Intégration de l'extraction de phase solide miniaturisée et détection de la LC-MS / MS de la 3-nitrotyrosine dans l'urine humaine pour les applications cliniques

L’objectif global de cette extraction miniaturisée en phase solide combinée au dosage LC-MS/MS est de quantifier avec précision la 3-nitrotyrosine libre dans l’urine humaine pour des applications cliniques. La 3-nitrotyrosine libre aide aux rendements et constitue un biomarqueur du stress oxydatif. Cependant, il restera un défi particulier de quantifier avec précision la 3-nitrotyrosine dans les urgences biologiques pour les applications cliniques en raison d’une sensibilité insuffisante, d’une sélectivité et de préparations d’échantillons lourdes.

Cette technique incorporant une extraction efficace en phase solide dans une interaction LC-MS/MS très sensible permet une détermination rapide, spécifique et précise de faibles niveaux de 3-nitrotyrosine endogène dans l’urine humaine sans avoir besoin de constitution et de LC bidimensionnelle. Les implications de cette technique pourraient être étendues à la surveillance de l’efficacité du traitement antioxydant, car le niveau de 3-nitrotyrosine peut être réduit par les antioxydants. Pour commencer cette procédure, vortex a préalablement préparé et décongelé des échantillons d’urine, des étalons et des échantillons de contrôle qualité.

Après le vortex, ajoutez 250 microlitres de chaque échantillon et étalon à 32 puits d’une plaque de collecte propre de deux millilitres à 96 puits. Ajouter 50 microlitres de solution de travail étalon interne préalablement préparée dans chaque puits, à l’exception du puits d’échantillon à double blanc. Ajoutez ensuite 50 microlitres d’eau de qualité LC-MS avec 0,01 % d’acide formique dans le puits d’échantillon à double blanc.

Ensuite, ajoutez 250 microlitres d’eau de qualité LC-MS avec 0,1 % d’acide formique dans les puits. Mélangez ensuite les solutions trois fois à l’aide d’une pipette à huit canaux et couvrez la plaque jusqu’au chargement de l’EPS. Ensuite, placez une microplaque d’extraction à 96 puits à échange cationique en mode mixte et un réservoir de collecte sur un processeur à pression positive.

L’extraction en phase solide à l’aide d’une microplaque échangeuse de cations en mode mixte permet le nettoyage simultané de l’échantillon et l’enrichissement en 3-nitrotyrosine en une seule extraction. Conditionnez la plaque d’extraction en faisant couler 200 microlitres de méthanol de qualité LC-MS à travers le sorbant. Tournez le bouton de réglage de la pression sur le processeur de pression positive pour régler une basse pression positive afin de permettre au mélange de s’écouler lentement à travers le sorbant, en ajustant la pression si nécessaire.

Équilibrez en faisant couler 200 microlitres d’eau de qualité LC-MS avec 2 % d’acide formique à travers le sorbant. À l’aide d’une pipette à huit canaux, chargez soigneusement tout le volume de chacun des échantillons pré-mélangés sur la plaque d’extraction préconditionnée. Réglez une faible pression positive sur le processeur à pression positive pour permettre au mélange de s’écouler lentement à travers le sorbant, en ajustant la pression au besoin.

Ensuite, lavez les puits en faisant couler 200 microlitres d’eau de qualité LC-MS avec 2 % d’acide formique à travers le sorbant. Après le lavage avec 200 microlitres de méthanol et d’eau, réglez le processeur à pression positive sur haute pression afin de sécher les puits. Une fois les puits secs, remplacez le réservoir par une plaque de collecte propre de deux millilitres à 96 puits.

Maintenant, appliquez 50 microlitres d’une solution d’acétate d’ammonium de 25 millimolaires pour éluer lentement l’analyte retenu et l’étalon interne de la plaque d’extraction. Ajoutez ensuite 50 microlitres d’eau de qualité LC-MS avec 5 % d’acide formique pour neutraliser l’éluant. L’application d’une solution d’acétate d’ammonium doux pour l’élution de la 3-nitrotyrosine offre une sélectivité et une sensibilité considérablement améliorées.

Mélangez les échantillons à l’aide d’une pipette à huit canaux trois fois en préparation de l’analyse par chromatographie liquide par spectrométrie de masse en tandem. Après avoir configuré l’instrument LC-MS/MS, équilibrez la méthode LC-MS/MS 3-nitrotyrosine pendant 10 minutes avec l’élution de gradient LC. En équilibrant la méthode, le gradient LC sera équilibré à l’élution initiale du gradient

La température de l’échantillonneur automatique sera réglée sur quatre degrés Celsius et la température du four sera réglée sur 30 degrés Celsius. Créez une liste de lots qui comprend les échantillons d’urine, les étalons et les échantillons de contrôle qualité. Démarrez ensuite le lot en injectant les échantillons préparés.

Après avoir terminé toutes les injections, établissez une courbe standard avec une plage de 10 à 2 500 picogrammes par millilitre pour la quantification de la 3-nitrotyrosine par régression linéaire du rapport de surface de pic de 3-nitrotyrosine et de l’étalon interne par rapport à la concentration nominale de 3-nitrotyrosine. Enfin, quantifiez tous les autres échantillons à l’aide de la courbe standard établie et déterminez si les échantillons de CQ se situent dans la plage établie. Les données LC d’échantillons d’urine humaine montrent que la 3-nitrotyrosine est séparée par chromatographie d’autres analogues de tyrosine structurellement similaires dans des conditions optimisées, ce qui élimine les interférences de co-élution dues à ces composés largement excessifs et, par conséquent, améliore le degré de sélectivité du dosage.

Un signal de 3-nitrotyrosine n’est pas observé dans le chromatogramme de surveillance des réactions multiples de l’échantillon à double blanc, ce qui indique que la 3-nitrotyrosine ne se forme pas pendant tout le processus. Des chromatogrammes représentatifs de surveillance des réactions multiples de la 3-nitrotyrosine et de l’étalon interne pour un individu en bonne santé sont présentés ici. Aucun signal brouilleur n’a été observé aux temps de rétention de la 3-nitrotyrosine et de l’étalon interne.

Une courbe standard représentative est illustrée ici. La limite de détection, définie comme la concentration la plus faible avec un rapport signal/bruit supérieur à trois, a été déterminée à deux picogrammes par millilitre. La limite inférieure de quantification a été déterminée à 10 picogrammes par millilitre et est définie comme la concentration la plus faible à moins de 20 % de l’imprécision et de l’exactitude avec un rapport signal/bruit supérieur à 10.

Le test d’intégration affiné offre une spécificité, une sensibilité et un débit considérablement améliorés avec une réduction de l’effet de matrice, de l’utilisation de sorbants et de l’élimination des déchets. Grâce à ce test simple et rapide, l’échantillon d’urine peut être traité dans les 24 heures. Tenez compte du prélèvement d’urine non invasif et peu coûteux.

Cette méthode remarquablement améliorée est bien adaptée pour évaluer le rôle de la 3-nitrotyrosine en tant que biomarqueur du stress oxydatif dans les études précliniques et cliniques.