Cytométrie de flux d'imagerie microfluidique par détection asymétrique Microscopie optique à temps-étirement (ATOM)

L’objectif général de ce protocole est de préparer et d’utiliser un système de microscopie optique à détection asymétrique pour l’imagerie unicellulaire sans marquage et à contraste élevé dans un flux microfluidique ultra-rapide. Le principal avantage d’ATOM est qu’il permet une capture d’image ultra-rapide avec des taux de balayage linéaire allant jusqu’à des dizaines de mégahertz tout en améliorant le contraste de l’image sur les cellules non étiquetées. ATOM permet une analyse morphologique complexe des structures cellulaires et subcellulaires avec des tests cellulaires décentrés allant jusqu’à 100 000 cellules par seconde, ce qui n’est pas possible avec la cytométrie en flux standard.

Pour commencer à configurer le système, utilisez un collimateur à fibre pour coupler un laser pulsé à large bande femto ou pico seconde proche de l’IR à une fibre optique dispersive monomode connectée à un amplificateur optique. Illuminez un étalonnage de diffraction de transmission avec le laser pour produire une douche spectrale. Orientez le nivellement près de la configuration de Littrow pour maximiser l’efficacité de la diffraction.

Configurez un ensemble d’objectif relais télescopique dans un système d’imagerie 4f pour diriger la douche spectrale sur le plan focal arrière d’une lentille d’objectif sous une plate-forme d’échantillonnage. Assurez-vous que la douche spectrale remplit l’ouverture arrière de l’objectif. Placez un autre objectif avec un miroir plan à son ouverture arrière au-dessus de la plate-forme d’échantillonnage.

Ajustez les objectifs jusqu’à ce que leurs plans focaux se chevauchent. Vérifiez que la double douche spectrale passe par le plan de l’image et suit le même chemin jusqu’à l’étalonnage. Placez une puce microfluidique sur la plate-forme d’échantillonnage et assurez-vous que la pluie spectrale tombe sur le canal microfluidique.

Redirigez la lumière renvoyée à l’aide d’un séparateur de faisceau une fois qu’elle a passé le talus. Séparez la lumière renvoyée en deux faisceaux à l’aide d’un autre séparateur de faisceau. Utilisez des collimateurs à fibres pour coupler les faisceaux à des fibres monomodes de différentes longueurs afin d’introduire un délai entre les faisceaux.

Connectez les fibres à un oscilloscope en temps réel via un coupleur de fibre et un photodétecteur. Réglez le gain de l’amplificateur optique jusqu’à ce que le rapport signal/bruit du signal optique soit supérieur à 10 décibels. Bloquez ensuite environ la moitié de chaque faisceau renvoyé avec des blocs de faisceau en forme de couteau.

Ajustez les blocs de faisceau jusqu’à ce que la puissance optique mesurée dans chaque fibre soit d’environ la moitié de la puissance avant le bloc. Vérifiez que la bande passante de l’oscilloscope et le taux d’échantillonnage sont suffisamment élevés pour ne pas influencer la résolution de l’image. Pour commencer l’expérience, diluez des échantillons de cellules à une concentration comprise entre 10 et 10 et 6 cellules par millilitre avec de l’eau saline ou de source tamponnée au phosphate.

Chargez ensuite la solution cellulaire dans une seringue de 10 millilitres. Connectez la seringue à l’entrée du canal microfluidique. Dirigez la sortie du canal microfluidique vers un tube à centrifuger.

Fixez la seringue dans un pousse-seringue et réglez le débit en fonction de la largeur du canal. Choisissez le nombre de points de données à enregistrer pour l’expérience. Ensuite, acquérez et enregistrez les données du signal optique.

Numérisez et exportez les données de l’oscilloscope vers un ordinateur. Transformez les données en images 2D et extrayez une bibliothèque de paramètres à partir des images. Importez les images de la bibliothèque de paramètres dans un programme de visualisation.

Attribuez un paramètre d’intérêt à chaque axe et sélectionnez l’ensemble de données à afficher sous forme de nuage de points. Vérifiez les images de cellules associées à chaque groupe dans le graphique pour identifier les tendances. Utilisez le contrôle manuel ou affichez des ensembles de données supplémentaires pour une analyse plus approfondie si nécessaire.

ATOM a été utilisé pour acquérir des images unicellulaires à contraste élevé de cellules humaines et de phytoplancton. Des structures cellulaires caractéristiques telles que des vacuoles, des pyrénoïdes et des flagelles sont visibles sur les images du phytoplancton. Des paramètres tels que la taille et la circularité des cellules ont été déterminés à partir des images ATOM afin de classer les cellules pour l’analyse cytométrique.

Les résultats de la classification peuvent être affichés sous forme de nuages de points 2D. Ici, le volume en fonction de la circularité a été tracé pour un MCF7 en jaune et un PBMC en rouge. Deux grappes ont été observées pour MCF7.

En identifiant les images à contraste élevé correspondant à des points de données individuels, on a constaté que le groupe inférieur correspondait à des fragments de cellules et à des débris. Une fois maîtrisé, le système d’imagerie peut être mis en place en deux à trois heures s’il est correctement réalisé. Les procédures d’imagerie peuvent être effectuées en une heure.

N’oubliez pas de porter une attention particulière à la sécurité des yeux lorsque vous travaillez avec la source laser et l’alignement du faisceau laser. Des précautions telles que le port de lunettes de sécurité doivent toujours être prises lors de l’exécution de ces procédures. Lorsque vous tentez cette procédure, n’oubliez pas de surveiller l’alignement du faisceau optique tout au long du processus de configuration du système d’imagerie pour garantir une qualité d’image optimale.

Bien que cette technique puisse donner un aperçu de la détection et de la quantification de cellules rares ou apparentes au cours du processus pathologique, elle peut également être appliquée à la classification des types de cellules, au sein de populations cellulaires vastes et hétérogènes. Cette technique est particulièrement avantageuse lorsque l’on cherche à surmonter la limitation de débit de la cytométrie d’imagerie, tout en préservant la qualité de l’image. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’implémenter ATOM, de la configuration du système aux procédures d’imagerie.