Name: Quantification simultanée de kynurenines sélectionnées analysées par chromatographie liquide-spectrométrie de masse dans le milieu recueilli à partir des cultures de cellules cancéreuses (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2020-05-09T13:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 38 s
Description: Découvrez une méthode validée de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse pour quantifier les métabolites du tryptophane dans les cultures de cellules cancéreuses. Ce protocole garantit des données fiables.

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Ces travaux ont été soutenus par l’Union européenne par le Fonds européen de développement régional dans le cadre du Programme opérationnel développement de la Pologne orientale 2007-2013 (POPW.01.03.00-06-003/09-00), par la Faculté des biotechnologies et des sciences de l’environnement de l’Université catholique Jean-Paul II de Lublin (subvention des jeunes scientifiques pour Ilona Sadok), Centre national polonais des sciences, OPUS13 (25/04/01198 2017/2017/25/B/NZ4/01198 pour Magdalena Staniszewska, chercheuse principale).  Les auteurs remercient le Professeur Agnieszka Ścibior du Laboratoire de Stress Oxydatif, Centre de Recherche Interdisciplinaire, JPII CUL pour le partage de l’équipement pour la culture cellulaire et la quantification des protéines.

<ol><li>Li, F., Zhang, R., Li, S., Liu, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((IDO1%3A+an+import+ant+immunotherapy+target+in+cancer+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22International+Immunopharmacology%22%5BJournal%5D)">IDO1: an import ant immunotherapy target in cancer treatment.</a> International Immunopharmacology. 47, 70-77 (2017).</li>
<li>Heng, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Understanding+the+role+of+the+kynurenine+pathway+in+human+breast+cancer+immunobiology%5BTitle%5D)+AND+%22Oncotarget%22%5BJournal%5D)">Understanding the role of the kynurenine pathway in human breast cancer immunobiology.</a> Oncotarget. 7 (6), 6506-6520 (2015).</li>
<li>Badawy, A. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenine+pathway+and+human+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Experimental+Gerontology%22%5BJournal%5D)">Kynurenine pathway and human systems.</a> Experimental Gerontology. 129, (2020).</li>
<li>Chen, Y., Guillemin, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenine+pathway+metabolites+in+humans%3A+Disease+and+healthy+states%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Tryptophan+Research%22%5BJournal%5D)">Kynurenine pathway metabolites in humans: Disease and healthy states.</a> International Journal of Tryptophan Research. 2 (1), 1-19 (2009).</li>
<li>Sathyasaikumar, K. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Xanthurenic+Acid+Formation+from+3-Hydroxykynurenine+in+the+Mammalian+Brain%3A+Neurochemical+Characterization+and+Physiological+Effects%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Xanthurenic Acid Formation from 3-Hydroxykynurenine in the Mammalian Brain: Neurochemical Characterization and Physiological Effects.</a> Neuroscience. 367, 85-97 (2017).</li>
<li>Malina, H., Richter, C., Frueh, B., Hess, O. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lens+epithelial+cell+apoptosis+and+intracellular+Ca2%2B+increasein+the+presence+of+xanthurenic+acid%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Ophthalmology%22%5BJournal%5D)">Lens epithelial cell apoptosis and intracellular Ca2+ increasein the presence of xanthurenic acid.</a> BMC Ophthalmology. 2, 1-7 (2002).</li>
<li>Colín-González, A. L., Maldonado, P. D., Santamaría, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3-Hydroxykynurenine%3A+an+intriguing+molecule+exerting+dual+actions+in+the+central+nervous+system%5BTitle%5D)+AND+%22Neurotoxicology%22%5BJournal%5D)">3-Hydroxykynurenine: an intriguing molecule exerting dual actions in the central nervous system.</a> Neurotoxicology. 34, 189-204 (2013).</li>
<li>Xue, P., Fu, J., Zhou, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+aryl+hydrocarbon+receptor+and+tumor+immunity%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Immunology%22%5BJournal%5D)">The aryl hydrocarbon receptor and tumor immunity.</a> Frontiers in Immunology. 9 (286), 00286(2018).</li>
<li>Tan, V. X., Guillemin, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kynurenine+pathway+metabolites+as+biomarkers+for+amyotrophic+lateral+sclerosis%5BTitle%5D)+AND+%22Frontiers+in+Microbiology%22%5BJournal%5D)">Kynurenine pathway metabolites as biomarkers for amyotrophic lateral sclerosis.</a> Frontiers in Microbiology. 13 (1013), 1-11 (2019).</li>
<li>Wilding, J. L., Bodmer, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cancer+cell+lines+for+drug+discovery+and+development%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Research%22%5BJournal%5D)">Cancer cell lines for drug discovery and development.</a> Cancer Research. 14 (40), 2377-2384 (2015).</li>
<li>Takikawa, O., Kuroiwa, T., Yamazaki, F., Kido, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+interferon-gamma+action.+Characterization+of+indoleamine+2%2C3-dioxygenase+in+cultured+human+cells+induced+by+interferon-gamma+and+evaluation+of+the+enzyme-mediated+tryptophan+degradation+in+its+anticellular+activity%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Mechanism of interferon-gamma action. Characterization of indoleamine 2,3-dioxygenase in cultured human cells induced by interferon-gamma and evaluation of the enzyme-mediated tryptophan degradation in its anticellular activity.</a> Journal of Biological Chemistry. 263 (4), 2041-2048 (1988).</li>
<li>Park, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indoleamine-2%2C3-dioxygenase+in+thyroid+cancer+cells+suppresses+natural+killer+cell+function+by+inhibiting+NKG2D+and+NKp46+expression+via+STAT+signaling+pathways%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Clinical+Medicine%22%5BJournal%5D)">Indoleamine-2,3-dioxygenase in thyroid cancer cells suppresses natural killer cell function by inhibiting NKG2D and NKp46 expression via STAT signaling pathways.</a> Journal of Clinical Medicine. 8 (6), 842-859 (2019).</li>
<li>Sadok, I., Gamian, A., Staniszewska, M. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatographic+analysis+of+tryptophan+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Separation+Science%22%5BJournal%5D)">Chromatographic analysis of tryptophan metabolites.</a> Journal of Separation Science. 40 (15), 3020-3045 (2017).</li>
<li>Fuertig, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LC-MS%2FMS-based+quantification+of+kynurenine+metabolites%2C+tryptophan%2C+monoamines+and+neopterin+in+plasma%2C+cerebrospinal+fluid+and+brain%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">LC-MS/MS-based quantification of kynurenine metabolites, tryptophan, monoamines and neopterin in plasma, cerebrospinal fluid and brain.</a> Bioanalysis. 8 (18), 1903-1917 (2016).</li>
<li>Marcos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Targeting+tryptophan+and+tyrosine+metabolism+by+liquid+chromatography+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+A%22%5BJournal%5D)">Targeting tryptophan and tyrosine metabolism by liquid chromatography tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography A. 1434, 91-101 (2016).</li>
<li>Möller, M., Du Preez, J., Harvey, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+validation+of+a+single+analytical+method+for+the+determination+of+tryptophan%2C+and+its+kynurenine+metabolites+in+rat+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Analytical+Technologies+in+Biomedical+Life+Science%22%5BJournal%5D)">Development and validation of a single analytical method for the determination of tryptophan, and its kynurenine metabolites in rat plasma.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical Life Science. 898, 121-129 (2012).</li>
<li>Lesniak, W. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concurrent+quantification+of+tryptophan+and+its+major+metabolites%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Concurrent quantification of tryptophan and its major metabolites.</a> Analytical Biochemistry. 443 (2), 222-231 (2013).</li>
<li>Badawy, A. A. B., Morgan, C. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+isocratic+liquid+chromatographic+separation+and+quantification+of+tryptophan+and+six+kynurenine+metabolites+in+biological+samples+with+ultraviolet+and+fluorimetric+detection%5BTitle%5D)+AND+%22International+Journal+of+Tryptophan+Research%22%5BJournal%5D)">Rapid isocratic liquid chromatographic separation and quantification of tryptophan and six kynurenine metabolites in biological samples with ultraviolet and fluorimetric detection.</a> International Journal of Tryptophan Research. 3, 175-186 (2010).</li>
<li>Vignau, J., Jacquemont, M. C., Lefort, A., Imbenotte, M., Lhermitte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+tryptophan+and+kynurenine+in+serum+by+HPLC+with+UV+and+fluorescence+detection%5BTitle%5D)+AND+%22Biomedical+Chromatography%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of tryptophan and kynurenine in serum by HPLC with UV and fluorescence detection.</a> Biomedical Chromatography. 18 (10), 872-874 (2004).</li>
<li>Zhang, A., Rijal, K., Ng, S. K., Ravid, K., Chitalia, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+mass+spectrometric+method+for+quantification+of+tryptophan-derived+uremic+solutes+in+human+serum%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Biological+Methods%22%5BJournal%5D)">A mass spectrometric method for quantification of tryptophan-derived uremic solutes in human serum.</a> Journal of Biological Methods. 4 (3), 75(2017).</li>
<li>Arnhard, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+validated+liquid+chromatography-high+resolution-tandem+mass+spectrometry+method+for+the+simultaneous+quantitation+of+tryptophan%2C+kynurenine%2C+kynurenic+acid%2C+and+quinolinic+acid+in+human+plasma%5BTitle%5D)+AND+%22Electrophoresis%22%5BJournal%5D)">A validated liquid chromatography-high resolution-tandem mass spectrometry method for the simultaneous quantitation of tryptophan, kynurenine, kynurenic acid, and quinolinic acid in human plasma.</a> Electrophoresis. 39 (9-10), 1171-1180 (2018).</li>
<li>Oh, J. S., Seo, H. S., Kim, K. H., Pyo, H., Chung, B. C., Lee, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urinary+profiling+of+tryptophan+and+its+related+metabolites+in+patients+with+metabolic+syndrome+by+liquid+chromatography-electrospray+ionization%2Fmass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Urinary profiling of tryptophan and its related metabolites in patients with metabolic syndrome by liquid chromatography-electrospray ionization/mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 409 (23), 5501-5512 (2017).</li>
<li>Huang, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+simple+LC-MS%2FMS+method+for+determination+of+kynurenine+and+tryptophan+concentrations+in+human+plasma+from+HIV-infected+patients%5BTitle%5D)+AND+%22Bioanalysis%22%5BJournal%5D)">A simple LC-MS/MS method for determination of kynurenine and tryptophan concentrations in human plasma from HIV-infected patients.</a> Bioanalysis. 5 (11), 1397-1407 (2013).</li>
<li>Yamada, K., Miyazzaki, T., Shibata, T., Hara, N., Tsuchiya, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+measurement+of+tryptophan+and+related+compounds+by+liquid+chromatography%2Felectrospray+ionization+tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Chromatography+B%3A+Analytical+Technologies+in+Biomedical+and+Life+Sciences%22%5BJournal%5D)">Simultaneous measurement of tryptophan and related compounds by liquid chromatography/electrospray ionization tandem mass spectrometry.</a> Journal of Chromatography B: Analytical Technologies in Biomedical and Life Sciences. 867 (1), 57-61 (2008).</li>
<li>Zhu, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+profiling+of+tryptophan+metabolites+in+serum%2C+urine%2C+and+cell+culture+supernatants+by+liquid+chromatography-tandem+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Analytical+and+Bioanalytical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Quantitative profiling of tryptophan metabolites in serum, urine, and cell culture supernatants by liquid chromatography-tandem mass spectrometry.</a> Analytical and Bioanalytical Chemistry. 401, 3249-3261 (2011).</li>
<li>Hashioka, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Metabolomics+analysis+implies+noninvolvement+of+the+kynurenine+pathway+neurotoxins+in+the+interferon-gamma-+induced+neurotoxicity+of+adult+human+astrocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Neuropsychiatry%22%5BJournal%5D)">Metabolomics analysis implies noninvolvement of the kynurenine pathway neurotoxins in the interferon-gamma- induced neurotoxicity of adult human astrocytes.</a> Neuropsychiatry. 7 (2), (2017).</li>
<li>Sadok, I., Rachwał, K., Staniszewska, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Application+of+the+optimized+and+validated+LC-MS+method+for+simultaneous+quantification+of+tryptophan+metabolites+in+culture+medium+from+cancer+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Pharmaceutical+and+Biomedical+Analysis%22%5BJournal%5D)">Application of the optimized and validated LC-MS method for simultaneous quantification of tryptophan metabolites in culture medium from cancer cells.</a> Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis. 176, 112805-112815 (2019).</li>
<li>Annesley, T. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ion+suppression+in+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Clinical+Chemistry%22%5BJournal%5D)">Ion suppression in mass spectrometry.</a> Clinical Chemistry. 49 (7), 1041-1044 (2003).</li>
<li>Houée-Lévin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+oxidative+modifications+of+tyrosine%3A+An+update+on+mechanisms+of+formation%2C+advances+in+analysis+and+biological+consequences%5BTitle%5D)+AND+%22Free+Radical+Research%22%5BJournal%5D)">Exploring oxidative modifications of tyrosine: An update on mechanisms of formation, advances in analysis and biological consequences.</a> Free Radical Research. 49 (4), 347-373 (2015).</li>
<li>Wei, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Abnormal+Expression+of+Indoleamine+2%2C+3-Dioxygenase+in+Human+Recurrent+Miscarriage%5BTitle%5D)+AND+%22Reproductive+Sciences%22%5BJournal%5D)">Abnormal Expression of Indoleamine 2, 3-Dioxygenase in Human Recurrent Miscarriage.</a> Reproductive Sciences. , e1933719119833788 (2019).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+indoleamine+2%2C3-dioxygenase+in+nasopharyngeal+carcinoma+impairs+the+cytolytic+function+of+peripheral+blood+lymphocytes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Cancer%22%5BJournal%5D)">Expression of indoleamine 2,3-dioxygenase in nasopharyngeal carcinoma impairs the cytolytic function of peripheral blood lymphocytes.</a> BMC Cancer. 9, 416(2009).</li>
<li>Mailankot, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Indoleamine+2%2C3-dioxygenase+overexpression+causes+kynurenine-modification+of+proteins%2C+fiber+cell+apoptosis+and+cataract+formation+in+the+mouse+lens%5BTitle%5D)+AND+%22Laboratory+Investigation%3A+A+Journal+of+Technical+Methods+and+Pathology%22%5BJournal%5D)">Indoleamine 2,3-dioxygenase overexpression causes kynurenine-modification of proteins, fiber cell apoptosis and cataract formation in the mouse lens.</a> Laboratory Investigation: A Journal of Technical Methods and Pathology. 89 (5), 498-512 (2009).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cet article présente un protocole détaillé de LC-SQ pour la quantification simultanée de quatre métabolites principaux de Trp (3HKyn, Kyn, 3HAA, XA) qui sont mesurés dans un milieu des cellules cancéreuses humaines culturenées in vitro. Une attention particulière est accordée à la préparation de l’échantillon, à la procédure chromatographic/spectrométrie de masse et à l’interprétation des données, les points les plus importants de l’analyse.
En général, l’analyse LC-MS, en raison d’un...

Kynurenine pathway (KP) est la voie principale du catabolisme tryptophane (Trp) dans les cellules humaines. L’indoleamine-2,3-dioxygénase (IDO-1) dans les cellules extrahépatiques est la première enzyme limitative de KP et convertit Trp en N-formylkynurenine1. D’autres étapes au sein de KP génèrent d’autres métabolites secondaires, à savoir les kynurenines qui présentent diverses propriétés biologiques. Kynurenine (Kyn) est la première catabolite Trp stable montrant des propriétés toxiques et régulant les événements cellulaires après s’être liant au récepteur des hydrocarbures aryl (AhR)2. Par la suite, Kyn est transformé en plusieurs molécules spontanément ou dans les processus à base d’enzymes, générant de tels métabolites comme la 3-hydroxykynurenine (3HKyn), l’acide anthranilique (AA), l’acide 3-hydroxyanthranilic (3-HAA), l’acide kynurnique (Kyna), et l’acide xanthurnique (XA). Un autre métabolite en aval, 2-amino-3-carboxymuconic acid-6-semialdehyde (ACMS), subit une cyclisation non enzymatique à l’acide quinolinique (QA) ou à l’acide picolinique (PA)1. Enfin, qa est encore transformé en nicotinamide-adénone dinucléotide (NAD+)3, le métabolite KP point final qui est un cofacteur enzyme important. Certaines kynurenines ont des propriétés neuroprotectrices telles que Kyna et PA, tandis que les autres, c’est-à-dire 3HAA et 3HKyn, sonttoxiques 4. L’acide xanthurétique, qui est formé à partir de 3HKyn, présente des propriétés antioxydantes et vasorelaxation5. XA s’accumule dans les lentilles vieillissantes et conduit à l’apoptose des cellules épithéliales6. KP, décrit au milieu du20ème siècle, a gagné plus d’attention quand son implication dans divers désordres a été démontrée. L’activité accrue de cette voie métabolique et l’accumulation de certaines kynurènes modulent la réponse immunitaire et sont associées à différentes conditions pathologiques telles que la dépression, la schizophrénie, l’encéphalopathie, le VIH, la démence, la sclérose latérale amyotrophique, le paludisme, la maladie d’Alzheimer, la maladie de Huntington et le cancer4,7. Quelques changements dans le métabolisme de Trp sont observés dans les microenvironnements de tumeur et les cellulescancéreuses 2,8. En outre, les kynurenines sont considérées comme des marqueurs prometteursde la maladie 9. Dans la recherche sur le cancer, les modèles de culture cellulaire in vitro sont bien établis et largement utilisés pour l’évaluation préclinique des réponses aux médicaments anticancéreux10. Les métabolites de Trp sont sécrètes par les cellules dans le milieu de culture et peuvent être mesurés pour évaluer l’état de la voie kynurenine. Par conséquent, il est nécessaire de développer des méthodes appropriées pour la détection simultanée du plus grand nombre possible de métabolites KP dans une variété de spécimens biologiques avec un protocole facile, flexible et fiable.
Dans cet article, nous décrivons un protocole pour la détermination simultanée de quatre métabolites de voie de kynurenine : Kyn, 3HKyn, 3HAA, et XA par LC-SQ dans un milieu post-culture rassemblé des cellules cancéreuses. Dans une approche analytique moderne, la chromatographie liquide13,14,15,16 est préférée pour la détection et la quantification simultanées des catabolites tryptophanes individuels, contrairement aux analyses biochimiques non spécifiques utilisant le reagent Ehrlich11,12. À l’heure actuelle, il existe de nombreuses méthodes disponibles pour la détermination des kynurenines chez les spécimens humains, principalement à base de chromatographie liquide avec des détecteurs d’ultraviolets ou de fluorescence13,17,18,19. La chromatographie liquide couplée à un détecteur de spectrométrie de masse (LC-MS) semble plus adaptée à ce type d’analyse, en raison de leur sensibilité plus élevée (limites inférieures de détection), de sélectivité et de répétabilité.
Les métabolites de Trp ont déjà été déterminés dans le sérum humain, le plasma etl’urine 13,20,21,22,23,cependant, les méthodes pour d’autres spécimens biologiques, comme le milieu de culture cellulaire sont également désirées. Précédemment, LC-MS a été employé pour des composés Trp-dérivés dans un milieu rassemblé après culturisation des cellules humaines de gliome, des monocytes, des cellules dendritiques ou des astrocytes traités avec le gamma d’interféron (IFN-γ)24,25,26. Actuellement, il est nécessaire de nouveaux protocoles validés qui peuvent permettre une évaluation de plusieurs métabolites dans différents médias culturels, cellules et traitements utilisés dans les modèles de cancer.
Le but de la méthode développée est de quantifier (en une seule course analytique) quatre kynurenines majeures qui peuvent indiquer des anomalies dans KP. Présentés ici sont des étapes critiques de notre protocole récemment publié pour l’analyse quantitative LC-SQ de certaines kynurenines significatives en utilisant une norme interne (3-nitrotyrosine, 3NT) dans le milieu recueilli à partir de cellules cancéreuses humaines in vitro cultivés 27. À notre connaissance, c’est le premier protocole LC-SQ pour la quantification simultanée de 3HKyn, 3HAA, Kyn et XA dans un milieu de culture obtenu à partir des cellules cultivées in vitro. Sur certaines modifications, la méthode pourrait être appliquée davantage pour étudier les changements dans le métabolisme de Trp dans un plus large éventail de modèles de culture cellulaire.

<table><tbody><tr><td>3-hydroksy-DL-kynurenina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1771</td><td></td></tr><tr><td>Acide 3-hydroxyanthranilique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>148776</td><td>97%</td></tr><tr><td>3-nitro-L-tyrosine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>N7389</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile</td><td>Supelco</td><td>1.00029</td><td>hypergrade pour LC-MS LiChrosolv</td></tr><tr><td>Charbon actif</td><td>Supelco</td><td>05105</td><td></td> poudre</tr><tr><td>Balance analytique</td><td>Ohaus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonne analytique</td><td>Agilent Technologies</td><td>959764-902</td><td>Zorbax Eclipse Plus C18 résolution rapide HT (2,1 x 100 mm, 1,8 & micro ; m)</td></tr><tr>Additif éluant <td>au formate d’ammonium</td><td>Supelco</td><td>7022</td><td>pour LC-MS, LiChropur, &ge ; 99.0 %</td></tr><tr><td>Sérum bovin Albumine</td><td>Sigma</td><td>1001887398</td><td></td></tr><tr><td>Bouchons pour flacons chromatographiques</td><td>Agilent Technologies</td><td>5185-5820</td><td>bouchons à vis bleus, PTFE/sil sepa rouge</td></tr><tr><td>Plat de culture cellulaire</td><td>Nest</td><td>704004</td><td>polystyrène, apyrogène, stérile</td></tr><tr><td>Plaque de culture cellulaire</td><td>Biologix</td><td>07-6012</td><td>12 puits, non pyrogène, non cytotoxique, stérile</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>de cellules Thermo Fisher Scientific</td><td></td><td>HERAcell 150i</td></tr><tr><td>Cu Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>modèle 5415R</td></tr><tr><td>Centrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td></td><td>modèle 5428</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger</td><td>Bionovo</td><td>B-2278</td><td>type Eppendorf, 1,5 mL</td></tr><tr><td>Tubes à centrifuger</td><td>Bionovo</td><td>B-3693</td><td>type Falcon, 50 mL, PP</td></tr><tr><td>Données chromatographiques logiciel d’acquisition et d’analyse</td><td>Agilent Technologies</td><td></td><td>LC/MSD ChemStation (B.04.03-S92)</td></tr><tr><td>Flacons chromatographiques à insert</td><td>Agilent Technologies</td><td>9301-1387</td><td>100 &micro ; L</td></tr><tr><td>Flacons chromatographiques Agilent</td><td>Technologies</td><td>5182-0714</td><td>2 mL, verre transparent</td></tr><tr><td>Diméthylsulfoxyde</td><td>Supelco</td><td>1.02950</td><td>Uvasol</td></tr><tr><td>Dubelcco' s Aigle modifié' s Medium (DMEM)</td><td>PAN Biotech</td><td>P04-41450</td><td></td></tr><tr><td>Double mètre pH/conductivité</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>SevenMulti</td></tr><tr><td>Evaporator</td><td>Genevac</td><td></td><td>model EZ-2.3 Elite</td></tr><tr><td>Fetal bovin</td><td>sérum Sigma-Aldrich</td><td>F9665</td><td></td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Supelco</td><td>5.33002</td><td>pour LC-MS LiChropur</td></tr><tr><td>Flacon en verre pour stockage des</td> <td>réactifsBionovo</td><td>S-2070</td><td>50 mL, colonne de protection en verre transparent</td></tr><tr><td></td><td>Agilent Technologies</td><td>959757-902</td><td>Zorbax Eclipse Plus-C18 Colonne de protection à alésage étroit (2,1 x 12,5 mm, 5 & micro ; m)</td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Merck</td><td>1.00317.1000</td><td></td></tr><tr><td>L-kynurénine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K8625</td><td>&ge ; 98 % (HPLC)</td></tr><tr><td>Agitateur magnétique</td><td>Wigo</td><td></td><td>ES 21 H</td></tr><tr><td>Microbalance</td><td>Mettler Toledo</td><td></td><td>modèle XP6</td></tr><tr><td>Système Milli-Q Millipore</td><td></td><td>ZRQSVPO30</td><td>Direct-Q 3 UV avec pompe</td></tr><tr><td>Spectromètre de masse quadripolaire</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1948B</td><td>modèle 6120</td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma-Adrich</td><td>048M4874V</td><td></td></tr><tr><td>Lecteur de plaques</td><td>Bio Tek</td><td></td><td>Synergy 2 exploité par Gen5</td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Merck</td><td>1.04936.1000</td><td></td></tr><tr><td>Dihydrogénophosphate de potassium</td><td>Merck</td><td>1.05108.0500</td><td></td></tr><tr><td>Concentré de réactifs de colorant pour dosage de protéines</td><td>BioRad</td><td>500-0006</td><td></td></tr><tr><td>Bascule à bascule</td><td>Stuart</td><td>SSL4</td><td></td></tr><tr><td>Pipette sérologique</td><td>Nest</td><td>326001</td><td>5 mL, polystyrène, apyrogène, stérile</td></tr><tr><td>Chlorure</td><td>de sodium Sigma-Aldrich</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium dibasique</td><td>Merck</td><td>1.06346.1000</td><td></td></tr><tr><td>Filtre d’entrée de solvant</td><td>Agilent Technologies</td><td>5041-2168</td><td>Filtre en verre, 20 &mu ; m taille des pores</td></tr><tr><td>Réservoir de solvant (pour LC-MS)</td><td>Agilent Technologies</td><td>9301-6524</td><td>1 L, verre transparent</td></tr><tr><td>Réservoir de solvant (pour LC-MS)</td><td>Agilent Technologies</td><td>9301-6526</td><td>1 L, verre ambré</td></tr><tr><td>Tableur</td><td>Microsoft Office</td><td></td><td>Microsoft Office Excel</td></tr><tr><td>Barre d’agitation</td><td>Bionovo</td><td>6-2003</td> Filtres à seringue <td>revêtus de téflon</td></tr><tr><td>pour la culture filtration moyenne</td><td>Bionovo</td><td>7-8803</td><td>cellulose régénérée, & Oslash ; 30 mm, 0,45 & micro ; m</td></tr><tr><td>Filtres à seringue pour la filtration des composants en phase mobile</td><td>Bionovo</td><td>6-0018</td><td>nylon, & Oslash ; 30 mm, 0,22 & micro ; m</td></tr><tr><td>Plaques de culture tissulaire</td><td>VWR</td><td>10062-900</td><td>96 puits,</td></tr><tr><td>solution stérile de trypsine-EDTA</td><td>Sigma-Aldrih</td><td>T4049-100 mL</td><td></td></tr><tr><td>Système de chromatographie liquide à ultra-haute performance</td><td>Agilent Technologies</td><td>G1367D, G1379B, G1312B, G1316C</td><td>1200 Système Infinity composé d’un échantillonneur automatique (G1367D), d’un dégazeur (G1379B), d’une pompe binaire (G1312B), d’un thermostat de colonne (G1316C)</td></tr><tr><td>Bain à ultrasons</td><td>Polsonic</td><td>104533</td><td>modèle 6D</td></tr><tr><td>Vortex</td><td>Biosan</td><td></td><td>modèle V-1 plus</td></tr><tr><td>acide xanthurénique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D120804</td><td>96 %</td></tr></tbody></table>

quantification simultanée de kynurenines sélectionnées analysées par chromatographie liquide-spectrométrie de masse dans le milieu recueilli à partir des cultures de cellules cancéreuses

Simultaneous Quantification of Selected Kynurenines Analyzed by Liquid Chromatography-Mass Spectrometry in Medium Collected from Cancer Cell Cultures

La voie kynurenine et les catabolites de tryptophane appelées kynurenines ont reçu une attention accrue pour leur participation à la régulation immunitaire et à la biologie du cancer. Un test de culture cellulaire in vitro est souvent utilisé pour en apprendre davantage sur la contribution de différents catabolites tryptophane dans un mécanisme de la maladie et pour tester des stratégies thérapeutiques. Le milieu de culture cellulaire qui est riche en métabolites sécrétés et molécules de signalisation reflète l’état du métabolisme du tryptophane et d’autres événements cellulaires. De nouveaux protocoles pour la quantification fiable de kynurenines multiples dans le milieu complexe de culture cellulaire sont souhaités pour permettre une analyse fiable et rapide de plusieurs échantillons. Ceci peut être accompli avec la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse. Cette technique puissante est utilisée dans de nombreux laboratoires cliniques et de recherche pour la quantification des métabolites et peut être utilisée pour mesurer les kynurenines.
Présente ici est l’utilisation de la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse quadrupole unique (LC-SQ) pour la détermination simultanée de quatre kynurenines, c.-à-kynurenine, 3-hydroxykynurenine, 3-hydroxyanthranilic, et acide xanthurnique dans le milieu recueilli à partir de cellules cancéreuses en culture in vitro. Détecteur SQ est simple à utiliser et moins cher par rapport à d’autres spectromètres de masse. Dans l’analyse SQ-MS, plusieurs ions de l’échantillon sont générés et séparés en fonction de leur rapport masse-charge spécifique(m/z),suivi de la détection à l’aide d’un mode de surveillance ion unique (SIM).
Cet article attire l’attention sur les avantages de la méthode signalée et indique certains points faibles. Il est axé sur des éléments critiques de l’analyse LC-SQ, y compris la préparation de l’échantillon ainsi que la chromatographie et l’analyse de spectrométrie de masse. Le contrôle de la qualité, les conditions d’étalonnage des méthodes et les problèmes d’effet matriciel sont également discutés. Nous avons décrit une application simple de 3-nitrotyrosine comme norme analogique pour tous les analytes cibles. Comme le confirment les expériences menées auprès d’ovaires humains et de cellules cancéreuses du sein, la méthode LC-SQ proposée génère des résultats fiables et peut être appliquée à d’autres modèles cellulaires in vitro.

LC-MS présente des avantages incontestables dans la quantification des molécules biologiquement actives, même si certaines composantes de spécimens complexes provoquent des effets matriciels et compromettent l’ionisation des analytes. Elle conduit à la suppression des ion ou à l’amélioration de l’ion, diminuant fortement la précision et affectant une limite de détection/quantification de la LC-MS, qui est considérée comme un point « faible » de la méthode. Dans notre protocole, les ions sont générés par l’ionisation d’él...

Décrit ici est un protocole pour la détermination de quatre métabolites différents de tryptophane produits dans la voie de kynurenine (kynurenine, 3-hydroxykynurenine, acide xanthurenic, acide 3-hydroxyanthranilic) dans le milieu recueilli des cultures de cellules cancéreuses analysées par chromatographie liquide couplée à une spectrométrie de masse quadrupole simple.

Quantification simultanée de kynurenines sélectionnées analysées par chromatographie liquide-spectrométrie de masse dans le milieu recueilli à partir des cultures de cellules cancéreuses

The kynurenine pathway and the tryptophan catabolites called kynurenines have received increased attention for their involvement in immune regulation and ...

Les kynurénines sont associées à la régulation de la réponse immunitaire dans plusieurs maladies, dont le cancer. Des méthodes fiables et validées pour identifier plusieurs kynurenines aident au développement de thérapies plus efficaces. Notre protocole utilise la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse pour identifier les différents métabolites du tryptophane générés par la voie de la kynurénine dans un milieu collecté à partir de cultures de cellules cancéreuses.Les utilisateurs inexpérimentés peuvent éprouver des difficultés lors de la préparation des échantillons ou des étapes d’acquisition et d’interprétation des données. En suivant notre protocole et nos recommandations, on peut éviter les erreurs et obtenir des données fiables. Pour préparer des solutions mères des réactifs, pesez 0,3 milligramme de chaque réactif dans un flacon avec la plus grande précision et dissolvez chaque réactif dans 300 microlitres du solvant approprié pour obtenir un gramme par litre de solutions mères de chaque réactif.Pour préparer un milieu de culture traité au charbon de bois, pesez 280 milligrammes de charbon actif dans un tube conique et ajoutez cinq millilitres du milieu liquide préparé pour la culture des cellules d’intérêt. Agitez le tube avec le fluide et le charbon de bois sur une bascule à bascule pendant deux heures à température ambiante et 50 oscillations par minute. À la fin de l’incubation, sédimentez le charbon de bois par centrifugation et récupérez soigneusement le surnageant sans perturber le charbon de bois, puis filtrez le milieu à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 micromètre.Pour préparer la solution d’étalonnage, ajoutez au milieu de culture traité au charbon de bois 0,75 microlitre de solution 3NT de 0,1 gramme par litre et ajoutez de la kynurénine 3-H, de la kynurénine 3-HAA et de l’acide xanthurénique à au moins six concentrations différentes pour couvrir toutes les plages d’étalonnage jusqu’à un volume final de 150 microlitres par échantillon. Après le vortex, ajoutez 150 microlitres de méthanol froid à moins 20 degrés Celsius complété par de l’acide formique à 1 % dans chaque tube pour la déprotéinisation de l’échantillon et fermez hermétiquement et tourbillonnez à nouveau les tubes. Après une incubation de 40 minutes à moins 20 degrés Celsius, centrifugez les échantillons et utilisez une pipette automatique pour transférer 270 microlitres de chaque surnageant dans des flacons individuels en verre à fond plat.Placez les flacons dans un évaporateur et utilisez le programme approprié pour les fractions eau-méthanol pour évaporer doucement les composants volatils pendant environ 30 minutes. Lorsque les tubes sont secs, reconstituez chaque échantillon dans 60 microlitres d’acide formique à 0,1 % dans l’eau et agitez les échantillons avant de transférer chaque solution dans des tubes individuels de 1,5 millilitre pour la centrifugation. Sans perturber les sédiments, transférez les surnageants dans des flacons chromatographiques avec des inserts en verre coniques et placez les flacons dans un échantillonneur automatique LC-MS.Avant de prélever les échantillons, purgez le système LC avec la phase mobile pour éliminer les bulles et amorcer tous les canaux de solvant. Ensuite, rincez la protection et la colonne analytique avec de l’acétonitrile à 100 % pendant environ 30 minutes avant de rincer le système avec du solvant A à 100 % jusqu’à ce qu’une pression stable soit observée dans la colonne, puis réglez les paramètres LC appropriés dans le logiciel d’acquisition de données et établissez une liste de travail pour l’analyse des échantillons sur le système LC. Pour construire la courbe d’étalonnage, dans le logiciel d’acquisition de données, ajoutez les étalons d’étalonnage dans la liste de travail et exécutez les étalons en trois exemplaires, puis intégrez et mesurez l’aire du pic correspondant à la 3-hydroxykynurénine, à la kynurénine, à l’acide 3-hydroxyanthranilique, à la 3-nitrotyrosine et à l’acide xanthurénique avec un temps de rétention d’environ 4,4, 10, 16, 21 et 30 minutes respectivement.Pour prélever des échantillons de surnageants à partir d’une culture cellulaire in vitro, après 48 heures de culture cellulaire standard des cellules d’intérêt, transférez 500 microlitres de surnageant de chaque puits dans des tubes individuels de 1,5 millilitre et retirez les débris cellulaires par centrifugation, puis transférez les surnageants moyens dans de nouveaux tubes pour un stockage à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse et maintenez les pastilles cellulaires à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’analyse d’estimation de la protéine. Pour préparer les échantillons à l’analyse LC-MS, transférez 149,25 microlitres de chaque échantillon de milieu de culture décongelé dans un nouveau tube de 1,5 microlitre et ajoutez 0,75 microlitre de solution 3NT de 0,1 gramme par litre dans chaque tube. Après avoir préparé les échantillons comme démontré, ajoutez 150 microlitres de méthanol à moins 20 degrés Celsius complété par de l’acide formique à 1 % dans chaque tube et préparez l’échantillon pour l’analyse LC-MS comme démontré.Lorsque la liste de travail est terminée, mesurez l’aire du pic de chaque analyte et utilisez une équation d’étalonnage linéaire individuelle dédiée à chaque analyte pour calculer les concentrations des analytes présents dans chaque échantillon expérimental. Pour évaluer la teneur en protéines cellulaires correspondant à l’échantillon de milieu de culture, remettre en suspension chaque pastille cellulaire dans 100 microlitres de PBS et congeler les échantillons à moins 20 degrés Celsius pendant une heure avant de les décongeler sur de la glace. Après avoir congelé les échantillons trois fois, prélevez les lysats cellulaires par centrifugation et transférez les surnageants dans de nouveaux tubes sans déranger les pastilles.Diluer l’échantillon 10 fois avec du PBS frais et ajouter les volumes appropriés de solution étalon d’albumine sérique bovine en double exemplaire dans les puits appropriés d’une plaque à 96 puits. Chargez 10 à 15 microlitres de chaque surnageant d’échantillon de lysat cellulaire dans les puits appropriés de la plaque de 96 puits et remplissez les puits standard et d’échantillon jusqu’à un volume final de 50 microlitres de PBS par puits. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’un réactif Bradford dilué cinq fois avec de l’eau ultra pure dans chaque puits et incubez la plaque pendant au moins cinq minutes à température ambiante.À la fin de l’incubation, chargez la plaque sur un lecteur de microplaques et mesurez l’absorbance à 595 nanomètres, puis construisez une courbe d’étalonnage pour permettre le calcul de la quantité de protéines dans chaque échantillon et divisez la concentration de chaque kynurénine par la teneur totale en protéines pour normaliser la quantité de kynurénine dans chaque échantillon par microgramme de protéine. Voici les résultats de la spectrométrie de masse quadripolaire unique obtenus lors de l’analyse d’un milieu contenant 4,5 grammes par litre de D-glucose et 10 % de sérum bovin fœtal. Notez le petit pic indiquant la présence de kynurénine dans l’échantillon.Analysez un échantillon de contrôle de la qualité avant d’exiger les données de l’échantillon réel pour confirmer les temps de rétention appropriés des analytes, car un décalage des signaux LC ou des incohérences peuvent être observés. Les composants de la matrice de coélution peuvent générer des ions avec le rapport de charge principal sélectionné pour les analytes cibles. Par exemple, dans cette analyse, le pic du composé inconnu est apparu dans la période de balayage au cours de laquelle l’ion du rapport de charge maître 206 a été surveillé.En raison de l’incompatibilité du temps de rétention, le signal ne correspondait pas à l’analyte. Bien que l’isotope du tryptophane partageait le même ion que le rapport de charge principal 206, l’analyse chromatographique a révélé que le signal du tryptophane était bien séparé du signal de l’acide xanthurénique, indiquant que le niveau de tryptophane présent dans le milieu cellulaire cancéreux testé n’avait pas d’impact sur la quantification de l’acide xanthurénique. Cette analyse du milieu de culture de deux types de lignées cellulaires cancéreuses démontre que les cellules épithéliales du sein humain évaluées ont libéré différentes quantités de métabolites du tryptophane, tandis que les cellules cancéreuses de l’ovaire humaines testées ont produit des niveaux significativement plus élevés de kynurénine.L’utilisation d’un étalon interne lors de la préparation de l’échantillon permet une acquisition fiable des données. La normalisation des données en fonction de la teneur en protéines corrige les variabilités du nombre de cellules au sein des puits individuels. Notre protocole peut être élargi pour déterminer des analytes supplémentaires, mais il peut s’accumuler dans le milieu de culture dans différentes conditions expérimentales.

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Cette vidéo explique une méthode de chromatographie liquide quantitative à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) pour mesurer le métabolisme de l’adénosine et des purines associées générées par la consommation d’AMP dans l’environnement extracellulaire des cellules cancéreuses leucémiques. Le protocole décrit un test RP-HPLC sensible, spécifique, fiable et reproductible, développé et validé pour la quantification des nucléotides et des nucléosides extracellulaires de la purine produits...

Métabolisme extracellulaire des purines : un test basé sur la HPLC pour mesurer la génération d’adénosine et le métabolisme dans les cellules leucémiques

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Le protocole décrit ici représente une méthode simple et reproductible qui utilise la chromatographie liquide à haute performance en phase inverse (RP-HPLC) pour mesurer le métabolisme des purines sur des cellules de leucémie lymphoïde chronique (LLC) cultivées dans différentes conditions.

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Extraction de l’échantillon et une quantification par chromatographie en phase simultanée de doxorubicine et mitomycine C après combinaison de médicaments en nanoparticules à des souris de tumeur-roulement

Altérations dans les métabolites de neuroactive kynurénine voie (KP) sont impliquées dans les troubles psychiatriques. Enquête sur les résultats fonctionnels d’une altération kynurénine voie métabolisme in vivo chez les rongeurs peut aider à expliquer des nouvelles approches thérapeutiques. Le protocole actuel combine les approches biochimiques et comportementales afin d’étudier l’impact d’un défi de kynurénine aiguë chez le rat.

Une mesure de chromatographie liquide à haute performance de kynurénine et acide kynurénique : biochimie sur la Cognition et sommeil chez le rat

Le but de cet article est de décrire un protocole pour l’extraction de métabolites aqueux de cellules adhérentes cultivées pour l’analyse métabolomique, en particulier, l’électrophorèse capillaire-spectrométrie de masse.

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Découvrez une méthode validée de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse pour quantifier les métabolites du tryptophane dans les cultures de cellules cancéreuses. Ce protocole garantit des données fiables.

Quantification simultanée de kynurenines sélectionnées analysées par chromatographie liquide-spectrométrie de masse dans le milieu recueilli à partir des cultures de cellules cancéreuses (Vidéo) | JoVE Journal

Quantification simultanée de kynurenines sélectionnées analysées par chromatographie liquide-spectrométrie de masse dans le milieu recueilli à partir des cultures de cellules cancéreuses

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