Protocole optimisé pour l'extraction de protéines à partir de la soupape mitrale humaine

L'objectif général de cette procédure est d'extraire efficacement des protéines à partir de la valve mitrale cardiaque humaine, adaptées à une analyse protéomique. Cette méthode pourrait potentiellement aider à découvrir les mécanismes pathogènes dans le domaine des maladies des valves cardiaques, permettant l'identification de nouveaux marqueurs diagnostiques et pronostiques de la maladie et, espérons-le, de cibles thérapeutiques. Le principal avantage de ce protocole est qu'il fournit un flux de travail d'extraction efficace, compatible avec de nombreuses applications analytiques.

Les résultats permettent une caractérisation plus exhaustive du protéome de la valve mitrale cardiaque. De plus, ce protocole peut également être appliqué à d'autres systèmes, comme la valve mitrale porcine, qui présente une forte ressemblance avec la valve humaine et est utilisée comme modèle expérimental pour l'évaluation de la fonction valvulaire. La procédure expérimentale sera démontrée par Stefania Ghilardi, technicienne de mon laboratoire.

pour préparer la valve mitrale humaine, commencez par un cœur explanté ayant subi une ischémie froide pendant quatre à douze heures. Dans une salle propre, retirez le cœur du sac de transport et placez-le dans un seau stérilisé. Ensuite, transférez le cœur dans une cabine de sécurité biologique.

Là, à l’aide d’un scalpel jetable, effectuez une incision perpendiculairement à l’axe majeur au niveau des ventricules gauche et droit, à environ quatre centimètres de l’apex. Ensuite, placez le cœur sur un champ stérile. Puis, déplacez l’aorte ascendante et l’artère pulmonaire afin d’accéder au toit de l’oreillette gauche.

Sur le toit de l'oreillette gauche, utilisez une pince et des curettes pour découper autour de l'auricule gauche afin d'exposer la valve mitrale. La valve mitrale est entièrement contenue dans le ventricule gauche. Ainsi, exposez la grande valvule mitrale et la petite valvule mitrale.

Les commissures antérolatérale et postéromédiale délimitent la frontière des régions antérieure et postérieure. À présent, à l’aide de ciseaux et de pinces non traumatiques, disséquez l’oreillette gauche et l’épaisseur de la paroi ventriculaire entourant la valve mitrale. Pendant cette dissection, identifiez la continuité entre la valve mitrale et la valve aortique.

Ensuite, séparez le feuillet antérieur de la valve mitrale du feuillet postérieur de la valve mitrale en coupant le long des commissures qui bordent le feuillet postérieur. Une fois la procédure terminée, désinfectez la table de l'armoire avec une solution d'alcool isopropylique à 70 % et une solution de peroxyde d'hydrogène à 6 %. Lavez maintenant le feuillet postérieur de la valve mitrale dans du sérum physiologique.

Ensuite, découpez la valve en petits morceaux, chacun mesurant moins d'un centimètre carré. Emballez les morceaux individuellement dans du papier d'aluminium et congélez-les rapidement à l'aide d'azote liquide. Pour commencer l'extraction des protéines, utilisez une pince pour retirer un échantillon de l'azote liquide et placez-le immédiatement sur de la glace sèche.

Ne laissez pas l'échantillon dégeler. Ensuite, placez le mortier, les pilons associés et l'échantillon dans un ballon de Dewar rempli d'azote liquide. Il est essentiel que l'azote liquide soit utilisé pour congeler l'échantillon et refroidir le système de broyage.

Cette étape empêche la dégradation biologique et permet un broyage efficace, mais nécessite une formation technique pour une manipulation sécuritaire. Une fois congelé rapidement, placez le mortier et le pilon dans une boîte en polystyrène contenant de la glace sèche. Placez également une spatule sur la glice sèche.

Ensuite, retirez l'échantillon de la feuille d'aluminium et placez-le dans le mortier. Positionnez ensuite le pilon plus grand au-dessus. À l'aide d'un tournevis, faites tourner le pilon et broyez l'échantillon de 15 à 20 fois.

Pendant le broyage, mélangez l'échantillon à l'aide de l'extrémité d'une spatule refroidie. Après avoir utilisé le gros pilon, répétez le processus de broyage avec un pilon plus petit. L'obtention d'une poudre fine est essentielle pour une extraction efficace des protéines.

Versez maintenant l'échantillon en poudre dans un tube de centrifugation de 15 millilitres de masse connue. Ensuite, brossez tout matériau restant dans le mortier à l'aide d'une spatule froide. Conservez le tube contenant l'échantillon sur de la glace sèche et déterminez rapidement la masse de l'échantillon.

Ensuite, versez l'échantillon dans un tube d'homogénéisateur en verre. Puis, ajoutez 200 microlitres de tampon urée pour chaque 10 milligrammes d'échantillon. Pour ce faire, récupérez les résidus restants dans le tube en rinçant avec l'aliquot de tampon urée.

Homogénéisez maintenant l'échantillon à l'aide d'un pilon motorisé en PFTE fonctionnant à 1 500 tr/min. Appuyez lentement le pilon sur l'échantillon avec un mouvement de torsion 10 fois. Ensuite, transférez le surnageant jaune visqueux dans un tube de centrifugation propre de 1,7 millilitre à l'aide d'une pipette en verre.

Répétez maintenant l'homogénéisation sur l'échantillon restant en utilisant la moitié de l'urée. Récupérez le surnageant et combinez-le avec la récolte précédente. Ensuite, placez le tube sur un rotateur de tube pendant 30 minutes.

Après 30 minutes, introduire le tube dans une centrifugeuse froide et centrifuger l'échantillon à 13 000 G pendant une demi-heure. Ensuite, récupérer le surnageant et mesurer la concentration en protéines à l'aide du dosage des protéines de Bradford.

Après avoir effectué le protocole prescrit, l'extrait protéique a été étudié à l'aide de diverses méthodes, suite à quelques traitements supplémentaires. Un total de 422 protéines a été identifié dans le tissu de la valve mitrale par électrophorèse bidimensionnelle, focalisation isoélectrique en phase liquide, chromatographie liquide-spectrométrie de masse et chromatographie liquide bidimensionnelle-spectrométrie de masse. Les 422 protéines ont été classées à l'aide d'une analyse par l'ontologie génique.

Les régions extracellulaires contenaient plusieurs protéines attendues ainsi que d'autres protéines intracellulaires et membranaires. Plusieurs d'entre elles ont été identifiées pour la première fois dans les valves mitrales. La présence de quatre de ces protéines, auparavant non identifiées dans les valves mitrales, a été confirmée à l'aide d'anticorps dans trois échantillons distincts.

Les protéines sont la Septine-11, la protéine à quatre domaines LIM et demi un, la Dermoaponétine et la cristalline alpha B. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière d'extraire des protéines de la valve mitrale cardiaque afin de les identifier et de les quantifier. Une fois maîtrisé, ce protocole peut être réalisé en près de deux heures s'il est correctement effectué. Lors de la réalisation de cette procédure, il est essentiel que les échantillons ne dégèlent pas pendant les transferts afin d'obtenir un rendement maximal en protéines tout en préservant leur intégrité.