Modélisation de la mort neuronale et la dégénérescence de neurones granules primaires de cervelet de souris

Ce protocole décrit une méthode simple pour isoler et cultiver les neurones de granule cérébral de souris primaire (SCT) de petits 6-7 jours vieux, transduction efficace du SCT pour la perte et gain d’études de fonction et modélisation excitotoxicité neuronale induite par le NMDA, la mort cellulaire induite par la basse-potassium, lésions de l’ADN et le stress oxydatif en utilisant le même modèle de culture.

L’objectif global de cette procédure est de produire des populations saines et pures de neurones granulaires cérébelleux et de les manipuler génétiquement et de modéliser différents mécanismes de lésions neuronales dans la culture primaire in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des lésions neuronales. Nous utilisons ce protocole pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents des lésions neuronales suite à des lésions cérébrales aiguës et à des maladies neuro-génératives.

Le principal avantage de ce protocole est que nous pouvons modéliser différents mécanismes de mort cellulaire tels que l’excitotoxicité, le stress oxydatif, les dommages à l’ADN et les événements de développement en utilisant le système de culture. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les lésions neuronales, elle peut également être utilisée avec les neurones cérébelleux du rat pour étudier l’activité neuronale et la morphogenèse en réponse aux facteurs de croissance et aux événements secondaires. Pour extraire le cerveau d’une souris âgée de six à sept jours, utilisez une paire de pinces pour saisir une tête et, à l’aide de ciseaux de micro-dissection, coupez la peau vers l’avant vers la tête.

Repoussez la peau pour révéler le crâne. Ensuite, pénétrez le crâne avec la pointe des ciseaux et coupez vers l’avant et les côtés. En prenant soin de ne pas endommager le cervelet, et de faciliter l’identification et l’ablation des méninges, puis utilisez des pinces pour décoller le crâne exposant le cerveau.

À l’aide d’une pince ou d’une spatule, faites doucement sortir le cerveau dans une solution de dissection froide. Pour isoler le cervelet, placez le cerveau dans la solution de dissection complétée par du sulfate de magnésium et maintenez la solution et le cerveau sur de la glace. Sous le microscope de dissection, retirez les méninges à l’aide d’une pince fine, puis disséquez le cervelet du cerveau dans une solution de dissection supplémentée en sulfate de magnésium.

Cela aide à décoller les méninges restantes et permet d’aller entre les couches pour nettoyer les plis cérébelleux. La présence de méninges est une culture neuronale qui entraîne des cellules malsaines et éventuellement la mort cellulaire. En tant que tel, il est important d’assurer l’élimination complète des méninges avant de procéder à la culture.

Après cela, tournez le cervelet vers sa face ventrale et assurez l’ablation du plexus choroïde. Ensuite, tirez le cervelet dans une boîte de 35 millimètres contenant un millilitre de solution de dissection supplémentée en sulfate de magnésium. Coupez les tissus en petits morceaux et transférez-les dans un tube de 50 millilitres contenant 30 millilitres de solution de dissection tamponnée au sulfate de magnésium.

Dans cette étape, centrifugez le tube de 15 millilitres contenant le tissu cérébral haché pendant cinq minutes à 644 fois g et quatre degrés Celsius. Après cela, retirez le surnageant et ajoutez 10 millilitres de solution de dissection de trypsine. Secouez ensuite la table à grande vitesse pendant 15 minutes à 37 degrés Celsius.

Ajoutez deux millilitres de solution d’inhibiteur de trypsine dans le tube et balancez-vous doucement pendant deux minutes. Ensuite, centrifugez le tube pendant cinq minutes à 644 fois g et quatre degrés Celsius. Après cinq minutes, retirez le surnageant et ajoutez deux millilitres de la solution deux des inhibiteurs de la trypsine avant de la transférer dans un tube de 15 millilitres.

Ensuite, triturez le tissu dans le tube de 15 millilitres jusqu’à ce que la solution devienne trouble. Laissez reposer pendant cinq minutes. Retirez ensuite le surnageant transparent et transférez-le dans un nouveau tube contenant un millilitre de solution de dissection supplémentée en chlorure de calcium.

Ajoutez deux autres millilitres de solution d’inhibiteur de trypsine au fond du tube contenant la pastille. Triturez-le à nouveau et laissez-le reposer pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et ajoutez-le dans le tube contenant le surnageant de l’étape précédente.

Répétez ce processus jusqu’à ce que la majeure partie du tissu soit dissociée mécaniquement. Ajouter 0,3 millilitre de solution de dissection supplémentée en chlorure de calcium à la collection de surnageant pour chaque millilitre de surnageant. Mélangez le contenu du tube puis centrifugez-le pendant cinq minutes à 644 fois G à température ambiante.

Ensuite, retirez le surnageant. Ajouter 10 millilitres de milieu frais à la pastille et mélanger. Comptez ensuite les cellules vivantes et diluez-les à une concentration de 1,5 fois 10 à six cellules par millilitre.

Plaquez les cellules sur les plaques de poly D-lysine préalablement préparées. Pour les plaques à quatre puits, plaquez 0,5 millimètres de l’échantillon, ce qui donne 7,5 fois 10 à la cinquième cellule par puits. Pour les paraboles de 35 millimètres, plaquez quatre millilitres de l’échantillon, ce qui donne six fois 10 à la sixième cellule par plaque.

Pour les lamelles, plaquez 0,5 millilitres donnant 7,5 fois 10 aux cinquièmes cellules par puits. Après 24 heures, ajoutez AraC aux plaques pour réduire la contamination gliale. Si les cellules doivent être maintenues pendant sept à huit jours, répétez ce traitement le troisième jour et maintenez les cultures dans un incubateur à 5 % de CO2 à 37 degrés Celsius.

Pour les cultures maintenues plus de cinq jours, nourrissez la culture avec du glucose tous les deux jours à partir du cinquième jour. Pour induire une excitotoxicité neuronale avec le NMDA, après sept jours in vitro, traitez les neurones granulaires cérébelleux avec 100 micromolaires de NMDA et 10 micromolaires de glycine pendant une heure. Ensuite, remplacez le milieu par un milieu conditionné à partir des cultures parallèles sans traitement.

Cette concentration entraîne la mort cellulaire de 50 % 24 heures après le traitement. Pour la mort cellulaire induite par les ROS, traitez les neurones avec du peroxyde d’hydrogène à 75 à 100 micromolaires pendant cinq minutes. Après cinq minutes, passez au milieu conditionné à partir de cultures parallèles.

En raison de l’instabilité du peroxyde d’hydrogène, la concentration doit être optimisée à un niveau qui induit entre 50 et 70 % de mort cellulaire après 24 heures. Cette concentration se situe généralement entre 75 et 100 micromolaires. Pour induire la mort cellulaire par des dommages à l’ADN, traitez les neurones granulaires cérébelleux avec 10 micromolaires de camptothécine pour induire plus de 50 % de la mort cellulaire dans les 24 heures.

Pour l’apoptose neuronale induite par un faible taux de potassium dans les neurones granulaires cérébelleux, changez le milieu contenant 25 millimolaires de potassium en milieu pauvre en potassium avec cinq millimolaires de potassium après sept jours in vitro. Les neurones ont été transduits avec le lentivirus pour la RFP à un moment de moi de trois au moment de l’ensemencement. Fixé et coloré à sept jours in vitro.

Il a été démontré que la co-localisation du signal RFP MAP2 et de Hoechst met en évidence des neurones sains qui sont entièrement transduits par les lentivirus. Les images présentées ici représentent des analyses de neurones infectés par différents MOI d’adénovirus pour mesurer la toxicité. Les neurones granulaires cérébelleux infectés par l’adénovirus exprimant LacZ à un moment d’inertie compris entre 25 et 50 permettent une efficacité maximale tout en maintenant une toxicité minimale.

Une différence de moins de 1 % dans la survie cellulaire par rapport au groupe témoin est observée lors de l’infection à ce MOI. Ces figures montrent la coloration de Hoechst des neurones granulaires cérébelleux de contrôle et des neurones granulaires cérébelleux traités avec NMDA pour induire la mort cellulaire. Notez la formation de noyaux pycnotiques avec le traitement NMDA.

Il s’agit d’une indication de mort cellulaire et peut être observée dans environ 50 % de la culture 24 heures après le traitement avec 100 micromolaires de NMDA et 10 micromolaires de glycine. Une fois maîtrisée, cette technique peut être exécutée en deux heures et demie avec six coups de souris, si elle est correctement exécutée. Lors de l’exécution de cette technique, il est important d’utiliser une technique aseptique et des instruments chirurgicaux enchaînés au besoin afin de minimiser le risque de contamination de la culture.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour étudier le développement neuronal et les lésions neuronales dans les neurones primaires de souris. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être capable de cultiver des neurones granulaires cérébelleux, de les manipuler génétiquement à l’aide de virus et d’induire divers mécanismes de lésions neuronales. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que l’immunofluorescence ou les tests de viabilité cellulaire peuvent être effectuées pour répondre à des questions telles que l’amélioration de la survie cellulaire en réponse à l’excitotoxicité, au stress oxydatif ou aux dommages à l’ADN.