Name: Production de souris génétiquement modifiées par micro-injection dovocytes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-06-15T13:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 19 s
Description: Découvrez la micro-injection d'ovocytes pour créer des souris génétiquement modifiées par transgenèse et CRISPR. Ce protocole détaillé permet de générer des modèles en six semaines avec contrôle qualité rigoureux.

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Les auteurs remercient le personnel de l&#39;établissement animal (BRC) pour leur soutien continu. Ce travail a été financé par le National Health and Medical Research Council et le Australian Research Council.

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<li>Ittner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+phosphorylation+of+tau+inhibits+amyloid-beta+toxicity+in+Alzheimer%27s+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Site-specific phosphorylation of tau inhibits amyloid-beta toxicity in Alzheimer's mice.</a> Science. 354 (6314), 904-908 (2016).</li>
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<li>Gordon, J. W., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integration+and+stable+germ+line+transmission+of+genes+injected+into+mouse+pronuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Integration and stable germ line transmission of genes injected into mouse pronuclei.</a> Science. 214 (4526), 1244-1246 (1981).</li>
<li>Gordon, J. W., Scangos, G. A., Plotkin, D. J., Barbosa, J. A., Ruddle, F. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+transformation+of+mouse+embryos+by+microinjection+of+purified+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Genetic transformation of mouse embryos by microinjection of purified DNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 77 (12), 7380-7384 (1980).</li>
<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Yagle, M. K., Palmiter, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Factors+affecting+the+efficiency+of+introducing+foreign+DNA+into+mice+by+microinjecting+eggs%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Factors affecting the efficiency of introducing foreign DNA into mice by microinjecting eggs.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 82 (13), 4438-4442 (1985).</li>
<li>Capecchi, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+targeting+in+mice%3A+functional+analysis+of+the+mammalian+genome+for+the+twenty-first+century%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Gene targeting in mice: functional analysis of the mammalian genome for the twenty-first century.</a> Nat Rev Genet. 6 (6), 507-512 (2005).</li>
<li>Carbery, I. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeted+genome+modification+in+mice+using+zinc-finger+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Targeted genome modification in mice using zinc-finger nucleases.</a> Genetics. 186 (2), 451-459 (2010).</li>
<li>Sung, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockout+mice+created+by+TALEN-mediated+gene+targeting%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Knockout mice created by TALEN-mediated gene targeting.</a> Nat Biotechnol. 31 (1), 23-24 (2013).</li>
<li>Jinek, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+programmable+dual-RNA-guided+DNA+endonuclease+in+adaptive+bacterial+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity.</a> Science. 337 (6096), 816-821 (2012).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-step+generation+of+mice+carrying+mutations+in+multiple+genes+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">One-step generation of mice carrying mutations in multiple genes by CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Cell. 153 (4), 910-918 (2013).</li>
<li>Kang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Introducing+precise+genetic+modifications+into+human+3PN+embryos+by+CRISPR%2FCas-mediated+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22J+Assist+Reprod+Genet%22%5BJournal%5D)">Introducing precise genetic modifications into human 3PN embryos by CRISPR/Cas-mediated genome editing.</a> J Assist Reprod Genet. 33 (5), 581-588 (2016).</li>
<li>Liang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+gene+editing+in+human+tripronuclear+zygotes%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated gene editing in human tripronuclear zygotes.</a> Protein Cell. 6 (5), 363-372 (2015).</li>
<li>Ittner, L. M., Götz, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pronuclear+injection+for+the+production+of+transgenic+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Pronuclear injection for the production of transgenic mice.</a> Nat Protoc. 2 (5), 1206-1215 (2007).</li>
<li>Yang, H., Wang, H., Jaenisch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generating+genetically+modified+mice+using+CRISPR%2FCas-mediated+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Generating genetically modified mice using CRISPR/Cas-mediated genome engineering.</a> Nat Protoc. 9 (8), 1956-1968 (2014).</li>
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<li>Auerbach, A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strain-dependent+differences+in+the+efficiency+of+transgenic+mouse+production%5BTitle%5D)+AND+%22Transgenic+Res%22%5BJournal%5D)">Strain-dependent differences in the efficiency of transgenic mouse production.</a> Transgenic Res. 12 (1), 59-69 (2003).</li>
<li>Merriman, J. A., Jennings, P. C., McLaughlin, E. A., Jones, K. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effect+of+aging+on+superovulation+efficiency%2C+aneuploidy+rates%2C+and+sister+chromatid+cohesion+in+mice+aged+up+to+15+months%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Reprod%22%5BJournal%5D)">Effect of aging on superovulation efficiency, aneuploidy rates, and sister chromatid cohesion in mice aged up to 15 months.</a> Biol Reprod. 86 (2), 49(2012).</li>
<li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ultra-superovulation+for+the+CRISPR-Cas9-mediated+production+of+gene-knockout%2C+single-amino-acid-substituted%2C+and+floxed+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Biol+Open%22%5BJournal%5D)">Ultra-superovulation for the CRISPR-Cas9-mediated production of gene-knockout, single-amino-acid-substituted, and floxed mice.</a> Biol Open. 5 (8), 1142-1148 (2016).</li>
<li>Byers, S. L., Wiles, M. V., Dunn, S. L., Taft, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mouse+estrous+cycle+identification+tool+and+images%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Mouse estrous cycle identification tool and images.</a> PLoS One. 7 (4), e35538(2012).</li>
<li>Whitten, W. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modification+of+the+oestrous+cycle+of+the+mouse+by+external+stimuli+associated+with+the+male%5BTitle%5D)+AND+%22J+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Modification of the oestrous cycle of the mouse by external stimuli associated with the male.</a> J Endocrinol. 13 (4), 399-404 (1956).</li>
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<li>Brinster, R. L., Chen, H. Y., Trumbauer, M. E., Avarbock, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translation+of+globin+messenger+RNA+by+the+mouse+ovum%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Translation of globin messenger RNA by the mouse ovum.</a> Nature. 283 (5746), 499-501 (1980).</li>
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<li>Nakagata, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Embryo+transfer+through+the+wall+of+the+fallopian+tube+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Jikken+Dobutsu%22%5BJournal%5D)">Embryo transfer through the wall of the fallopian tube in mice.</a> Jikken Dobutsu. 41 (3), 387-388 (1992).</li>
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<li>Delerue, F., Ittner, L. M. <a target="_blank" href="https://www.omicsgroup.org/journals/cloning-transgenesis-abstract.php?abstract_id=50992">Genome Editing in Mice Using CRISPR/Cas9: Achievements and Prospects.</a> Clon. Transgen. 4, (2015).</li>
</ol>

Les auteurs fournissent des services de transgénèse académique chez la souris via le centre d&#39;analyse Mark Wainwright de l&#39;Université de New South Wales.

Etapes critiques dans le protocole On sait que la génération de souris génétiquement modifiées présente un défi technique. Cependant, le protocole présenté ici est une méthode optimisée et simplifiée qui permet de maîtriser et de dépanner la technique en un temps record. Il faut deux étapes pour réussir la technique. Tout d&#39;abord, la synthèse de modèles d&#39;ADN linéaires (pour la synthèse des sgRNA) peut être obtenue sans chlorure de magnésium (MgCl 2 ). Cependant, il est forte...

Les modèles animaux, chez les vertébrés et les invertébrés, ont contribué à l&#39;examen de la pathophysiologie des affections humaines telles que la maladie d&#39;Alzheimer 1 , 2 . Ils sont également des outils précieux pour rechercher des modificateurs de maladies et pour finalement développer de nouvelles stratégies de traitement dans l&#39;espoir d&#39;un remède. Bien que chaque modèle ait des limites intrinsèques, l&#39;utilisation des animaux comme modèles systémiques complets est essentielle à la recherche biomédicale. C&#39;est parce que l&#39;environnement physiologique métabolique et complexe ne peut pas être entièrement simulé dans la culture tissulaire. À ce jour, la souris reste l&#39;espèce de mammifère la plus commune utilisée pour la manipulation génétique car elle présente plusieurs avantages. Les processus physiologiques et les gènes associés aux maladies sont fortement conservés chez les souris et les humains. La souris a été le premier mammifère à avoir son génome complet séquencé (2002), un an avant le génome humainMoi (2003). Outre cette richesse de l&#39;information génétique, la souris possède de bonnes capacités d&#39;élevage, un cycle de développement rapide (6 semaines après la fertilisation jusqu&#39;au sevrage) et une taille raisonnable. Tous ces avantages, couplés à des indicateurs physiologiques, tels que des couleurs de revêtement distinctes (requis pour les stratégies de croisement), ont fait de la souris un modèle attrayant pour la manipulation génétique. Notamment, au début de la génétique moderne, Gregor Mendel a commencé à travailler sur des souris avant de passer à des plantes 3 . Les techniques de transfert de gènes ont entraîné la génération de la première souris transgénique il y a trois décennies 4 , initialement créée à l&#39;aide de l&#39;administration virale. Cependant, les chercheurs ont rapidement compris que l&#39;un des principaux défis de la transgénèse de la souris était l&#39;incapacité de contrôler le devenir de l&#39;ADN exogène. Parce que l&#39;administration virale de transgènes dans des ovocytes de souris a abouti à des copies multiples intégrées au hasard dans le génome, la possibilitéY d&#39;établir des lignes transgéniques ultérieures était limité. Une telle limitation a été surmontée lorsque Gordon et al. A généré la première ligne de souris transgénique par microinjection 5 , 6 . Cela a commencé l&#39;ère de la technologie de l&#39;ADN recombinant, et les paramètres influençant le résultat d&#39;une session de micro-injection ont été largement étudiés 7 . Bien que la micro-injection ne permette pas le contrôle sur le site d&#39;intégration du transgène (qui aboutit finalement à des niveaux d&#39;expression spécifiques pour chaque souris fondatrice), l&#39;avantage principal de la microinjection pronucléaire reste la formation de concatemers ( c.-à-d. Des tableaux de multiples copies du transgène, Liés en série) avant intégration génomique 5 . Cette caractéristique a été utilisée au cours des années pour établir des milliers de lignes de souris transgéniques qui surexpriment un gène d&#39;intérêt. Depuis lors, la transgénèse, la aModification artificielle du génome d&#39;un organisme, a été largement utilisée pour identifier le rôle des gènes simples dans l&#39;apparition de maladies. Une autre réalisation clé dans la manipulation du génome de la souris a été atteinte lorsque Mario Capecchi a perturbé avec succès un seul gène à la souris, ouvrant l&#39;ère du ciblage des gènes 8 . Cependant, des inconvénients majeurs ont rapidement émergé du ciblage génétique basé sur les cellules ES, y compris les défis de la culture des cellules ES, le degré de chimérisme quelque peu variable et la durée du processus ( c&#39;est-à-dire 12-18 mois minimum pour obtenir la souris) . Récemment, les progrès dans les nouvelles technologies, telles que les endonucléases modifiées ( p. Ex., Les nucléases de doigts de zinc (ZFN), les nucléases effectrices de l&#39;activateur de la transcription (TALEN) et les répétitions palindromiques courtes (CRISPR / Cas9) classées régulièrement sont apparues comme des méthodes alternatives Accélérer le processus de ciblage des gènes dans le microE 9 , 10 . Ces endonucléases peuvent être facilement injectées dans des ovocytes de souris par micro-injection, ce qui permet de générer des souris ciblées par gène en 6 semaines seulement. Depuis le premier rapport sur l&#39;utilisation de CRISPR pour l&#39;édition génomique 11 , ce système immunitaire adaptatif bactérien a remplacé ZFN et TALEN en raison de ses nombreux avantages, y compris la facilité de la synthèse et la capacité de cibler de multiples loci à la fois (appelés &quot;multiplexage&quot; &quot;). Le CRISPR a d&#39;abord été utilisé pour le ciblage des gènes chez la souris 12 et a depuis été appliqué à d&#39;innombrables espèces, des plantes aux humains 13 , 14 . À ce jour, aucun rapport d&#39;une seule espèce n&#39;est résistant à l&#39;édition du génome CRISPR. Les deux principales étapes limitantes de la génération de souris transgéniques sont l&#39;injection d&#39;ovocytes et la réimplantationDe ces ovocytes chez des femelles pseudo-grossières. Bien que cette technique ait été décrite par nous 15 et d&#39;autres 16 , des améliorations techniques récentes dans l&#39;embryologie de souris et les techniques de transfert de gènes ont révolutionné le processus de génération de souris génétiquement modifiées. Ces améliorations seront décrites ici.

<table><tbody><tr><td>Micropipette 0,1-2,5 &mu ; L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000016</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 2 - 20 &mu ; L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000040</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 20 - 200 &mu ; L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000067</td><td></td></tr><tr><td>Micropipette 100 - 1 000 &mu ; L</td><td>Eppendorf</td><td>4920000083</td><td></td></tr><tr><td>Marqueur de poids moléculaire</td><td>Bioline</td><td>BIO-33025</td><td>HyperLadder 1 kb</td></tr><tr><td>Marqueur de poids moléculaire&nbsp ;</td><td>Bioline</td><td>BIO-33056</td><td>HyperLadder 100 bp</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Bioline</td><td>BIO-41025</td><td></td></tr><tr><td>Tampon EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>93296</td><td>10x - Diluer à 1x</td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>SYBR Coloration de gel sûre</td><td>Invitrogen</td><td>S33102</td><td></td></tr><tr><td>Kit d’extraction de gel</td><td>Qiagen</td><td>28706</td><td></td></tr><tr><td>Kit de purification PCR (Qiaquick)</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td></td></tr><tr><td>Système de vide (Manifold)</td><td>Promega</td><td>A7231</td><td></td></tr><tr><td>Tampon de micro-injection sans nucléases&nbsp ;</td><td>Millipore</td><td>MR-095-10F</td><td></td></tr><tr><td>Filtre à microcentrifugeuse Ultrafree-MC&nbsp ;</td><td>Millipore</td><td>UFC30GV00</td><td></td></tr><tr><td>Cas9 ARNm</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>CAS9MRNA</td><td></td></tr><tr><td>plasmide exprimant CRISPR (px330)</td><td>Addgene</td><td>42230</td><td></td></tr><tr><td>Eau sans nucléase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>Phusion polymérase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0530L</td><td></td></tr><tr><td>T7 Kit d’ARN rapide à haut rendement</td><td>New England Biolabs</td><td>E2050S</td><td></td></tr><tr><td>Colonnes de spin de purification d’ARN (NucAway)</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>AM10070</td><td></td></tr><tr><td>ssOligos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>OLIGO STANDARD</td><td></td></tr><tr><td>Plasmide donneur</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>GeneArt</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3884</td><td></td></tr><tr><td>KSOMaa milieu de culture embryonnaire</td><td>Zenith Biotech&nbsp ;</td><td>ZEKS-100</td><td></td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Zenith Biotech&nbsp ;</td><td>ZSCO-100</td><td></td></tr><tr><td>M2 Medium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M7167</td><td></td></tr><tr><td>Cytochalasine B</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C6762</td><td></td></tr><tr><td>Embout buccal</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A5177</td><td></td></tr><tr><td>Microcapillaires en verre</td><td>Sutter Instrument</td><td>BF100-78-10</td><td></td></tr><tr><td>Proteinase K</td><td>Applichem</td><td>A3830.0100</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5 pince</td><td>Outils de science fine&nbsp ;</td><td>91150-20</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à iris</td><td>Outils scientifiques fins&nbsp ;</td><td>91460-11</td><td></td></tr><tr><td>Pince pour récipient</td><td>Fine Science Tools&nbsp ;</td><td>18374-43</td><td></td></tr><tr><td>Pinces de plaie</td><td>Outils de science fine&nbsp ;</td><td>12040-01</td><td></td></tr><tr><td>Applicateur de clips</td><td>Outils de science fine&nbsp ;</td><td>12018-12</td><td></td></tr><tr><td>Micro-ciseaux&nbsp ;</td><td>Outils de science fine&nbsp ;</td><td>15000-03</td><td></td></tr><tr><td>Cautériseur</td><td>Outils de science fine&nbsp ;</td><td>18000-00</td><td></td></tr><tr><td>Sutures chirurgicales non résorbables (Ethilon 3-0)</td><td>Ethicon</td><td>1691H</td><td></td></tr><tr><td>5 % CO2 incubateur</td><td>MG Scientific</td><td>Galaxy 14S</td><td></td></tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>Nanodrop 2000c</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Eppendorf</td><td>6321 000.515</td><td></td></tr><tr><td>Installation d’électrophorèse BioRad</td><td></td><td>1640300</td><td></td></tr><tr><td>Transilluminateur UV</td><td>BioRad</td><td>1708110EDU</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Eppendorf</td><td>6334000069</td><td></td></tr><tr><td>Microscope stéréoscopique</td><td>Olympus</td><td>SZX7</td><td></td></tr><tr><td>Microscope inversé</td><td>Olympus</td><td>IX71</td><td></td></tr><tr><td>2x Micromanipulateurs</td><td>Eppendorf</td><td>5188000.012</td><td></td></tr><tr><td>Ovocytes manipulateur</td><td>Eppendorf</td><td>5176000.025</td><td></td></tr><tr><td>Microinjecteur (Femtojet)</td><td>Eppendorf</td><td>5247000.013</td><td></td></tr><tr><td>Souris C57BL/6J souche</td><td>Australian BioResources</td><td>C57BL/6JAusb&nbsp ;</td><td></td></tr></tbody></table>

production de souris génétiquement modifiées par micro-injection d&#39;ovocytes

Generation of Genetically Modified Mice through the Microinjection of Oocytes

L&#39;utilisation de souris génétiquement modifiées a contribué de manière significative aux études sur les processus physiologiques et pathologiques in vivo . L&#39;injection pronucléaire des constructions d&#39;expression d&#39;ADN dans les ovocytes fécondés reste la technique la plus couramment utilisée pour générer des souris transgéniques pour une surexpression. Avec l&#39;introduction de la technologie CRISPR pour le ciblage des gènes, l&#39;injection pronucléaire dans les ovocytes fécondés a été étendue à la génération de souris knock-out et knockin. Ce travail décrit la préparation de l&#39;ADN pour l&#39;injection et la génération de guides CRISPR pour le ciblage des gènes, en mettant l&#39;accent sur le contrôle de la qualité. Les procédures de génotypage nécessaires à l&#39;identification des fondateurs potentiels sont essentielles. Des stratégies novatrices de génotypage qui profitent des capacités de &quot;multiplexage&quot; de CRISPR sont présentées ici. Les procédures chirurgicales sont également décrites. Ensemble, les étapes du protocole permettront la génération de genDes souris modifiées de manière sélective et pour l&#39;établissement ultérieur de colonies de souris pour une pléthore de domaines de recherche, y compris l&#39;immunologie, les neurosciences, le cancer, la physiologie, le développement et d&#39;autres.

Ci-dessous, les flux de travail pour la micro-injection dans le cas de l&#39;intégration aléatoire et le ciblage des gènes médiés par CRISPR sont décrits ( Figure 1 ). <img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/55765/55765fig1v2.jpg" /> Figure 1: Flux de travail typique pour la génération de souris génétiquement modifiées. Pour une intégration aléatoire, le tr...

La micro-injection d&#39;ovocytes de souris est couramment utilisée à la fois pour la transgénèse classique ( c.-à-d. L&#39;intégration aléatoire des transgènes) et le ciblage des gènes médié par CRISPR. Ce protocole examine les derniers développements en micro-injection, avec un accent particulier sur le contrôle de la qualité et les stratégies de génotypage.

Production de souris génétiquement modifiées par micro-injection d&#39;ovocytes

The use of genetically modified mice has significantly contributed to studies on both physiological and pathological in vivo processes. The pronuclear ...

L'objectif général de ce protocole est de décrire les procédures nécessaires à la génération réussie de souris génétiquement modifiées par microinjection d'ovocytes. Ce protocole peut aider les chercheurs et le personnel technique impliqués soit dans le domaine de la genèse de souris, soit dans le ciblage génique. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait qu'elle repose sur l'injection directe d'ovocytes de souris, aussi bien pour l'intégration aléatoire que pour le ciblage génique, permettant ainsi la génération de souris génétiquement modifiées en aussi peu que six semaines.Pour préparer un ARN guide unique, après avoir sélectionné les deux séquences cibles souhaitées et conçu les amorces selon le protocole décrit, synthétisez un modèle d'ADN linéaire en diluant le plasmide PX330 à 10 nanogrammes par microlitre dans de l'eau sans nucléase. Préparez un mélange maître, en ajoutant la polymérase à la fin, et maintenez-le sur glace. Ensuite, mélangez et répartissez la solution en huit tubes de PCR.Ajouter un microlitre de PXR330 par tube, puis exécuter le programme suivant. Ensuite, purifier le produit de PCR à l’aide d’un kit de purification de PCR, d’un collecteu

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Les ovocytes sont sujettes à une aneuploïdie raison d'erreurs dans la ségrégation des chromosomes lors de la maturation méiotique. Oeufs aneuploïdes peut causer l'infertilité, fausses couches ou des troubles du développement tels que le syndrome de Down. Ici, nous décrivons les méthodes pour introduire des matériaux de choix dans des ovocytes et des méthodes pour étudier la maturation méiotique et évaluer ploïdie.

Évaluation microinjection des ovocytes de souris, la maturation et de ploïdie

Cette vidéo décrit l’injection pronucléaire de vecteurs lentiviraux dans l’espace périvitellin d’un embryon de souris fécondé. Le lentivirus contient le transgène, qui est incorporé dans le génome de l’embryon fécondé, donnant finalement naissance à des souris transgéniques.

Injection de périvitelline à base de vecteur lentiviral : une méthode pour transduire le gène d’intérêt dans des ovocytes de souris monocellulaires fécondés

nucléases de créateurs tels que nucléases à doigts de zinc (ZFN) et transcription nucléases effectrices activateur comme (Talens) peuvent être utilisés pour modifier le génome d'embryons de pré-implantation de souris en déclenchant à la fois la fin non homologue rejoindre (NHEJ) et la recombinaison homologue (RH) des voies. Ces progrès permettent la génération rapide de la souris avec des modifications génétiques précises.

Souris ingénierie des génomes Utilisation nucléases de créateurs

Ici, nous présentons un protocole de l'épuisement de l'ARNm de siRNA médiation spécifique suivie d'une analyse d'immunofluorescence pour évaluer l'assemblage du fuseau méiotique et de l'organisation dans des ovocytes de souris. Ce protocole est approprié pour l'appauvrissement de produits de transcription in vitro et l'évaluation fonctionnelle de broche différents et / ou des facteurs de MTOC associée dans les ovocytes.

Meiotic évaluation de la broche dans la souris ovocytes par silençage siRNA médiation

L'objectif de ce protocole est de décrire un déficitaire et d'acquérir de-méthode de la fonction qui est applicable pour identifier néogénine comme un récepteur spécifique de stade qui mène à trophectoderme et la différenciation cellulaire interne de masse dans des embryons de souris préimplantatoire.

Déficitaires et approche Gain de fonction d&#39;enquêter sur les cellules précoce destin déterminants dans les embryons de souris préimplantatoire

Comme les variantes génétiques associées à des maladies humaines commencent à devenir non couvert, il devient de plus en plus important de développer des systèmes permettant d’évaluer rapidement l’importance biologique de ces variants identifiés. Ce protocole décrit les méthodes d’évaluation de la fonction du gène humain au cours de la méiose femelle j’ai utiliser les ovocytes de souris.

À l’aide des ovocytes de souris pour évaluer la fonction du gène humain au cours de la méiose I

Nous présentons ici un protocole visant à promouvoir l’intégration du transgène et la production de souris transgéniques fondateur avec grande efficacité par une simple injection d’un vecteur lentiviral dans l’espace périvitellin d’un ovocyte fécondé.

Production de souris transgéniques par des gènes : une méthode Simple et très efficace pour l’étude directe des fondateurs

Le présent protocole décrit la micro-injection de zygotes de CRISPR-Cas9 et d’ADN de donneur pour produire efficacement des souris frappées par cassette de gènes et floxées.

Micro-injection de zygote pour la création d’allèles knock-in et flox de cassette génique chez la souris

Un protocole optimisé est présenté qui permet l’épuisement des centres d’organisation des microtubules cytoplasmiques dans les ovocytes de souris au cours de la métaphase I à l’aide d’un laser femtoseconde proche infrarouge.

Ablation laser multiphotonique de centres organisateurs de microtubules cytoplasmiques dans les ovocytes de souris

Ce protocole décrit la microinjection et l’électroporation in vivo pour l’édition du génome médiée par CRISPR restreinte régionalement dans l’oviducte de souris.

Modèles murins génétiquement modifiés par génome somatique utilisant la microinjection et l’électroporation in vivo

L’efficacité de la méthode I-GONAD (Improved Genome Editing via Oviductal Nucleic Acids Delivery) est comparable à celle de la micro-injection traditionnelle, qui nécessite la collecte de zygotes sur les femelles donneuses et le transfert à des femelles pseudo-enceintes. Ce protocole démontre son efficacité en introduisant des mutations induites par CRISPR/Cas9 dans le locus ROSA26 sur le chromosome 6.

Amélioration de l’édition du génome via une technique d’électroporation in vivo basée sur l’administration d’acides nucléiques oviductaux pour la génération de souris knock-out

Découvrez la micro-injection d'ovocytes pour créer des souris génétiquement modifiées par transgenèse et CRISPR. Ce protocole détaillé permet de générer des modèles en six semaines avec contrôle qualité rigoureux.

Production de souris génétiquement modifiées par micro-injection d'ovocytes

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