Quantification simultanée de kynurenines sélectionnées analysées par chromatographie liquide-spectrométrie de masse dans le milieu recueilli à partir des cultures de cellules cancéreuses

Les kynurénines sont associées à la régulation de la réponse immunitaire dans plusieurs maladies, dont le cancer. Des méthodes fiables et validées pour identifier plusieurs kynurenines aident au développement de thérapies plus efficaces. Notre protocole utilise la chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse pour identifier les différents métabolites du tryptophane générés par la voie de la kynurénine dans un milieu collecté à partir de cultures de cellules cancéreuses.

Les utilisateurs inexpérimentés peuvent éprouver des difficultés lors de la préparation des échantillons ou des étapes d’acquisition et d’interprétation des données. En suivant notre protocole et nos recommandations, on peut éviter les erreurs et obtenir des données fiables. Pour préparer des solutions mères des réactifs, pesez 0,3 milligramme de chaque réactif dans un flacon avec la plus grande précision et dissolvez chaque réactif dans 300 microlitres du solvant approprié pour obtenir un gramme par litre de solutions mères de chaque réactif.

Pour préparer un milieu de culture traité au charbon de bois, pesez 280 milligrammes de charbon actif dans un tube conique et ajoutez cinq millilitres du milieu liquide préparé pour la culture des cellules d’intérêt. Agitez le tube avec le fluide et le charbon de bois sur une bascule à bascule pendant deux heures à température ambiante et 50 oscillations par minute. À la fin de l’incubation, sédimentez le charbon de bois par centrifugation et récupérez soigneusement le surnageant sans perturber le charbon de bois, puis filtrez le milieu à l’aide d’un filtre à seringue de 0,45 micromètre.

Pour préparer la solution d’étalonnage, ajoutez au milieu de culture traité au charbon de bois 0,75 microlitre de solution 3NT de 0,1 gramme par litre et ajoutez de la kynurénine 3-H, de la kynurénine 3-HAA et de l’acide xanthurénique à au moins six concentrations différentes pour couvrir toutes les plages d’étalonnage jusqu’à un volume final de 150 microlitres par échantillon. Après le vortex, ajoutez 150 microlitres de méthanol froid à moins 20 degrés Celsius complété par de l’acide formique à 1 % dans chaque tube pour la déprotéinisation de l’échantillon et fermez hermétiquement et tourbillonnez à nouveau les tubes. Après une incubation de 40 minutes à moins 20 degrés Celsius, centrifugez les échantillons et utilisez une pipette automatique pour transférer 270 microlitres de chaque surnageant dans des flacons individuels en verre à fond plat.

Placez les flacons dans un évaporateur et utilisez le programme approprié pour les fractions eau-méthanol pour évaporer doucement les composants volatils pendant environ 30 minutes. Lorsque les tubes sont secs, reconstituez chaque échantillon dans 60 microlitres d’acide formique à 0,1 % dans l’eau et agitez les échantillons avant de transférer chaque solution dans des tubes individuels de 1,5 millilitre pour la centrifugation. Sans perturber les sédiments, transférez les surnageants dans des flacons chromatographiques avec des inserts en verre coniques et placez les flacons dans un échantillonneur automatique LC-MS.

Avant de prélever les échantillons, purgez le système LC avec la phase mobile pour éliminer les bulles et amorcer tous les canaux de solvant. Ensuite, rincez la protection et la colonne analytique avec de l’acétonitrile à 100 % pendant environ 30 minutes avant de rincer le système avec du solvant A à 100 % jusqu’à ce qu’une pression stable soit observée dans la colonne, puis réglez les paramètres LC appropriés dans le logiciel d’acquisition de données et établissez une liste de travail pour l’analyse des échantillons sur le système LC. Pour construire la courbe d’étalonnage, dans le logiciel d’acquisition de données, ajoutez les étalons d’étalonnage dans la liste de travail et exécutez les étalons en trois exemplaires, puis intégrez et mesurez l’aire du pic correspondant à la 3-hydroxykynurénine, à la kynurénine, à l’acide 3-hydroxyanthranilique, à la 3-nitrotyrosine et à l’acide xanthurénique avec un temps de rétention d’environ 4,4, 10, 16, 21 et 30 minutes respectivement.

Pour prélever des échantillons de surnageants à partir d’une culture cellulaire in vitro, après 48 heures de culture cellulaire standard des cellules d’intérêt, transférez 500 microlitres de surnageant de chaque puits dans des tubes individuels de 1,5 millilitre et retirez les débris cellulaires par centrifugation, puis transférez les surnageants moyens dans de nouveaux tubes pour un stockage à moins 80 degrés Celsius jusqu’à l’analyse et maintenez les pastilles cellulaires à moins 20 degrés Celsius jusqu’à l’analyse d’estimation de la protéine. Pour préparer les échantillons à l’analyse LC-MS, transférez 149,25 microlitres de chaque échantillon de milieu de culture décongelé dans un nouveau tube de 1,5 microlitre et ajoutez 0,75 microlitre de solution 3NT de 0,1 gramme par litre dans chaque tube. Après avoir préparé les échantillons comme démontré, ajoutez 150 microlitres de méthanol à moins 20 degrés Celsius complété par de l’acide formique à 1 % dans chaque tube et préparez l’échantillon pour l’analyse LC-MS comme démontré.

Lorsque la liste de travail est terminée, mesurez l’aire du pic de chaque analyte et utilisez une équation d’étalonnage linéaire individuelle dédiée à chaque analyte pour calculer les concentrations des analytes présents dans chaque échantillon expérimental. Pour évaluer la teneur en protéines cellulaires correspondant à l’échantillon de milieu de culture, remettre en suspension chaque pastille cellulaire dans 100 microlitres de PBS et congeler les échantillons à moins 20 degrés Celsius pendant une heure avant de les décongeler sur de la glace. Après avoir congelé les échantillons trois fois, prélevez les lysats cellulaires par centrifugation et transférez les surnageants dans de nouveaux tubes sans déranger les pastilles.

Diluer l’échantillon 10 fois avec du PBS frais et ajouter les volumes appropriés de solution étalon d’albumine sérique bovine en double exemplaire dans les puits appropriés d’une plaque à 96 puits. Chargez 10 à 15 microlitres de chaque surnageant d’échantillon de lysat cellulaire dans les puits appropriés de la plaque de 96 puits et remplissez les puits standard et d’échantillon jusqu’à un volume final de 50 microlitres de PBS par puits. Ensuite, ajoutez 200 microlitres d’un réactif Bradford dilué cinq fois avec de l’eau ultra pure dans chaque puits et incubez la plaque pendant au moins cinq minutes à température ambiante.

À la fin de l’incubation, chargez la plaque sur un lecteur de microplaques et mesurez l’absorbance à 595 nanomètres, puis construisez une courbe d’étalonnage pour permettre le calcul de la quantité de protéines dans chaque échantillon et divisez la concentration de chaque kynurénine par la teneur totale en protéines pour normaliser la quantité de kynurénine dans chaque échantillon par microgramme de protéine. Voici les résultats de la spectrométrie de masse quadripolaire unique obtenus lors de l’analyse d’un milieu contenant 4,5 grammes par litre de D-glucose et 10 % de sérum bovin fœtal. Notez le petit pic indiquant la présence de kynurénine dans l’échantillon.

Analysez un échantillon de contrôle de la qualité avant d’exiger les données de l’échantillon réel pour confirmer les temps de rétention appropriés des analytes, car un décalage des signaux LC ou des incohérences peuvent être observés. Les composants de la matrice de coélution peuvent générer des ions avec le rapport de charge principal sélectionné pour les analytes cibles. Par exemple, dans cette analyse, le pic du composé inconnu est apparu dans la période de balayage au cours de laquelle l’ion du rapport de charge maître 206 a été surveillé.

En raison de l’incompatibilité du temps de rétention, le signal ne correspondait pas à l’analyte. Bien que l’isotope du tryptophane partageait le même ion que le rapport de charge principal 206, l’analyse chromatographique a révélé que le signal du tryptophane était bien séparé du signal de l’acide xanthurénique, indiquant que le niveau de tryptophane présent dans le milieu cellulaire cancéreux testé n’avait pas d’impact sur la quantification de l’acide xanthurénique. Cette analyse du milieu de culture de deux types de lignées cellulaires cancéreuses démontre que les cellules épithéliales du sein humain évaluées ont libéré différentes quantités de métabolites du tryptophane, tandis que les cellules cancéreuses de l’ovaire humaines testées ont produit des niveaux significativement plus élevés de kynurénine.

L’utilisation d’un étalon interne lors de la préparation de l’échantillon permet une acquisition fiable des données. La normalisation des données en fonction de la teneur en protéines corrige les variabilités du nombre de cellules au sein des puits individuels. Notre protocole peut être élargi pour déterminer des analytes supplémentaires, mais il peut s’accumuler dans le milieu de culture dans différentes conditions expérimentales.