Protocole optimisé pour l'extraction de protéines à partir de la soupape mitrale humaine

L’objectif global de cette procédure est d’extraire efficacement des protéines de la valve mitrale cardiaque humaine, adaptées à l’analyse protéomique. Cette méthode peut potentiellement aider à découvrir des mécanismes pathogènes dans le domaine des valvulopathies cardiaques, permettant d’identifier de nouveaux marqueurs diagnostiques et pronostiques de la maladie et, espérons-le, des cibles thérapeutiques. Le principal avantage de ce protocole est qu’il fournit un flux d’extraction efficace compatible avec de nombreuses applications analytiques.

Les résultats étant une caractérisation plus exhaustive du proteum de la valve mitrale cardiaque. De plus, ce protocole peut également être appliqué à d’autres systèmes, tels que la valve mitrale porcine, qui ressemble beaucoup à la valve humaine et est utilisée dans le modèle expérimental pour l’évaluation de la fonction valvulaire. Stefania Ghilardi, une technicienne de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure expérimentale.

Pour préparer la valve mitrale humaine, commencez par un cœur explanté qui a été sous ischémie froide pendant quatre à 12 heures. Dans une salle blanche, retirez le cœur du sac de transport et mettez-le dans un seau stérilisé. Ensuite, transférez le cœur dans une enceinte de biosécurité.

Là, à l’aide d’un scalpel jetable, coupez perpendiculairement au grand axe au niveau des ventricules gauche et droit, à environ quatre centimètres de l’apex. Placez ensuite le cœur sur un champ stérile. Ensuite, écartez l’aorte ascendante et l’artère pulmonaire pour accéder au toit auriculaire gauche.

Sur le toit auriculaire gauche, utilisez des pinces et des pics pour couper autour du pavillon gauche afin d’exposer la valve mitrale. La valve mitrale est entièrement contenue dans le ventricule gauche. Ainsi, exposez le grand feuillet mitral et le petit feuillet mitral.

Les commissures antérolatérale et postéromédiale définissent la bordure de la zone antérieure et postérieure. Maintenant, avec des ciseaux et des pinces non traumatiques, disséquez l’oreillette gauche et l’épaisseur de la paroi ventrale qui entoure la valve mitrale. Au cours de cette dissection, identifiez la continuité de la valve aortique mitrale.

Ensuite, séparez le feuillet de la valve mitrale antérieure du feuillet de la valve mitrale postérieure en coupant le long des commissures qui bordent le feuillet postérieur. Une fois la procédure terminée, désinfectez la table de l’armoire avec une solution d’alcool isopropylique à 70 % et une solution de peroxyde d’hydrogène à 6 %. Maintenant, lavez le feuillet postérieur de la valve mitrale dans une solution saline.

Ensuite, coupez la valve en petits morceaux, chacun de moins d’un centimètre carré. Enveloppez les morceaux individuellement dans du papier d’aluminium et congelez-les avec de l’azote liquide. Pour commencer l’extraction des protéines, utilisez une pince pour prélever un échantillon de l’azote liquide et placez-le immédiatement sur de la glace sèche.

Ne laissez pas l’échantillon décongeler. Ensuite, dans une fiole de Dewar remplie d’azote liquide, placez le mortier, les pilons associés et l’échantillon. Il est essentiel que l’azote liquide soit utilisé pour congeler l’échantillon et refroidir le système de broyage.

Cette étape empêche la dégradation biologique et permet un poudrage efficace, mais nécessite une formation technique pour une manipulation en toute sécurité. Une fois surgelés, mettez le mortier et les pilons dans une boîte en polystyrène contenant de la glace sèche. Placez également une spatule sur la glace sèche.

Ensuite, retirez l’échantillon de la feuille et chargez-le dans le mortier. Et placez le plus grand pilon au-dessus. À l’aide d’un tournevis pour faire pivoter le pilon, broyez l’échantillon 15 à 20 fois.

Pendant le broyage, mélangez l’échantillon avec la pointe d’une spatule réfrigérée. Après avoir utilisé le grand pilon, répétez le processus de broyage avec un pilon plus petit. L’obtention d’une poudre fine est essentielle à l’efficacité de l’extraction des protéines.

Maintenant, versez l’échantillon en poudre dans un tube à centrifuger de 15 millilitres de masse connue. Ensuite, brossez le matériau restant dans le mortier à l’aide d’une spatule froide. Conservez le tube avec l’échantillon sur de la glace carbonique et déterminez rapidement la masse de l’échantillon.

Ensuite, versez l’échantillon dans un tube d’homogénéisation en verre. Ensuite, ajoutez 200 microlitres de tampon d’urée pour 10 milligrammes d’échantillon. Ce faisant, récupérez les résidus laissés dans le tube en les rinçant avec l’aliquote du tampon urée.

Homogénéisez maintenant l’échantillon à l’aide d’un pilon PFTE motorisé fonctionnant à 1 500 tr/min. Appuyez lentement le pilon sur l’échantillon avec un mouvement de torsion 10 fois. Ensuite, transférez le surnageant jaune visqueux dans un tube à centrifuger propre de 1,7 millilitre à l’aide d’une pipette en verre.

Répétez maintenant l’homogénéisation sur l’échantillon restant en utilisant la moitié de l’urée. Récupérez le surnageant et combinez-le avec la collection précédente. Ensuite, placez le tube sur un rotateur de tube pendant 30 minutes.

Après 30 minutes, chargez le tube dans une centrifugeuse froide et faites tourner l’échantillon à 13 000 G pendant une demi-heure. Ensuite, récupérez le surnageant. Et mesurez la concentration en protéines à l’aide du test de protéines Bradford.

Après avoir effectué le protocole prescrit, l’extrait de protéine a été étudié à l’aide de diverses méthodes après quelques traitements supplémentaires. Au total, 422 protéines ont été identifiées dans le tissu de la valve mitrale par électrophorèse bidimensionnelle, focalisation isoélectrique en phase liquide, chromatographie en phase liquide couplée spectrométrie de masse et chromatographie liquide 2D-spectrométrie de masse. Les 422 protéines ont été classées à l’aide d’une analyse Gene Ontology.

Les régions extracellulaires contenaient plusieurs protéines attendues et d’autres protéines intracellulaires et de surface cellulaire. Beaucoup d’entre eux ont été identifiés pour la première fois dans les valves mitrales. La présence de quatre protéines de ce type, qui n’avaient pas été identifiées auparavant dans les valves mitrales, a été confirmée par des anticorps dans trois échantillons uniques.

Les protéines sont la septine-11, la protéine un des quatre domaines LIM et demi, la dermatoponine et l’alpha-cristallin B.Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’extraire les protéines de la valve mitrale cardiaque pour leur identification et leur quantification. Une fois maîtrisé, ce protocole peut être réalisé en près de deux heures s’il est correctement exécuté. Lors de la tentative de cette procédure, pour obtenir le plus grand rendement de protéines à haute intégrité protéique, il est essentiel que les échantillons ne dégèlent pas pendant le transfert.