excitation DAPI optimale est de ~359 nm ; L’excitation d’Alexa 488 est de ~488 nm ; tandis que l’excitation d’Alexa 647 est de ~647 nm.</li>
	<li>Pour l’analyse d’image, ouvrez les fichiers image dans Fiji/ImageJ.<ol><li>Fabriquer des masques nucléaires à l’aide de la coloration DAPI (figure 4A-F et vidéo supplémentaire S1).<ol><li>Ouvrez l’image DAPI.</li>
			<li>Sélectionnez Traiter | Améliorez le contraste et définissez le pixel saturé sur 0,35.</li>
			<li>Cliquez sur Traiter | Binaire | Convertir en masque. Choisissez Binaire | Remplissez les trous et cliquez sur Analyser | Analysez les particules. Définissez la taille sur 10-Infinity.</li>
			<li>Dans le gestionnaire de retour sur investissement, cliquez sur Afficher tout.</li>
		</ol></li>
		<li>Recherche de foyers RPA2 dans le noyau (Figure 4G, H et vidéo supplémentaire S1)<ol><li>Ouvrez l’image RPA2.</li>
			<li>Choisissez Processus | Trouvez Maxima. Définissez la proéminence sur une valeur qui met en évidence les foyers RPA2 (entre 500 et 750), en les séparant de l’arrière-plan.</li>
			<li>Enfin, cliquez sur le bouton Mesurer dans le Gestionnaire de retour sur investissement.</li>
			<li>Calculez le nombre total de foyers d’ADNss nucléaire en divisant la valeur de la colonne RawinDen par 255 (la valeur maximale de l’intensité des pixels dans chaque foyer).</li>
		</ol></li>
		<li>Effectuez des analyses statistiques à l’aide de l’outil logiciel statistique de votre choix. REMARQUE : Exclure de l’analyse toutes les cellules EdU positives et les masques DAPI mal segmentés.</li>
	</ol></li>
</ol>

Détection de foyers d’ADN monocaténaire en phase G1 par coloration immunofluorescente RPA2

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Les auteurs n’ont pas d’intérêts concurrents à déclarer.

Le maintien d’une culture cellulaire saine et exempte de mycoplasmes est essentiel pour toutes les expériences décrites ci-dessus. Les cellules RPE1 ont une forte fixation aux articles en plastique traités par culture tissulaire dans des milieux de culture normaux ; Cependant, leurs caractéristiques de liaison diminuent considérablement lorsqu’elles sont conservées dans des conditions sans sérum. De plus, pour capturer des images haute résolution des foyers d’ADNss au microscope, les cellules doivent être plaquées sur un verre de protection de 0,17 mm d’épaisseur, qui n’est pas suffisamment hydrophile pour permettre une fixation correcte des cellules RPE1. Sans cellules correctement aplaties et uniformément réparties, il est très difficile de visualiser les foyers individuels d’ADNss. Par conséquent, il est essentiel de choisir le matériau de revêtement approprié (par exemple, la vitronectine) et de laisser suffisamment de temps (6 à 12 h) pour que les cellules se propagent et se fixent après les avoir libérées en phase G1.
Une partie difficile du protocole consiste à obtenir des cellules RPE1 homogènes synchronisées avec G1. Cela nécessite deux étapes essentielles. Tout d’abord, pour une famine sérique efficace, les cellules doivent être trypsinisées, soigneusement lavées avec du PBS et directement ensemencées sur de nouvelles boîtes de culture tissulaire à l’aide d’un milieu sans sérum. Le lavage des cellules directement dans des boîtes de culture tissulaire pour éliminer le sérum ne donnera pas une synchronisation efficace de G0. Deuxièmement, lors de la libération des cellules en phase G1, les cellules doivent être trypsinisées à nouveau et ensemencées sur des plaques de culture de tissus frais. De même, le simple fait de changer le milieu et d’ajouter un milieu de culture contenant du sérum aux cellules n’entraînera pas une entrée synchrone de G1. De plus, pour une entrée correcte de G1, la densité d’ensemencement des cellules sur les verres de protection enduits doit être à certains niveaux de confluence. Bien qu’une synchronisation cellulaire parfaite soit généralement impossible, ce protocole de synchronisation décrit ici donne une population G1 pure de ~97%. La densité de semis recommandée pour RPE1 sur une lamelle de 12 mm de diamètre est de ~4 × 104 afin d’obtenir un champ de vision homogène pour l’imagerie, avec une confluence d’environ 70 %. Une densité d’ensemencement plus élevée provoque le détachement et le « décollement » des cellules après l’extraction de CSK et entraîne un signal de fond plus élevé lors de l’acquisition de l’image.
Pour réduire tout signal de fond et obtenir un rapport signal/bruit favorable, un lavage minutieux après l’incubation des anticorps primaires et secondaires est essentiel. Étant donné que de nombreuses étapes de lavage doivent être appliquées, il est également essentiel d’éviter que le puits ne se dessèche à chaque étape de lavage. Nous minimisons cet artefact en appliquant un minimum de 0,05 % de Triton X-100 dans toutes les étapes de lavage et d’incubation. Une fois les puits asséchés, les cellules ont affiché un rapport signal/bruit altéré ; Cela conduit à un motif en forme de mosaïque au microscope et pourrait interférer avec l’évaluation. L’acquisition d’images Z-stack combinée à la déconvolution peut aider à capturer des foyers dans différents plans focaux pour améliorer l’analyse.
Les méthodes conventionnelles reposent sur la détection du BrdU incorporé dans des conditions non dénaturantes. Ces méthodes, cependant, dépendent du prétraitement des cellules avec des doses élevées de BrdU pendant au moins 1 à 2 jours (ou un temps équivalent à un cycle cellulaire complet dans la lignée cellulaire utilisée) pour assurer une incorporation génomique uniforme. Il n’est pas souhaitable qu’une incorporation étendue de BrdU puisse provoquer des interférences dans le cycle cellulaire36. Pour remédier à ces limitations, cette méthode utilise la RPA2 endogène pour détecter les foyers d’ADNss. Cette approche ne nécessite pas d’incorporation BrdU pilotée par réplication, elle peut également être utilisée dans les cellules post-mitotiques. Étant donné qu’il n’est pas nécessaire d’intégrer BrdU à grande échelle, cela permet de gagner du temps et de réduire la complexité expérimentale. En utilisant la coloration RPA2 pour visualiser l’ADNss, nous pouvons utiliser la 2′-désoxy-5-éthynyluridine (EdU) et la chimie click pour marquer la réplication de l’ADN tout en évitant une éventuelle réactivité croisée des anticorps BrdU contre EdU 27,37,38. Des précautions particulières doivent être prises pour masquer correctement l’EdU incorporé lors de la réaction de clic afin que les anticorps BrdU ne réagissent pas de manière croisée avec l’EdU27,39.
Enfin, un avantage important de l’utilisation de RPA2 au lieu de BrdU est simplement d’avoir un rapport signal/bruit supérieur par rapport à la coloration BrdU en dehors de la phase S. Nous avons constaté que la coloration BrdU non dénaturante et sa capacité à visualiser l’ADNss sont limitées à la phase S, même dans les cellules en réplication (Figure 2). L’anticorps BrdU ne se lie qu’au BrdU suffisamment exposé dans les étirements de l’ADNss. La liaison des protéines de réparation, y compris RPA2, aux étirements de l’ADNss peut supprimer ou entraver l’exposition suffisante de BrdU dans l’ADNss. Nous avons également constaté que la pré-extraction CSK est nécessaire pour la visualisation de l’ADNss à l’aide de l’anticorps BrdU. Cela est possible parce que les traces d’ADNss ne sont pas accessibles pour l’anticorps sans en retirer les composants protéiques légèrement liés.
Néanmoins, il existe certaines limitations associées à ce protocole. L’une des limites de l’utilisation de RPA2 pour la détection de l’ADNss est la nécessité d’optimiser l’étape de pré-extraction de la CSK. Non lié, l’excès de RPA2 doit être éliminé de l’ADN avant de fixer les cellules. D’une part, la sous-extraction conduit à un bruit de fond élevé en raison de la fraction protéique RPA2 qui n’est pas liée à l’ADNss. D’autre part, une surextraction entraînera une perte de signal. Pour la détection de BrdU, il ne s’agit pas d’une variable puisque BrdU est incorporé de manière stable dans l’ADN et ne peut pas être éliminé par pré-extraction. Par conséquent, le moment de la pré-extraction CSK, la quantité de Triton X-100 dans le tampon, le volume et la température à laquelle la pré-extraction est effectuée doivent être soigneusement pris en compte. La pré-extraction CSK limite également l’utilisation de la taille du noyau pour distinguer les cellules G0/G1 des cellules S/G2.
De plus, nous ne pouvons pas exclure la possibilité qu’une partie du signal provenant de RPA2 provienne de sa liaison à d’autres interacteurs protéiques de liaison à la chromatine. Il faut également tenir compte de la spécificité de l’espèce de l’anticorps RPA2. L’anticorps utilisé dans ce protocole peut reconnaître l’APR2 humaine, la souris, le rat, le hamster et le singe. Une autre limite de cette approche est que toutes les lignées cellulaires ne peuvent pas être privées de sérum pour la synchronisation G0. La plupart des lignées cellulaires cancéreuses peuvent contourner les points de contrôle du cycle cellulaire et proliférer même dans les milieux privés de sérum. Bien que la privation de sérum soit bénéfique, car elle ne cause pas de dommages à l’ADN, il faut surveiller attentivement l’efficacité de la synchronisation cellulaire pour s’assurer que l’enrichissement de phase du cycle cellulaire est approprié. Pour les cellules qui ne répondent pas à la privation sérique, d’autres méthodes de synchronisation cellulaire doivent être envisagées (par exemple, la secousse mitotique, l’inhibition de CDK1 pour l’arrêt de G2 ou des techniques non invasives telles que l’élutriation centrifuge). Une autre méthode possible consiste à utiliser l’imagerie à haut contenu pour mesurer l’EdU et la teneur en ADN nucléaire pour le profilage du cycle cellulaire des cellules asynchrones31. Il faut tenir compte des implications de l’utilisation d’autres méthodes de synchronisation pour éviter les interférences avec l’analyse en aval. Par exemple, l’utilisation d’un double bloc de thymidine ou d’aphidicoline, souvent utilisée dans la littérature, entraînera un stress de réplication et des dommages à l’ADN40.
L’étude des mécanismes de réparation de l’ADN continue d’être un point central de discussion dans les domaines du cancer et de la biologie cellulaire. Le protocole présenté ici offre une approche précieuse pour la préparation des cellules, permettant la visualisation et l’analyse quantitative de l’ADNss lors de l’exposition à des agents endommageant l’ADN. Notamment, ce protocole met en évidence l’utilisation de la protéine de liaison à l’ADNss, RPA2, démontrant sa grande spécificité pour visualiser de petites quantités de foyers d’ADNss tout en évitant une réactivité croisée indésirable dans toutes les phases du cycle cellulaire. L’utilisation de la RPA2 présente de nombreux avantages, notamment pour les chercheurs qui souhaitent analyser des cellules en phase G1 du cycle cellulaire. Ce protocole tient compte de plusieurs limitations et répond aux préoccupations liées aux interférences de signal, au bruit de fond indésirable et à la réactivité croisée lors de l’utilisation de la coloration RPA2 ou BrdU pour détecter l’ADNss.

Pour maintenir la vie, les cellules surveillent et réparent constamment l’ADN afin de maintenir leur intégrité génomique. Les cellules peuvent accumuler divers types de dommages à l’ADN en raison de sources endogènes (p. ex., oxydation, alkylation, désamination, erreurs de réplication) et exogènes (p. ex., UV, irradiation ionisante) de facteurs de stress de l’ADN. L’incapacité à réparer ces lésions entraîne soit l’apoptose, soit l’arrêt du cycle cellulaire, soit la sénescence et peut entraîner des maladies1. Les lésions de l’ADN peuvent être traitées par l’une des principales voies de réparation de l’ADN suivantes : DR (réparation directe par inversion), qui répare principalement les bases alkylées2 ; BER (réparation par excision de base), qui cible les erreurs de bases d’ADN non volumineuses et les cassures d’ADN simple brin (SSB)3 ; NER (réparation par excision de nucléotides) corrigeant les lésions volumineuses de l’ADN qui déforment l’hélice4 ; MMR (réparation des mésappariements) ciblant principalement les incompatibilités d’ADN, les boucles d’insertion/délétion (IDL) et certains dommages de base5 ; NHEJ (jointure d’extrémité non homologue) et HRR (réparation par recombinaison homologue) qui sont tous deux actifs au niveau des cassures d’ADN double brin (DSB)6 ; et TLS (synthèse de translésion), qui est un mécanisme de dérivation des lésions de l’ADN7. Bien que ces voies aient des spécificités de substrat distinctes, il existe certains chevauchements entre elles afin d’assurer la redondance pour une réparation efficace. Il est crucial de comprendre l’action des différentes voies de réparation de l’ADN dans les différentes phases du cycle cellulaire, car ces facteurs de réparation de l’ADN pourraient servir de cibles essentielles pour les approches thérapeutiques visant à traiter le cancer, le vieillissement et les troubles neurologiques.
L’ADN simple brin (ADNss) est généré tout au long du cycle cellulaire en raison de la réparation des lésions de l’ADN générées par des agents endommageant l’ADN endogène et exogène. Lors d’un stress génotoxique, l’ADNss est généré en abondance dans les phases S et G2 où HRR et MMR ont leur activité la plus élevée et lorsque la machinerie de réplication s’arrête ou s’effondre lorsqu’elle rencontre des lésions de l’ADN 6,10,11. D’autres voies de réparation de l’ADN (p. ex., NHEJ/jonction d’extrémités médiée par microhomologie (MMEJ)/recuit simple brin [SSA]) génèrent également de l’ADNss au cours de la réparation de la DSB12. Ces traces d’ADNss proviennent généralement de la résection de l’ADN, réalisée par des exonucléases telles que EXO1, DNA2 et CtIP pendant HR et MMR, des endonucléases telles que XPF et XPG pendant NER, ou par l’action combinée de POLB et FEN1 pendant BER 4,13,14,15,16,17,18,19 . En raison du travail de la machinerie de réplication, des traces d’ADNss sont également générées lorsque les hélicases d’ADN déroulent l’ADN devant les polymérases réplicatives liées au PCNA20. En revanche, dans la phase G1, l’absence de HRR et de réplication de l’ADN et l’activité limitée du MMR réduisent l’étendue des traces d’ADNss générées et sont donc plus difficiles à détecter 10,11,21.
Les traces d’ADNss cellulaires sont des structures très sensibles qui doivent être protégées pour éviter la formation de DSB. Ceci est réalisé en enrobant les pistes d’ADNss avec de la RPA. La RPA est un complexe protéique hétérotrimérique abondant composé de plusieurs sous-unités (RPA1, RPA2 et RPA3, également appelées RPA70, RPA32 et RPA14, respectivement), qui sont exprimées de manière ubiquitaire tout au long du cycle cellulaire22. Chaque sous-unité RPA contient un domaine de liaison à l’ADN (DBD), capable d’interagir avec 4 à 6 nucléotides, et les sous-unités combinées forment un noyau de trimérisation stable. Au total, la RPA se lie à environ 20 à 30 nucléotides avec une affinité sub-nanomolairede 23,24.
Les méthodes conventionnelles utilisent la microscopie à immunofluorescence (IF) pour visualiser les foyers d’ADNss en marquant la 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) incorporée dans l’ADN génomique à l’aide d’anticorps BrdU25. Cette approche repose sur le fait que les anticorps BrdU ne peuvent détecter BrdU que dans l’ADNss25 exposé. Bien que cette approche soit simple, elle présente également certaines limites. Par exemple, les cellules sont prétraitées pour incorporer du BrdU avant le début de l’expérience, ce qui prend du temps et peut interférer avec les effecteurs en aval. Par conséquent, la détection de l’ADNss basée sur BrdU est limitée aux cellules réplicatives et ne peut pas être utilisée pour les cellules quiescentes. Cela exclut l’application de cette méthode à l’étude de la réparation de l’ADN dans les cellules non réplicatives malgré son importance dans plusieurs maladies telles que le cancer et la neurodégénérescence 5,26. De plus, étant donné que les structures de BrdU et d’EdU sont très similaires, la plupart des anticorps BrdU présentent une réactivité croisée vis-à-vis de l’EdU, ce qui doit être pris en compte lors d’expériences de double marquage27. La coloration RPA a déjà été utilisée pour montrer des foyers d’ADNss principalement dans les cellules de la phase S ; cependant, certains articles l’ont également utilisé avec succès en dehors de la phase S 28,29,30,31,32,33,34,35. Le protocole suivant utilise efficacement les propriétés de la RPA, permettant la visualisation des foyers d’ADNss suite à des dommages à l’ADN dans la phase G1 du cycle cellulaire (bien qu’il puisse être utilisé dans toutes les phases du cycle cellulaire).

<table><tbody><tr><td>Anticorps anti-alpha-tubuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6074</td><td>anticorps primaire (1:5 000)</td></tr><tr><td>Axio Observer Microscope inversé</td><td>Zeiss</td><td>na</td><td>microscope</td></tr><tr><td>Bis-Tris Plus Mini Protein Gels, 4-12 %</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>NW04127BOX</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Albumine sérique bovine&nbsp ;</td><td>Jackson ImmunoResearch&nbsp ;</td><td>001-000-162</td><td>bloquant</td></tr><tr><td>BrdU (5-Bromo-2'-désoxyuridine)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B5002-100MG</td><td>analogue nucléotidique</td></tr><tr><td>Anticorps BrdU BU1/75</td><td>Abcam</td><td>ab6326</td><td>anticorps primaire (1:500)</td></tr><tr><td>CellAdhere Dilution Buffer</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07183</td><td>réactif de</td></tr><tr><td>revêtement Click-iT Plus EdU Flow Cytometry Assay Kits&nbsp ;</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>C10632</td><td>cytomère en flux&nbsp ;</td></tr><tr><td>Click-iT Plus EdU Kit de prolifération cellulaire pour l’imagerie, colorant Alexa Fluor 647</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10640</td><td>kit de réaction par clic</td></tr><tr><td>cOmplete ULTRA Comprimés inhibiteurs de protéase</td><td>Réactif Sigma-Aldrich</td><td>5892791001</td><td></td></tr><tr><td>Countess 3 Compteur de cellules automatisé</td><td>Thermo Scientific</td><td>AMQAX2000</td><td>compteur</td></tr><tr><td>de cellules Coverslip&nbsp ;</td><td>neuVitro</td><td>GG12PRE</td><td>culture tissulaire</td></tr><tr><td>Anticorps anti-cycline A2</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-271682</td><td>(1:1 000) pour IF et WB</td></tr><tr><td>Anticorps anti-cycline B1</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-245</td><td>(1:5 000)</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650-100ML</td><td>contrôle de véhicule</td></tr><tr><td>DMEM, hyperglucose, avec HEPES</td><td>Milieu</td> de culture cellulaire <td>Gibco 12430051</td><td>pour cellules EPR</td></tr><tr><td>DPBS, sans calcium, sans magnésium</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td>le PBS utilisé tout au long du protocole</td></tr><tr><td>D-Sucrose</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>bp220-1</td><td></td></tr> réactif <tr><td>Eclipse Ti2 Series Epifluorescent Microscope&nbsp ;</td><td>Nikon</td><td>na</td><td>microscope</td></tr><tr><td>EdU (5-Ethynyl-2'-deoxyuridine)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10637</td><td>nucléotide analogue</td></tr><tr><td>Falcon 24 puits plaque</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>351147</td><td>culture tissulaire</td></tr><tr><td>Falcon Boîtes de culture cellulaire 100 mm</td><td>Corning&nbsp ;</td><td>353003</td><td>culture tissulaire</td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal,</td> supplément de <td>milieu</td><td>Gibco</td><td>16140071</td> inactivé par la chaleur</tr><tr><td>Fidji (ImageJ)</td><td>NIH</td><td>version 1.54f</td><td>logiciel et algorithmes</td></tr><tr><td>FxCycle PI/RNase Staining Solution</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>F10797</td><td>PI coloration</td></tr><tr><td>IgG anti-souris de chèvre (H+L) Anticorps secondaire hautement adsorbé de manière croisée, Alexa Fluor Plus 555</td><td>Anticorps secondaire Thermo Fisher Scientific</td><td>A21422</td><td>(1:1 000)</td></tr><tr><td>IgG anti-rat de chèvre (H+L) Anticorps secondaire à adsorbe croisé élevé, Alexa Fluor Plus 488</td><td>Anticorps secondaire Thermo Fisher Scientific</td><td>A48262</td><td>(1:1 000)</td></tr><tr><td>Anticorps anti-histone H3</td><td>Abcam</td><td>ab1791</td><td>anticorps primaire (1:10 000)</td></tr><tr><td>hTERT RPE1</td><td>ATCC</td><td>CRL-3216</td><td>lignée cellulaire</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1758-100ML</td><td>réactif</td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène 30 % soultion</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009-100ML</td><td>réactif</td></tr><tr><td>Hydroxyurée, 98 % poudre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H8627-5G</td><td>réactif</td></tr><tr><td>Invitrogen Ultra Pure 0,5 M EDTA pH 8,0</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15-575-020</td><td>réactif</td></tr><tr><td>Lipfectamine RNAiMAX réactif de transfection</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>13778150</td><td>réactif de transfection</td></tr><tr><td>Solution de chlorure de magnésium 1 M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1028-100ML</td><td>réactif</td></tr><tr><td>MycoFluor</td><td>Thermo Fisher</td><td>M7006</td><td>Kit de détection de mycoplasmes</td></tr><tr><td>Néocarzinostatine de Streptomyces carzinostaticus&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N9162-100UG</td><td>réactif</td></tr><tr><td>NuPage MES SDS Running Buffer (20x)</td><td>Invitrogen&nbsp ;</td><td>NP0002</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>onTARGETplus Humain RPA2 siRNA</td><td>Dharmacon</td><td>L-017058-01-0005</td><td>siRNA</td></tr><tr><td>p27</td> anticorps <td>BD Biosciences&nbsp ;</td><td>610241</td><td>anticorps primaire (1:1 000)</td></tr><tr><td>Solution aqueuse de paraformaldéhyde (32 %)</td><td>Microscopie électronique Sciences</td><td>50-980-494</td><td>fixateur</td></tr><tr><td>d’anticorps PARP1</td><td>Technologie de signalisation cellulaire&nbsp ;</td><td>Anticorps primaire 9542S</td><td>(1:1 000)</td></tr><tr><td>Anticorps PCNA</td><td>Technologie de signalisation cellulaire&nbsp ;</td><td>13110S</td><td>anticorps primaires (1:2 000)</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Gibco</td><td>15140163</td><td>média supplément</td></tr> anticorps <tr><td>pH3</td><td>Technologie de signalisation cellulaire</td><td>Anticorps primaire 3377S</td><td>(1:2 000)</td></tr><tr><td>PhosSTOP comprimés inhibiteurs de la phosphatase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>4906837001</td><td>réactif</td></tr><tr><td>PIPES Tampon 0,5 M solution, pH 7,0</td><td>Bioworld</td><td>41620034-1</td><td>réactif</td></tr><tr><td>Precision Plus Protein Kaleidoscope Étalons de protéines pré-colorées</td><td>Bio-Rad</td><td>1610395</td><td>Western Blot</td></tr><tr><td>Prism</td><td>GraphPad</td><td>version 10</td><td>analyse statistique et graphique</td></tr><tr><td>ProLong Diamond Antifade Mountant</td><td>Thermo Scientific</td><td>P36961</td><td>Milieu de montage</td></tr><tr><td>Sérum réduit (Opti-MEM)</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td>utilisé pour la transfection</td></tr><tr><td>Anticorps Rpa32/rpa2 (souris)</td><td>Anticorps primaire EMD Millipore</td><td>NA19L</td><td>(1:1 000) pour WB</td></tr><tr><td>Anticorps Rpa32/rpa2 (rat)</td><td>Technologie de signalisation cellulaire&nbsp ;</td><td>Anticorps primaire 2208S</td><td>(1:1 000) pour solution de</td></tr><tr><td>chlorure de sodium IF (5 M)</td><td>Réactif Sigma-Aldrich</td><td>S5150</td><td></td></tr><tr><td>Pyruvate de sodium (100 mM)</td><td>Supplément de milieu</td><td>de 11360070</td> <td>Gibco</td></tr><tr><td>Tétraborate de sodium décahydraté</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B3535-500G</td><td>réactif</td></tr><tr><td>Thermo Scientific Pierce DAPI Nuclear Counterstain&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>62248</td><td>colorant d’acide nucléique</td></tr><tr><td>Thymidine, poudre</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1985-1G</td><td>réactif</td></tr><tr><td>Triton X-100 solution aqueuse (10 %)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11332481001</td><td>détergent</td></tr><tr><td>Trypsine-EDTA (0,5 %), sans rouge de phénol</td><td>Gibco</td><td>1540054</td><td>agent de dissociation cellulaire</td></tr><tr><td>Vitronectin XF</td><td>Stemcell Technologies</td><td>07180</td><td>réactif d’enrobage</td></tr><tr><td>ZE5 Analyseur de cellules</td><td>Bio-Rad</td><td>na</td><td>cytomère en flux&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

visualisation des foyers d’adn monocaténaire dans la phase g1 du cycle cellulaire

Visualizing Single-Stranded DNA Foci in the G1 Phase of the Cell Cycle

L’ADN possède des voies de réparation cellulaire dédiées capables de faire face aux lésions qui pourraient provenir de sources endogènes et/ou exogènes. La réparation de l’ADN nécessite la collaboration de nombreuses protéines, responsables de la couverture d’un large éventail de tâches allant de la reconnaissance et de la signalisation de la présence d’une lésion de l’ADN à sa réparation physique. Au cours de ce processus, des traces d’ADN simple brin (ADNss) sont souvent créées, qui sont finalement remplies par des ADN polymérases. La nature de ces traces d’ADNss (en termes de longueur et de nombre), ainsi que la polymérase recrutée pour combler ces lacunes, sont spécifiques à la voie de réparation. La visualisation de ces traces d’ADNss peut nous aider à comprendre la dynamique complexe des mécanismes de réparation de l’ADN.
Ce protocole fournit une méthode détaillée pour la préparation de cellules synchronisées G1 afin de mesurer la formation de foyers d’ADNss lors d’un stress génotoxique. À l’aide d’une approche d’immunofluorescence facile à utiliser, nous visualisons l’ADNss en colorant la RPA2, un composant du complexe de protéine de réplication hétérotrimérique A (RPA). La RPA2 se lie aux intermédiaires de l’ADNss qui surviennent lors d’un stress génotoxique ou d’une réplication et stabilise les éléments intermédiaires pour contrôler la réparation de l’ADN et l’activation des points de contrôle des dommages à l’ADN. La coloration à la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine (EdU) est utilisée pour visualiser la réplication de l’ADN afin d’exclure toute cellule de la phase S. Ce protocole offre une approche alternative aux tests conventionnels à base de 5-bromo-2'-désoxyuridine (BrdU) non dénaturants et est mieux adapté à la détection des foyers d’ADNss en dehors de la phase S.

Pour surmonter les limites de la détection de l’ADNss dans G1, nous avons utilisé RPA2, qui améliore à la fois la spécificité et l’intensité de la détection des foyers d’ADNss35. Pour obtenir une synchronisation cellulaire précise, nous avons utilisé des cellules RPE1 qui peuvent être efficacement affamées de sérum et synchronisées en phase G0. Ils peuvent ensuite être amenés à réintégrer le cycle cellulaire par l’ajout de sérum après privation de sérum. Pour confirmer l’efficacité de la synchronisation, nous avons marqué les cellules avec de l’EdU et leur contenu en ADN avec de l’iodure de propidium. Nous avons ensuite recueilli des résultats qualitatifs et quantitatifs par cytométrie en flux (figure supplémentaire S1A). Les diagrammes à points montrent qu’après 72 h de privation de sérum, ~98% des cellules sont en phase G0. Après l’ajout de milieux contenant du sérum pendant 6 h, les cellules réintègrent le cycle cellulaire (comme le montre l’augmentation des niveaux de p27 dans la figure 1A), ayant ~ 97 % de cellules en G1, alors qu’elles n’ont que &lt;1 % de cellules en phase S, &lt;2 % de cellules en phase G2 (figure supplémentaire S1A). Après 20 à 28 h d’ajout de sérum aux cellules, celles-ci passent progressivement en phase S, comme le montrent les diagrammes de cytométrie en flux (Figure supplémentaire S1A). Ce protocole de synchronisation cellulaire donne une population G1 pure à ~97 % (6 h après l’ajout de sérum après 72 h de privation de sérum). Pour valider davantage l’efficacité de la synchronisation, nous avons comparé l’expression des marqueurs du cycle cellulaire après la libération du sérum à l’aide du western blot (Figure 1A et Figure supplémentaire S1B) et, en parallèle, nous avons effectué un test d’incorporation d’EdU pour visualiser la réplication de l’ADN. La coloration EdU met également en évidence l’efficacité de la synchronisation et l’absence de réplication de l’ADN en phase G1 (Figure 1B,C).
Les méthodes conventionnelles de détection de l’ADNss dans les cellules de mammifères reposent sur la détection de BrdU dans l’ADNss. La figure 2A montre qu’après le traitement par H2O2 et la néocarzinosatine (NCS), les foyers BrdU n’étaient détectables que dans les cellules en phase S, tandis qu’aucun foyer d’ADNss n’était détectable dans les cellules en phase non S. La coloration de l’anticorps BrdU a également montré une coloration nucléolaire de fond notable qui a pu être détectée dans tous les noyaux, indépendamment de l’étape du cycle cellulaire ou des traitements appliqués. En utilisant le protocole de clic EdU décrit ici, nous n’avons pas pu détecter de foyers EdU et BrdU co-localisés, ce qui est évident dans les échantillons non traités de la figure 2A. Pour exclure complètement tout signal BrdU résultant d’une réactivité croisée, nous avons évité le marquage EdU et avons plutôt utilisé la cycline A2 comme marqueur S-G2. Cependant, la coloration de la cycline A2 n’a pas permis la pré-extraction de CSK, et dans ces conditions, nous n’avons pas vu de foyers de BrdU, même après un stress génotoxique (Figure supplémentaire S2A). Cela met en évidence le fait que la pré-extraction CSK est nécessaire pour la coloration de l’ADNss à base d’anti-BrdU. À titre de contrôle, nous avons testé la coloration des anticorps BrdU dans des conditions de dénaturation. Cela ouvre l’ADN pour exposer le BrdU incorporé, ce qui révèle que le BrdU a été uniformément incorporé (Figure supplémentaire S2B).
En revanche, la coloration RPA2 montre la formation de foyers dépendants de NCS et H2O2 non seulement dans la phase S mais aussi dans d’autres phases du cycle cellulaire (Figure 2B). En tant que témoin, nous avons également traité les cellules avec de l’HU, qui ne provoque que l’accumulation d’ADNss dans les cellules en cours de réplication. Comme prévu, nous n’avons détecté qu’une augmentation du signal lors du traitement par HU avec l’anticorps RPA2 dans les cellules EdU-positives, ce qui souligne la spécificité de cette approche. L’anticorps RPA2 peut également détecter la formation naturelle d’ADNss pendant la réplication en l’absence de stress génotoxique exogène (Figure 2B). La nature très sensible de l’anticorps RPA2 nous a incités à essayer de l’utiliser dans la phase G1 où la coloration BrdU conventionnelle n’a pas permis de détecter de signal lors d’un stress génotoxique (Figure supplémentaire S2C). La figure 3A montre que la formation de foyers d’ADNss lors du traitement par H2O2 était détectable lors de l’utilisation d’un anticorps anti-RPA2, même en G1. Il y a eu une augmentation significative du nombre de foyers de RPA2 dans ces noyaux lors du traitement par H2O2 (Figure 3B). Ces foyers étaient spécifiques à la RPA2 car le silence de la RPA2 abolissait le signal IF (Figure 3A,B). La figure 3C et la figure supplémentaire S1C montrent l’efficacité de l’inactivation de la RPA2 dans ces cellules. Par rapport aux méthodes conventionnelles, la détection de l’ADNss basée sur la RPA2 est très sensible, et son application peut donc être étendue aux cellules de la phase G1.
<img alt="Analyse du cycle cellulaire montrant l’expression des protéines (Cycline A2, PCNA, etc.), la microscopie et la cytométrie en flux." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65926/65926fig01.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : Efficacité de synchronisation des cellules RPE1 après privation de sérum. (A) Les immunoblots montrent les niveaux de protéines indiqués dans les cellules RPE1 synchronisées en phase asynchrone, G1 et S. (B) Des images représentatives montrent des cellules RPE1 asynchrones, G1 et synchronisées en phase S qui ont été exposées à 10 μM EdU pendant 30 min avant la fixation et visualisées par la réaction Click-IT. Le DAPI a été utilisé pour contre-colorer l’ADN nucléaire. Barres d’échelle = 50 μm. (C) Le graphique montre le pourcentage de cellules EdU positives par rapport à la population cellulaire totale évaluée par DAPI. La barre d’erreur représente l’erreur type de la moyenne, et le nombre de noyaux analysés était le suivant : AS n = 219, G1 n = 630, S n = 437. Abréviations : RPE1 = cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes immortalisées par hTERT ; AS = asynchrone ; EdU = 5-éthynyl-2'-désoxyuridine ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65926/65926fig01large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="DAPI, EdU, microscopie à fluorescence de l’ADNss (BrdU, RPA2), phase S/non-S, synthèse de l’ADN cellulaire." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65926/65926fig02.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 : Détection de l’ADNss avec l’anticorps BrdU ou l’anticorps RPA2 lors d’une lésion de l’ADN. (A) Des images représentatives illustrent les foyers d’ADNss utilisant αBrdU (vert), les cellules de la phase S sont mises en évidence par EdU (violet) et le DAPI a été utilisé pour contre-colorer l’ADN nucléaire (bleu). Les cellules RPE1 ont été conservées dans 10 μM BrdU pendant 48 h avant tout traitement supplémentaire. Après 48 h, les cellules ont été pulsées avec 10 μM EdU pendant 30 min, suivies d’un traitement par H2O2 (250 μM) pendant 1 h ou par néocarzinosatine (0,5 μg/mL) pendant 4 h. Les cellules ont été fixées après la pré-extraction de CSK. Une ligne pointillée blanche indique la bordure de chaque noyau. Barre d’échelle = 5 μm. Les panneaux de droite sont des images agrandies des noyaux de phase S ou non S indiqués. (B) Des images représentatives illustrent les foyers d’ADNss utilisant l’anticorps αRPA2 (vert). Les cellules de la phase S sont mises en évidence par EdU (violet), et le DAPI a été utilisé pour contre-colorer l’ADN nucléaire (bleu). Les cellules RPE1 ont été pulsées avec 10 μM d’EdU pendant 30 min, suivies de 1 hH 2O2 (250 μM), 4 h d’hydroxyurée (2 mM) ou 4 h de NCS (0,5 μg/mL). Les cellules ont été fixées après la pré-extraction de CSK. Une ligne pointillée blanche indique la bordure de chaque noyau. Barre d’échelle = 10 μm. Les panneaux de droite sont des images agrandies des noyaux de phase S ou non S indiqués. Abréviations : ssDNA = ADN simple brin ; BrdU = 5-bromo-2'-désoxyuridine ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole ; RPE1 = cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes immortalisées par hTERT ; EdU = 5-éthynyl-2'-désoxyuridine ; NCS = Néocarzinostatine ; HU = hydroxyurée. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65926/65926fig02large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Schéma de dosage de l’imagerie cellulaire ; coloration ADNss, DAPI, EdU ; l’analyse des foyers RPA2 ; détection de transfert de protéines." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65926/65926fig03.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 : Détection de foyers d’ADNss en phase G1 à l’aide d’un anticorps RPA2. (A) Les cellules RPE1 ont été transfectées avec des siRNA ciblant RPA2 ou un siRNA témoin non ciblant, puis synchronisées dans G1 et marquées par impulsions avec 10 μM EdU pendant 30 min avant de les traiter avec H2O2 (250 μM) pendant 1 h là où cela était indiqué. Le DAPI a été utilisé pour contre-colorer l’ADN nucléaire. Les cellules ont été fixées après la pré-extraction de CSK. Une ligne pointillée blanche indique la bordure de chaque noyau. Barre d’échelle = 5 μm. (B) Les mesures du nombre de foyers/noyaux de RPA2 ont été effectuées à partir de deux expériences indépendantes. Seules les cellules EdU négatives ont été prises en compte lors de l’analyse. Les lignes représentent la valeur moyenne sur les tracés. Un test ANOVA non paramétrique (Kruskal-Wallis) a été réalisé pour l’analyse statistique. Les étoiles indiquent P &lt; 0,0001. Le nombre de noyaux analysés était le suivant : siNT no H2O2 n = 513, siNT H2O2 n = 603, siRPA2 no H2O2 n = 266, siRPA2 H2O2 n = 536. (C) L’efficacité de l’inhibition de l’ARNi est démontrée dans l’immunotransfert. Abréviations : siNT = contrôle de l’ARNi non ciblant ; BrdU = 5-bromo-2'-désoxyuridine ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole ; RPE1 = cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes immortalisées par hTERT ; EdU = 5-éthynyl-2'-désoxyuridine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65926/65926fig03large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Processus d’analyse d’images de noyaux cellulaires ; Microscopie, segmentation d’images, paramétrage, affichage des résultats." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/65926/65926fig04.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 4"> Figure 4 : Quantification des foyers d’ADNss à l’aide des îles Fidji. Étapes détaillées aux Fidji montrant comment évaluer le nombre de foyers RPA2 dans le noyau. (A-E) La création d’un masque nucléaire à l’aide du canal DAPI. (F-H) Seuillage pour identifier les foyers individuels d’ADNss nucléaire à partir du signal de fond. Abréviations : ssDNA = ADN simple brin ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65926/65926fig04large.jpg" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">Tampon cytosquelettique (CSK)</td>
		</tr><tr><td>TUYAUX pH 7,0</td>
			<td>10 mM</td>
		</tr><tr><td>NaCl</td>
			<td>100 mM</td>
		</tr><tr><td>EDTA pH 8</td>
			<td>1 mM</td>
		</tr><tr><td>MgCl2 </td>
			<td>3 mM</td>
		</tr><tr><td>D-saccharose</td>
			<td>300 mètres d’épaisseur</td>
		</tr><tr><td>Triton X-100</td>
			<td>0.20%</td>
		</tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de phosphatase</td>
			<td>1 comprimé par 10 mL</td>
		</tr><tr><td>Cocktail d’inhibiteurs de protéase</td>
			<td>1 comprimé par 10 mL</td>
		</tr><tr><td>dilué dans du ddH2O</td>
			<td>n/a</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Tampon de lavage</td>
		</tr><tr><td>Triton X-100</td>
			<td>0.05%</td>
		</tr><tr><td>dilué dans du PBS</td>
			<td>n/a</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Tampon de perméabilisation</td>
		</tr><tr><td>Triton X-100</td>
			<td>0.50%</td>
		</tr><tr><td>dilué dans du PBS</td>
			<td>n/a</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Solution de fixation</td>
		</tr><tr><td>Paraformaldéhyde</td>
			<td>3.60%</td>
		</tr><tr><td>Triton X-100</td>
			<td>0.05%</td>
		</tr><tr><td>dilué dans du PBS</td>
			<td>n/a</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Tampon de blocage</td>
		</tr><tr><td>Albumine sérique bovine (BSA)</td>
			<td>5%</td>
		</tr><tr><td>Triton X-100</td>
			<td>0.10%</td>
		</tr><tr><td>dilué dans du PBS</td>
			<td>n/a</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Cocktail de réaction Click-iT Plus</td>
		</tr><tr><td>1x tampon de réaction Click-iT</td>
			<td>435 mL</td>
		</tr><tr><td>Solution PCA Alexa Fluor</td>
			<td>5 ml</td>
		</tr><tr><td>Prémélange protecteur CuSO4-cuivre</td>
			<td>10 ml</td>
		</tr><tr><td>1x additif tampon Click-iT</td>
			<td>50 ml</td>
		</tr><tr><td>Volume total</td>
			<td>500 ml</td>
		</tr></tbody></table>Tableau 1 : Composition des tampons utilisés dans ce protocole. 
Figure supplémentaire S1. (A) Les cellules RPE1 ont été synchronisées à la phase G0 en utilisant la privation de sérum pendant 72 h, puis libérées dans différentes phases du cycle cellulaire en réintroduisant le sérum. Les diagrammes à points montrent les cellules en phases G0/G1, S ou G2/M, où les heures indiquent le temps qui suit la ré-addition de sérum après la famine sérique. Le graphique de droite montre le pourcentage de cellules G0/G1, S et G2/M dans chaque condition. L’analyse FACS a été réalisée à l’aide d’un kit de prolifération cellulaire disponible dans le commerce utilisant de l’EdU et de l’iodure de propidium selon les recommandations du fabricant. (B) Balayage par transfert Western non recadré pour la figure 1. Les chiffres montrent les marqueurs de poids moléculaire en kDa. PARP1 a été utilisé comme contrôle de charge et chargé sur le gel qui a également été développé contre CCNA2, p27 (encore dénudé pour le PCNA) et pH3 (S10) (encore dépouillé pour H3) en coupant la membrane. Le CCNB1 et le RPA2 ont été chargés sur un gel séparé, en utilisant la même quantité de lysat de protéines pour assurer la comparabilité. (C) Balayage par transfert Western non recadré pour la figure 3. Les chiffres montrent les marqueurs de poids moléculaire en kDa. Abréviation : EdU = 5-éthynyl-2'-désoxyuridine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65926/Supplementary%20Figure%201.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Figure supplémentaire S2 : (A) Des images représentatives illustrent les foyers d’ADNss à l’aide de l’anticorps BrdU (vert) ; Les cellules de la phase S sont mises en évidence par la cycline A2 (rouge) ; et le DAPI a été utilisé pour contrer la coloration de l’ADN nucléaire (bleu). Les cellules RPE1 ont été conservées dans 10 μM BrdU pendant 48 h avant un traitement ultérieur. Après 48 h, les cellules ont été traitées avec H2O2 (250 μM) pendant 1 h ou avec de la néocarzinosatine (0,5 μg/mL) pendant 4 h avant fixation. Une ligne pointillée blanche indique la bordure de chaque noyau. Barre d’échelle = 5 μm. (B) Coloration BrdU des cellules RPE1 avec et sans condition de dénaturation. Les cellules RPE1 asynchrones ont été prétraitées avec 10 μM BrdU pendant 48 h. Barre d’échelle = 10 μm. (C) Les mesures du nombre de foyers/noyaux BrdU ont été effectuées à partir de deux expériences indépendantes dans des cellules RPE1 synchronisées G1. Seules les cellules EdU négatives ont été prises en compte lors de l’analyse. Les lignes représentent la valeur moyenne sur les tracés. Un test ANOVA non paramétrique (Kruskal-Wallis) a été réalisé pour l’analyse statistique. Le « ns » indique une différence non significative. Le nombre de noyaux analysés était le suivant : NT n = 52, NCS n = 105, H2O2 n = 82. Abréviations : siNT = contrôle de l’ARNi non ciblant ; BrdU = 5-bromo-2'-désoxyuridine ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole ; RPE1 = cellules épithéliales pigmentaires rétiniennes immortalisées par hTERT ; NCS = Néocarzinostatine. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65926/Supplementary%20Figure%202_revised2.pdf" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>
Vidéo supplémentaire S1 : Enregistrement d’écran de l’analyse des foyers RPA2 basée aux Fidji. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/65926/Supplementary%20Video%201.zip" target="_blank">Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.</a>

Le protocole suivant présente la détection de foyers d’ADN simple brin dans la phase G1 du cycle cellulaire en utilisant la synchronisation du cycle cellulaire suivie d’une coloration immunofluorescente RPA2.

Visualisation des foyers d’ADN monocaténaire dans la phase G1 du cycle cellulaire

DNA has dedicated cellular repair pathways capable of coping with lesions that could arise from both endogenous and/or exogenous sources. DNA repair ...

La réponse aux dommages de l’ADN est indispensable à la vie. Comme l’ADN est constamment exposé à divers moteurs nocifs, l’absence de leur réparation entraîne une instabilité des génomes et des maladies. Nous avons développé une méthode basée sur les propriétés biologiques de la RPA2, pour visualiser le tractus d’ADN simple brin au cours de la réparation de l’ADN à différents stades du cycle cellulaire.La méthode traditionnelle de détection de l’ADN simple brin utilise des anticorps BrdU. Cette approche peut être utilisée pour répliquer activement les cellules. De plus, cet anticorps a tendance à réagir de manière croisée avec d’autres analogues nucléotidiques, ce qui limite leur utilisation.Contrairement à BRDU, notre approche a un rapport signal sur bruit plus élevé, ce qui la rend utilisable à chaque phase du cycle. Il est crucial de comprendre l’action des différentes voies de réparation de l’ADN dans les différentes phases du cycle cellulaire et les cellules potentiellement non réplicatives. Notre protocole fournit une nouvelle approche et un nouvel outil pour visualiser les foyers d’ADN simple brin, là où les approches classiques utilisant BrdU sont limitées.Une compréhension complète des processus de réparation de l’ADN pourrait servir de cibles thérapeutiques pour traiter le cancer, le vieillissement et les maladies neurologiques. La plupart de nos cellules sont différenciées en phase terminale et ne se répliquent donc pas et ne se divisent pas. Il est crucial de mieux comprendre comment ces cellules réparent diverses lésions de l’ADN.Par conséquent, notre laboratoire se concentrera principalement sur les processus de réparation de l’ADN post-réplicatif et développera de nouveaux outils pour les étudier.

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Ce protocole décrit une méthode pour visualiser un ADN de protéine cassures double-brin de signalisation activées en réponse aux dommages de l'ADN ainsi que sa localisation au cours de la mitose.

Deux et trois dimensions imagerie de cellules vivantes de protéines endommagent l&#39;ADN de réponse

L’imagerie spectroscopique électronique permet d’imager et de distinguer l’acide nucléique de la protéine à une résolution nanométrique. Il peut être combiné avec le système miniSOG, qui est capable de marquer spécifiquement les protéines marquées dans des échantillons de microscopie électronique à transmission. Nous illustrons l’utilisation de ces technologies en utilisant des foyers de réparation de cassures double brin à titre d’exemple.

Visualisation des miniSOG protéines marquées de réparation d&#39;ADN en combinaison avec Electron imagerie spectroscopique (ESI)

Laser microirradiation est un outil utile pour l’étude de la réparation de l’ADN dans les cellules vivantes. Une approche méthodologique pour l’utilisation des lasers UVA pour induire diverses lésions de l’ADN est montrée. Nous avons optimisé une méthode pour microirradiation locale qui gère le cycle cellulaire normal ; ainsi, les cellules irradiées passent par mitose.

Avancée des Techniques de microscopie confocale afin d’étudier les interactions entre protéines et cinétique aux lésions de l’ADN

Nous présentons un protocole pour la synchronisation de la thymidine double de cellules HeLa suivie d’analyse à l’aide de la microscopie confocale haute résolution. Cette méthode est essentielle pour obtenir le grand nombre de cellules qui procèdent de façon synchrone de la phase S de mitose, permettant des études sur les rôles mitotiques de protéines multifonctionnelles qui possèdent également des fonctions de l’interphase.

Combinant la synchronisation cellulaire mitotique et microscopie confocale haute résolution pour étudier le rôle des protéines multifonctionnelles Cycle cellulaire au cours de la mitose

Réparation des cassures double brin de l’ADN est un processus dynamique, qui exige non seulement la formation de complexes de réparation sur les sauts, mais également leur résolution après que la lésion est adressée. Ici, nous utilisons la microscopie d’immunofluorescence pour les pauses bicaténaire transitoires et de longue durée comme outil de disséquer ce mécanisme de maintenance du génome.

Caractériser les processus de réparation de l’ADN à des cassures de l’ADN bicaténaires durables et transitoires de la microscopie par Immunofluorescence

Ici nous présentons un protocole pour évaluer la dynamique de la formation de fuseau et de la progression mitotique. Notre application de l'imagerie en time-lapse permet à l'utilisateur d'identifier les cellules à divers stades de la mitose, de suivre et d'identifier les défauts mitotiques, et d'analyser la dynamique du fuseau et le destin des cellules mitotiques lors de l'exposition à des médicaments anti-mitotiques.

Imagerie cellulaire en direct pour évaluer la dynamique du moment de la métaphase et le destin cellulaire à la suite de perturbations mitotiques spindle

Suite à des dommages à l’ADN, les cellules humaines activent des voies de réparation essentielles pour restaurer l’intégrité de leur génome. Ici, nous décrivons la méthode de l’immunofluorescence indirecte comme un moyen de détecter les protéines de réparation de l’ADN, d’analyser leur recrutement spatial et temporel, et d’aider à interroger l’interaction protéine-protéine sur les sites de dommages à l’ADN.

Visualisation de l’ADN Réparation des protéines Interaction par immunofluorescence

Dans le présent protocole, nous montrons comment visualiser la résection de l’extrémité double brin de l’ADN pendant la phase S/G2 du cycle cellulaire à l’aide d’une méthode basée sur l’immunofluorescence.

Évaluation de la résection finale globale de l’ADN double brin à l’aide du marquage BrdU-ADN couplé à l’imagerie de discrimination du cycle cellulaire

Nous décrivons deux protocoles complémentaires pour déterminer avec précision la durée de la phase S chez S. cerevisiae à l’aide d’EdU, un analogue de la thymidine, qui est incorporé in vivo et détecté à l’aide de la chimie Click par microscopie et cytométrie en flux. Il permet de caractériser facilement la durée de la réplication de l’ADN et les défauts de réplication négligés chez les mutants.

Détermination de la durée de la phase S à l’aide de l’incorporation de la 5-éthynyl-2'-désoxyuridine chez Saccharomyces cerevisiae

Ce protocole démontre la réalisation d’un test sur une seule molécule pour la visualisation en direct du déroulement de l’ADN par l’hélicase CMG. Il décrit (1) la préparation d’un substrat d’ADN, (2) la purification de l’hélicase CMG de Drosophila melanogaster marquée par fluorescence, (3) la préparation d’une cellule d’écoulement microfluidique pour la microscopie à fluorescence par réflexion interne totale (TIRF) et (4) le test de déroulement de l’ADN à molécule unique.

Visualisation en temps réel d’une molécule unique du déroulement de l’ADN par CMG Helicase

Ce protocole détaille deux méthodes d’arrêt du cycle cellulaire de levure et de libération facultative, et développe l’utilisation de la microscopie à fluorescence pour étudier les processus dépendants du cycle cellulaire chez S. cerevisiae.

Manipulation et analyse des processus dépendants du cycle cellulaire chez les levures bourgeonnantes

Découvrez la visualisation des foyers d'ADN monocaténaire dans la phase G1 du cycle cellulaire en utilisant le marquage immunofluorescent de RPA2 sur des cellules RPE1. Cette méthode offre un meilleur rapport signal/bruit que l'approche BrdU traditionnelle.

Visualisation des foyers d’ADN monocaténaire dans la phase G1 du cycle cellulaire

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