Production de souris génétiquement modifiées par micro-injection d'ovocytes

L’objectif général de ce protocole est de décrire les procédures requises pour la génération réussie de souris génétiquement modifiées par micro-injection d’ovocytes. Ce protocole peut aider les chercheurs et le personnel technique impliqués soit dans le domaine de la genèse de la souris, mais aussi dans le ciblage des gènes. Le principal avantage de cette technique est qu’elle repose sur l’injection directe d’ovocytes de souris, à la fois pour l’intégration aléatoire, mais aussi pour le ciblage génétique, permettant la génération de souris génétiquement modifiées en aussi peu que six semaines.

Pour préparer un seul ARN guide, après avoir sélectionné les deux séquences cibles souhaitées et fabriqué des amorces selon le protocole de texte, synthétisez un modèle d’ADN linéaire en diluant le plasmide PX330 à 10 nanogrammes par microlitre dans de l’eau sans nucléases. Préparez un mélange maître, en ajoutant la polymérase à la fin, et conservez sur de la glace. Ensuite, mélangez et divisez la solution en huit tubes PCR.

Ajoutez un microlitre de PXR330 par tube et exécutez le programme suivant. Ensuite, utilisez un kit de purification PCR, un collecteur et une source de vide pour purifier le produit PCR. Ajoutez cinq volumes de tampon de liaison à un volume de l’échantillon PCR et mélangez.

Placez la colonne de spin à membrane de silicium sur le collecteur. Pour lier l’ADN, appliquez les huit échantillons sur la colonne, dans le vide. Pour laver l’échantillon, ajoutez 0,75 millilitre de tampon de lavage dans la colonne et passez l’aspirateur.

Ensuite, centrifugez la colonne à 12 000 fois G pendant 60 secondes pour éliminer l’éthanol résiduel. Placez la colonne dans un micro-tube à centrifuger propre de 1,5 millilitre, puis, pour éluer l’ADN, ajoutez 30 microlitres d’eau sans nucléases au centre de la membrane. Laissez la colonne reposer pendant une minute et centrifugez-la, 12 000 fois G pendant 60 secondes.

Utilisez ensuite un spectrophotomètre pour mesurer la concentration d’ADN. Pour effectuer une transcription in vitro à l’aide d’un kit de synthèse d’ARN t7, préparez le master mix et incubez la réaction dans un thermocycleur à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Ajoutez 28 microlitres d’eau sans nucléases et deux microlitres de DNAse un, et incubez la réaction pendant encore 15 minutes.

Pour purifier l’ARN, dissolvez la poudre contenue dans la colonne de spin fournie et 650 microlitres de tampon de micro-injection sans nucléases. En éliminant soigneusement toutes les bulles d’air, fermez le tube et hydratez la solution à température ambiante pendant cinq à 15 minutes. Retirez le capuchon bleu en bas et placez la colonne dans un tube de deux millilitres.

Ensuite, centrifugez le tube à 750 fois G à température ambiante pendant deux minutes. Placez ensuite la colonne dans un tube frais de 1,5 millilitre et appliquez 50 microlitres de la solution d’ARN goutte à goutte vers le centre, sans toucher la paroi de la colonne. Ensuite, faites tourner la colonne à 750 fois G pendant deux minutes.

Mesurez la concentration d’ARN et évaluez la qualité de l’ARN selon le protocole de texte. À l’aide d’un tampon de micro-injection sans nucléases, diluez l’ARNm du boîtier neuf à 50 nanogrammes par microlitre et les ARNsg à 12,5 nanogrammes par microlitre pour des expériences d’inactivation de gènes. Ajoutez le modèle donneur à une concentration de 200 nanogrammes par microlitre, pour l’édition du génome basée sur la réparation directe par homologie et maintenez-le sur la glace.

Utilisez l’embout buccal de l’aspirateur pour laver les ovocytes avec quatre gouttes fraîches d’acides aminés de caséine. Et transférez-les dans une dernière goutte de milieu de casome huit, recouverte d’huile minérale. Pour réaliser une injection pronucléaire à intégration aléatoire, sous le stéréomicroscope, utilisez l’embout buccal de l’aspirateur pour transformer environ 50 œufs en une goutte de milieu m2, recouverte d’huile minérale qui servira de chambre d’injection.

Transférez la chambre d’injection dans un microscope inversé et injectez les ovocytes fécondés avec quelques picolitres du mélange d’injection. Le pronucléus gonflera si l’injection réussit. Effectuez une injection cytoplasmique pour le ciblage génétique, utilisez un embout buccal pour transférer environ 50 œufs dans une goutte de casome A, contenant cinq microgrammes par millilitre de cytochalasine B et incubez les œufs à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant cinq minutes.

Transférez les ovules dans la chambre d’injection, puis, à très basse pression, injectez quelques picolitres du mélange d’injection dans le cytoplasme. Utiliser la pression de compensation du micro-injecteur automatisé dans la mesure du possible. Après l’injection, utilisez l’embout buccal pour transférer les ovocytes dans une goutte d’acides casomeaminés.

Gardez-les à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone jusqu’à ce qu’ils soient chargés pour la réimplantation dans l’oviducte des femelles pseudo gestantes. Après avoir anesthésié une souris femelle bouchée selon le protocole textuel, pour effectuer une réimplantation dans des conditions stériles, exposez l’appareil reproducteur à l’aide d’un scalpel à une incision d’un centimètre de long parallèle à la ligne médiane dorsale. Ensuite, avec des ciseaux, coupez le muscle et utilisez des pinces pour saisir le coussinet adipeux.

Tirez doucement l’ovaire vers l’extérieur, jusqu’à ce que son oviducte et son utérus soient clairement visibles. Utilisez ensuite une pince pour récipient pour fixer le coussinet de graisse. Sous le stéréomicroscope, à l’aide d’une paire de micro-ciseaux, faites une incision dans la paroi de l’oviducte, à quelques millimètres en amont de l’ampoule.

De plus, sous le stéréomicroscope, chargez 25 œufs micro-injectés dans le capillaire en verre relié à l’embout buccal. Ensuite, insérez le capillaire en verre dans l’oviducte et expulsez les œufs jusqu’à ce qu’une bulle d’air soit visible à l’intérieur de l’ampoule. Pour s’assurer que la réimplantation a réussi, vous devez vérifier la présence de la bulle d’air dans l’ampoule, ce qui garantit que tous les ovules ont été expulsés au bon endroit et qu’aucun ne reste dans le capillaire en verre.

Retirez délicatement le capillaire en verre et replacez l’appareil reproducteur dans l’abdomen. Ensuite, utilisez trois sutures chirurgicales non résorbables pour suturer l’incision, puis utilisez des clips pour fermer la peau. Placez la souris sur un tapis chaud pour éviter l’hypothermie et injectez un analgésique par voie sous-cutanée.

Surveillez la souris jusqu’à ce qu’elle se rétablisse complètement. Enfin, effectuez le typage et le séquençage du génome selon le protocole texte. Cette figure montre des gels analytiques démontrant la qualité de la purification du transgène et de la synthèse de l’ARNsg qui sont essentielles pour générer avec succès des souris génétiquement modifiées.

Voici une lecture typique d’une session de micro-injection pour une intégration aléatoire. L’amorce de génotypage doit reposer sur le transgène et doit être conçue pour générer un fragment de 200 à 800 paires de bases. Dans cette lecture du ciblage génétique, les amorces sélectionnées pour s’hybrider avec l’ADN génomique en dehors de la région finalement excisée par les deux gars.

Cette stratégie permet d’identifier directement les fondateurs hétérozygotes et homozygotes. Comme illustré ici, lorsque chaque étape du protocole est optimisée, le pourcentage de chiots transgéniques devrait atteindre 10 % à 25 % pour l’intégration aléatoire, ce qui est quelque peu faible par rapport à la capacité des composants CRISPR à modifier le génome de la souris. En utilisant CRISPR pour le ciblage génétique, le nombre de fondateurs est généralement plus élevé, allant de 25 % à 100 %Il n’est pas rare d’obtenir une descendance entière qui est homozygote avec succès lorsqu’elle est modifiée à l’aide de CRISPR.

Après son développement, cette technique permet à des chercheurs dans des domaines tels que les neurosciences ou le cancer par exemple, d’utiliser de nouveaux modèles de masques pour découvrir des mécanismes pathologiques et éventuellement les traduire en stratégies thérapeutiques.