Modulation réversible médiée par la lumière du pathogène protéinique Kinase activé par Mitogen pendant la différenciation cellulaire et Xenopus Développement embryonnaire

L’objectif global de cette expérience est d’utiliser la lumière pour contrôler la voie de signalisation de la protéine kinase activée par les mitogènes dans des cellules intactes et dans des embryons de xénope. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés en biologie cellulaire et du développement, telles que la façon dont les modulations temporelles de l’activité kinase régulent l’autodétermination pendant la différenciation cellulaire et le développement embryonnaire. Le principal avantage de cette technique est que l’activité de la protéine kinase activée par les mitogènes peut être contrôlée de manière réversible dans les cellules intactes et dans les organismes multicellulaires, tels que les embryons en développement.

Cette méthode peut donner un aperçu de la cinétique de signalisation au cours du développement embryonnaire du xénope. Il peut également être appliqué à d’autres systèmes modèles tels que le socotra, le poisson-zèbre ou la souris. Aujourd’hui, un étudiant diplômé de mon laboratoire, Vishnu Krishnamurthy, fera une démonstration de la procédure.

Et Aurora Turgeon, une post-étoile de mon laboratoire, fera la démonstration de toutes les procédures impliquées dans les embryons de xénope. Tout d’abord, assemblez le dispositif de culture cellulaire en plaçant une chambre PDMS stérile autoclavée sur une lamelle stérile recouverte de PLL dans une boîte de Pétri de 60 mm. Ensuite, utilisez 0,5 ml de trypsine à 0,25 % pour détacher les cellules pHK21 d’un puits d’une plaque de culture tissulaire à 6 puits.

Après avoir compté la densité cellulaire à l’aide de l’hémocytomètre, ensemencez la chambre avec 20 000 cellules dans 200 microlitres de milieu de culture cellulaire. 24 heures après le placage cellulaire, transfectez les cellules avec 50 à 100 nanogrammes de plasmide CRY2-mCherry-Raf1 2A2CIBMG de plasmide PCaA X selon le protocole du fabricant. Trois heures après la transfection, changez le milieu à 200 microlitres de milieu de culture frais et laissez les cellules se rétablir pendant la nuit En incubant la culture dans un incubateur à 37 degrés Celsius et cinq pour cent de dioxyde de carbone.

Le lendemain, commencez l’induction optogénétique et l’imagerie en remplaçant d’abord le milieu de culture cellulaire par 200 microlitres de milieu indépendant du dioxyde de carbone. Configurez ensuite le protocole d’acquisition de données. Sélectionnez le canal FITC d’excitation de 488 nanomètres pour la stimulation optogénétique, et le canal CRITC d’excitation de 561 nanomètres pour suivre la localisation cellulaire de la protéine marquée mCherry.

Mesurez la puissance de la lumière bleue en plaçant un wattmètre près de la fenêtre de l’objectif. Une puissance totale de deux microwatts est suffisante pour induire l’association CIBN CRY2-PHR. Configurez une acquisition d’horodatage avec l’intervalle de cinq secondes.

Et le temps total d’acquisition de deux minutes. Appliquez un matériau d’indexation approprié sur la fenêtre d’objectif. Placez la chambre cellulaire sur la platine du microscope et utilisez le mode de champ clair pour faire la mise au point sur les cellules sur la surface de la lamelle à l’aide des oculaires.

Ensuite, déplacez la platine du microscope pour localiser une cellule transfectée sous la lumière verte. Enregistrez une série d’images horodatées dans les canaux FITC et CITC. L’image de base de l’échantillon montre CIBNGPCAAX localisé sur la membrane plasmique.

Il s’agit d’un instantané de CRY2 mCherry raf1 avant la simulation de lumière bleue, tandis que cette image montre un instantané de CRY2 mCherry raf one après dix impulsions de stimulation par la lumière bleue. Réalisez le réseau de LED en insérant des LED bleues tonales dans deux planches à pain et en les connectant avec des résistances de limitation de courant. Placez les planches à pain dans une boîte en aluminium.

Insérez deux fils métalliques pour connecter les cartes à l’alimentation électrique. Assurez-vous que la longueur du fil est suffisante lorsque la boîte à lumière est placée à l’intérieur d’un incubateur à dioxyde de carbone. Placez ensuite un diffuseur de lumière transparent pour faire office de couvercle de la boîte à lumière.

Enfin, calibrez la puissance de sortie de chaque LED à une plage d’entrées de tension. Utilisez une puissance de zéro virgule deux milliwatts par centimètre carré pour le test de différenciation cellulaire PC12 de 24 heures. Placez le réseau de LED dans un incubateur à 37 degrés Celsius complété par cinq pour cent de dioxyde de carbone.

Connectez-le à l’alimentation électrique à l’aide des fils métalliques et réglez la puissance de la LED sur zéro point deux milliwatts par centimètre carré. Placez la plaque à 12 puits contenant les cellules PC12 transfectées sur la fenêtre du réseau de LED. Alignez la plaque de manière à ce que chaque puits soit entièrement éclairé.

Appliquez un éclairage continu pendant 24 heures. Pour imager les cellules différenciées, configurez l’acquisition de données d’instantané unique. Utilisez 200 millisecondes pour les canaux GFP et TexasRed.

Capturez des images des cellules transfectées dans les canaux GFP et TexasRed, et enregistrez les fichiers pour l’analyse des données. Commencez cette procédure en fabriquant des aiguilles pour la micro-injection d’ARN en tirant des capillaires en verre avec un extracteur capillaire. Retirez l’enveloppe gélatineuse des embryons en les traitant avec trois pour cent de cystéine diluée dans 0,2 XMMR pendant 15 minutes.

Transférez les embryons à trois pour cent de polysaccharose et à zéro virgule cinq solution XMMR pour la microinjection. Injectez avec précision 500 picogrammes à un nanogramme d’ARN CRY2-mCherry-Raf1-2A-2CIBN-GFP-CaaX dans chaque embryon. Ensuite, cultivez les embryons micro-injectés dans la solution de micro-injection à température ambiante.

Lorsque les embryons atteignent le stade de gastrula médicale, transférez-les dans une solution 0,2x MMR et continuez la culture jusqu’au stade de développement souhaité. Placez ensuite la plaque à 12 puits sur le réseau de LED construit à la maison pour le traitement de la lumière bleue. Placez un miroir sur la plaque à 12 puits pour assurer un éclairage complet de la lumière bleue des embryons.

Prélever les embryons pour une analyse histologique, western blot ou d’expression génique après une exposition à la lumière bleue pendant la durée souhaitée. Cette image montre des instantanés multicanaux de cellules PC12 transférées avec CRY2-2A-2CIBN après 24 heures de stimulation par la lumière bleue à zéro point deux milliwatts par centimètre carré. Les reporters GFP et mCherry sont visibles.

Les cercles marquent les cellules différenciées et les carrés marquent les cellules indifférenciées. Ici, les cellules ont été traitées de la même manière que celles de l’image précédente, sauf qu’aucune stimulation par la lumière bleue n’a été utilisée. Aucune différenciation n’est observée.

Ces cellules montrent des résultats représentatifs après transfection avec raf1 GFPCaaX, un raf1 constitutivement actif. Les cercles et les rectangles marquent respectivement les cellules différenciées et indifférenciées. Cet histogramme montre les taux de différenciation des cellules PC12 transfectées avec CA-Raf1, co-transfectées avec CRY2 mCherry raf1 et CIBN GFP Caax et transfectées individuellement avec CRY2A 2CIBN.

Seules les cellules exposées à la lumière bleue ont montré une différenciation significative. Cette image montre la morphologie d’embryons normaux de Xénope sans injection d’ARNm, et sans traitements par la lumière. Cette image montre des embryons injectés avec l’ARNm CRY2 2A2CIBN et soumis à une stimulation par la lumière bleue.

L’activation de raf1 par le traitement des embryons injectés de CRY2 2A2CIBN avec de la lumière bleue induit des structures ectopiques ressemblant à des queues dans la région de la tête. À la suite de cette procédure, on peut répondre à des questions supplémentaires, telles que la façon dont l’activation spécifique du stade de la voie de la protéine kinase activée par le mitogène régule l’expression des gènes. Cette méthode optogénétique peut être généralisée pour contrôler d’autres voies de signalisation avec des mécanismes d’activation similaires.