Discrimination et caractérisation des populations hétéro-cellulaires à l'aide de techniques d'imagerie quantitative

L’objectif général de cette méthodologie est d’évaluer quantitativement les réponses phénotypiques dynamiques des populations hétérocellulaires aux pertubations tout en discriminant entre les sous-populations. La plupart des interactions physiologiques se produisent en présence de plusieurs types de cellules. Cette méthode peut aider les biologistes cellulaires à évaluer comment des cellules hétérogènes réagissent à des pressions environnementales identiques et comment différentes s’influencent mutuellement.

Cette technique présente plusieurs avantages, elle permet de distinguer plusieurs types de cellules, elle permet d’analyser simultanément des sous-populations incluant les taux de natalité et de mortalité et la dynamique morphologique. Bien que ce protocole puisse être utilisé pour étudier de nombreux processus biologiques, nous démontrerons le flux de travail en utilisant des cellules tumorales H3255 et des cellules fibroblastiques CCD19LU traitées avec de l’erlotinib, un médicament chimiothérapeutique. Pour commencer, après avoir préparé les suspensions cellulaires dans des tubes selon le protocole textuel, inversez les tubes pour mélanger les cellules en solution afin de standardiser l’ensemencement.

Ensuite, pipetez 10 microlitres de chaque suspension cellulaire dans un microtube à centrifuger et ajoutez 10 microlitres de bleu trypan. Pipetez 10 microlitres de la solution dans une lame de comptage de cellules et insérez la lame dans un compteur de cellules automatisé. Répétez le comptage cellulaire au moins trois fois, ou jusqu’à ce que les comptages obtenus soient cohérents.

À l’aide d’une pipette multicanaux, ensemencez un total de 1 500 cellules dans 100 microlitres de RPMI dans les puits d’une plaque de 96 puits. Plaquez chaque suspension cellulaire en trois exemplaires avec des configurations de plaques identiques pour chaque point temporel. Incuber les cellules pendant la nuit.

Ajouter du DMSO à la poudre d’erlotinib pour obtenir une solution mère d’erlotinib de 10 millimolaires. Ensuite, utilisez un milieu de culture cellulaire pour diluer le médicament à deux fois la concentration finale la plus élevée de 10 micromolaires. Diluer le médicament en série quatre fois dans un rapport de 1:10, pour un total de cinq concentrations de médicament et un contrôle sans médicament.

Pipeter 100 microlitres de solution médicamenteuse dans les puits appropriés de la plaque de cellules à 96 puits pour une concentration finale de médicament de 1x dilué dans le milieu. Ensuite, pour colorer les cellules pour la classification basée sur la fluorescence, préparez cinq microgrammes par millilitre de coloration nucléaire et cinq micromolaires de coloration des cellules mortes dans du PBS. Pour une classification basée sur la morphologie, préparez cinq microgrammes par millilitre de coloration nucléaire, cinq micromolaires de coloration des cellules mortes et cinq micromolaires de coloration dans le PBS.

Ajoutez 20 microlitres de solution de colorant dans chaque puits. Ensuite, incubez les échantillons à 37 degrés Celsius à l’abri de la lumière pendant 30 minutes. Pour acquérir des images, utilisez de l’éthanol à 70 % pour essuyer le bas de la plaque et placez la plaque dans la chambre d’imagerie.

Dans l’onglet de configuration, sous la sélection des canaux, cliquez sur le bouton plus pour ajouter les canaux appropriés à l’image. Sous la sélection de la mise en page, définissez une pile z d’images de test tous les deux microns, commençant à zéro micron et se terminant à 20 microns, pour identifier le plan de mise au point. Cliquez sur l’instantané, sous chaque canal pour évaluer les intensités et optimiser les temps d’exposition.

Entrez des valeurs supérieures ou inférieures au fil du temps, selon les besoins. Les noyaux des cellules doivent être mis au point afin d’assurer la précision de l’analyse en aval. Sur le schéma de la plaque, mettez en évidence les puits appropriés.

Ensuite, dans le schéma des puits, mettez en évidence les 25 champs à imager de la même manière. Sous Exécuter l’expérience, identifiez la plaque dans le nom de la plaque, puis cliquez sur le bouton de démarrage pour exécuter le protocole d’acquisition d’images avec un objectif 10x pour générer des images TIFF en niveaux de gris dans les canaux choisis. Après avoir installé les logiciels open source, CellProfiler et CellProfiler analysis, ouvrez CellProfiler, cliquez sur Fichier, Importer, Pipeline à partir du fichier et sélectionnez le fichier approprié.

Sélectionnez le pipeline de classification basé sur la fluorescence pour classer les cellules en H3255 ou CCD19LU en fonction de l’intensité de l’EGFP et pour calculer les caractéristiques morphologiques. Cliquez sur Afficher les paramètres de sortie, puis sélectionnez l’emplacement des fichiers image à analyser et la destination des données extraites. Avant d’exécuter l’analyse, le protocole doit être testé en mode test pour vérifier les valeurs des paramètres.

Il est important que les segmentations nucléaire et cellulaire soient précises. Ce protocole a été conçu pour identifier les cellules avec des noyaux de coloration variable, s’assurer que la valeur de pixel par laquelle les noyaux sont élargis est suffisamment grande pour masquer les noyaux avec la coloration d’ADN la plus élevée, mais suffisamment petite pour ne pas masquer les noyaux environnants. Pour classer les populations en fonction de la fluorescence, il faut d’abord redimensionner la plage d’intensité de la GFP, puis mesurer l’intensité de la GFP de chaque noyau identifié et classer les objets en fonction d’un seuil défini par l’utilisateur.

Ensuite, cliquez sur Analyser les images pour commencer l’analyse. Une fois l’analyse terminée, accédez au dossier de sortie par défaut pour afficher les données calculées. Pour une classification basée sur la morphologie, exécutez le protocole approprié dans le profileur de cellules pour générer des caractéristiques de morphologie de cellules entières.

Ouvrez le logiciel d’analyse Cell Profiler, sélectionnez le fichier de propriétés de la base de données généré dans Cell Profiler et cliquez sur pour l’ouvrir. Cliquez sur l’onglet Classifieur en haut à gauche de l’écran. Pour appeler des images de cellules aléatoires de l’expérience, cliquez sur récupérer, les images apparaîtront dans la fenêtre non classifiée.

Classez manuellement les cellules comme positives ou négatives, ce qui représente ici H3255 ou CCD19LU en sélectionnant et en faisant glisser les cellules vers le bac approprié. Après avoir classifié au moins 50 cellules par sous-population, cliquez sur Entraîner le classificateur, puis sur Vérifier la progression. Enfin, cliquez sur Noter tout pour générer un tableau avec le nombre de cellules pour chaque sous-population.

Dans une culture froide hétérocellulaire de cellules tumorales H3255 et de fibroblastes CCD19LU, les noyaux ont été identifiés et segmentés en fonction de la coloration de l’ADN. Les populations cellulaires ont été classifiées soit par fluorescence induite artificiellement, soit par entraînement dans un algorithme d’apprentissage automatique pour identifier les types de cellules en fonction des différences morphologiques. Il existe une grande concordance entre les méthodologies basées sur la fluorescence et la morphologie.

Les deux méthodes de classification ont été impliquées indépendamment pour les mêmes images et concordaient à 97,4 % et 92,5 % sur les populations non traitées et traitées respectivement. Ici, les changements dans la morphologie cellulaire et la réponse au traitement par Erlotinib ont été étudiés. Après trois jours de traitement médicamenteux, une diminution de la surface des noyaux et une augmentation de la surface cellulaire ont été observées à partir des cellules H3255.

Cela était peut-être dû à la mort cellulaire. Pour vérifier si l’erlotinib avait un effet cytotoxique ou cytostatique sur les cellules, des cellules mortes ont été identifiées sur la base de la coloration à l’iodure de propidium. Des effets cytotoxiques et cytostatiques de l’erlotinib sur les cellules H3255 ont été observés, avec une augmentation du nombre de décès et une diminution du nombre de naissances après un traitement médicamenteux.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures non consécutives si elle est bien exécutée. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’interférence RA ou CRISPR peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires sur la génomique fonctionnelle. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie du cancer pour explorer l’influence des cellules stromales sur la progression tumorale dans plusieurs types de cancer.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’étudier les réponses hétérocellulaires aux stimuli environnementaux, en particulier comment analyser les données d’imagerie basées sur la microscopie à haut débit.