Name: Modélisation de la mort neuronale et la dégénérescence de neurones granules primaires de cervelet de souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-06T16:30:00.000+00:00
Duration: 10 min 36 s
Description: Découvrez la modélisation de la mort neuronale et la dégénérescence des neurones granules cérébelleux de souris. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes d'excitotoxicité, de stress oxydatif et de dommages à l'ADN.

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Ce travail est soutenu par les Sciences naturelles et en génie conseil de recherches du Canada et les instituts de recherche en santé du Canada accorde à A.J..-a.

ce protocole est basé sur les modifications des procédures qui ont été décrits précédemment 18 , 24 , 25 , 26 , 27. le présent protocole est approuvé par le Comité de protection de l’Animal à l’Université McGill.
 1. préparation expérimentale Remarque : les solutions courantes suivantes peuvent être préparées et maintenues jusqu'à l’utilisation.
<ol><li>Solution de dissection <ol><li>dissoudre 3,62 g de chlorure de sodium (NaCl), 0,2 g de chlorure de potassium (KCl), 0,069 g de phosphate de sodium (NaH 2 PO 4 &#8729; H 2 O) et 1,306 g de D-(+)-Glucose dans 500 mL de distillée H 2 O. Puis ajoutez 12,5 mL de tampon HEPES, 450 µL de solution de rouge de phénol et 20 mL de sab fraction V à la solution. Ajuster le pH 7,4 en utilisant 1 N d’hydroxyde de sodium (NaOH).</li>
		<li>Stériliser avec 0,22 µm filtre et conserver à 4 ° C. Cette solution reste stable pendant une semaine à 10 jours.</li>
	</ol></li> <li>La trypsine <ol><li>préparer une solution à une concentration de 25 g/L de la trypsine dans le chlorure de sodium 0,9 %. Conserver la solution à -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Inhibiteur de la trypsine <ol><li>préparer un stock avec une concentration de 10 mg/mL dissoudre 1 g de l’inhibiteur de la trypsine de blanc d’oeuf de poulet dans 100 mL d’HCl. magasin de 1 mM, cette solution à -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>DNase <ol><li>dissoudre 100 mg de DNase 1 dans 10 mL d’eau stérile pour générer un stock de 10 mg/mL. Conserver la solution à -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>MgSO 4 <ol><li>Ajouter 6,02 g de sulfate de magnésium (MgSO 4) dans 50 mL d’eau distillée (H 2 O) pour générer un stock de 1 M. Conserver la solution à 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>CaCl 2 <ol><li>dissoudre 0,735 g de chlorure de calcium (CaCl 2 &#8729; 2 H 2 O) dans 50 mL de distillée H 2 O à une concentration de stock de 100 mM. Conserver la solution à 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>KCl <ol><li>dissoudre 3.7275 g de KCl dans 50 mL d’eau distillée H 2 O à une concentration de stock de la solution de boutique de 1 M. à 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>D-(+)-Glucose <ol><li>dissoudre 1,802 g de D-(+)-glucose dans 50 mL d’eau distillée H 2 O à une concentration de stock de 100 mM. Conserver la solution à 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Milieux de Culture cellulaire <ol><li>préparer des milieux de culture cellulaire comme suit : 5 mL de chaleur inactivé dialysée sérum de veau fœtal, ajouter 500 µL de 200 mM de L-Glutamine, 100 µL de 50 mg/mL de gentamycine et 1 mL de KCL à 1,0 M à 45 mL du filtre stérilisé Eagle &#39; minimal médias essentiel s (E-MEM) qui est additionné de 1,125 g/L de D-Glucose pour produire 50 mL de milieux de culture pour le neurone granule cérébelleux. Entreposer le milieu à 4 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Furanoside bêta-D-Arabino cytosine <ol><li>dissoudre 48 mg de furanoside bêta-D-arabino cytosine dans 10 mL de milieu de culture à une concentration de stock de 20 mM. Stocker la solution à -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Poly-D-Lysine <ol><li>pour générer un poly de 2 mg/mL stock D-lysine, ajouter 10 mL de stérile H 2 O à 20 mg de poly D-lysine. Poly stock D-lysine doit être conservé à-80 ° C dans 100 µL d’extraits.</li>
	</ol></li> <li>Remarque : les solutions suivantes doivent être préparées avant la dissection et maintenues à 4 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
	<li>MgSO 4 complété Dissection Solution <ol><li>Ajouter 300 µL de stock MgSO 4 à 250 mL de solution de dissection.</li>
	</ol></li> <li>Solution de trypsine Dissection <ol><li>Ajouter 100 µL de trypsine stock et 12 µL de stock MgSO 4 à 10 mL de solution de dissection.</li>
	</ol></li> <li>Inhibiteur de trypsine Solution 1 <ol><li>164 ajouter µL d’inhibiteur de la trypsine stock, 250 µL de stock DNase 1 et 12 µL de stock MgSO 4 à 10 mL de solution de dissection.</li>
	</ol></li> <li>Inhibiteur de trypsine Solution 2 <ol><li>Ajouter 1040 µL d’inhibiteur de la trypsine stock, 750 µL de stock DNase 1 et 12 µL de stock MgSO4 à 10 mL de solution de dissection.</li>
	</ol></li> <li>CaCl 2 complété solution dissection <ol><li>Ajouter 10 µL de stock CaCl 2 et 25 µL de stock MgSO 4 à 10 mL de solution de dissection.</li>
	</ol></li> <li>Poly D-Lysine enduite Pétri <ol><li>pour enrober Pétri, diluer 100 µL de poly stock D-lysine dans 40 mL de stérile H 2 O. Pour les récipients de culture Nunc 35 mm, ajouter 2 mL de poly dilué solution D-Lysine. Pour 4 assiettes bien, ajouter 300 µL de poly dilué D-Lysine dans chaque cupule.</li>
		<li>Laissez la poly D-lysine se reposer pendant 1 h avant d’aspirer et laver chacun bien avec 4 mL ou 600 µL (pour 35 mm culture plats ou 4 assiettes bien, respectivement) de stérile H 2 O. Puis aspirer l’H 2 O et laissez la vaisselle l’air sec pendant 1 h.</li>
	</ol></li></ol> 2. Extraction et Isolation de cervelet de cerveau <ol><li>Decapitate par jour 6-7 vieux chiot de souris à l’aide de ciseaux de décapitation. Effectuer la dissection du cerveau dans une hotte stérile vitroplants.</li>
	<li>Pour retirer le cerveau, saisissez la tête à l’aide d’une paire de pinces et couper à travers la peau vers la partie antérieure de la tête à l’aide de ciseaux de microdissection comme illustré à la Figure 1. Ensuite, couper à travers l’os du crâne à l’aide d’une nouvelle paire de ciseaux pour minimiser les risques de contamination. Supprimer le crâne couvrant le cerveau à l’aide de pinces et de cerner le cerveau à l’aide de pinces ou une spatule.
	<ol><li>Au besoin, couper à travers le nerf optique pour faciliter le sortir du cerveau dans son ensemble.</li>
	</ol></li> <li>Placer le cerveau dans la solution de dissection qui est additionnée de MgSO 4. Garder la solution et le cerveau sur glace</li>
	<li>Qui suit enlèvement, sous un microscope à dissection du cerveau, disséquer sur le cervelet du cerveau tout en restant dans la solution de dissection MgSO 4 complété et supprimer les méninges à l’aide de pinces fines. Tourner le cervelet à sa face ventrale et assurer le retrait du plexus choroïde.</li>
	<li>Centraliser le sembable dans un plat de 35 mm ~ 1 ml de solution de dissection MgSO 4 complété.</li>
	<li>Couper le tissu en petits morceaux et transvaser dans un tube de 50 mL contenant 30 mL de solution de dissection MgSO 4 tamponnée.</li>
</ol> 3. Souris cérébelleux Granule neurone isolement et Culturing <ol><li>Centrifuger le tube de 50 mL contenant le tissu cérébral haché pendant 5 min, 644 x g, 4 ° C.</li>
	<li>Enlever le surnageant et ajouter 10 mL de solution de dissection de la trypsine. Puis secouer le tube à haute vitesse pendant 15 min à 37 ° C.</li>
	<li>Ajouter 10 mL de solution d’inhibiteur de trypsine 1 pour le tube et balancez doucement pendant 2 min.</li>
	<li>Centrifuger le tube pendant 5 min, 644 x g, 4 ° C.</li>
	<li>Enlever le surnageant et ajouter 2 mL de solution d’inhibiteur de trypsine 2 et puis transférez dans un tube de 15 mL.</li>
	<li>Triturer le tissu dans le tube de 15 mL jusqu'à ce que la solution devient trouble. Alors, que se contenter de 5 min.</li>
	<li>Enlever le surnageant clair et transférer le surnageant dans un nouveau tube contenant 1 mL de solution de dissection CaCl 2 complétée.</li>
	<li>Ajouter un autre mL de solution d’inhibiteur de trypsine 2 au fond du tube contenant le culot à l’étape 3.6. Broyer à nouveau et laisser s’installer pour 5 min. Retirez le surnageant et ajoutez-le dans le tube contenant le liquide surnageant de l’étape 3,7 (qui est une répétition des étapes 3,6 à 3,7). Répétez ce processus jusqu'à ce que la plupart des tissus est dissocié mécaniquement.</li>
	<li>Ajouter 0,3 mL de CaCl 2 complété solution de dissection à la collection surnageante pour chaque mL du surnageant.</li>
	<li>Mélanger le contenu du tube et centrifuger pendant 5 min à 644 x g.</li>
	<li>Enlever le surnageant et ajouter 10 mL de supports neufs au culot et mélanger.</li>
	<li>Cellules peuvent ensuite être comptés et diluées à une concentration de 1,5 x 10 6 cellules/mL. Veuillez noter que, en général, 10 millions de cellules sont attendus de chaque cerveau disséqué, tributaire de la trypsinisation et réduit son efficacité de dissection. Plaque de cellules sur des plaques de poly déjà faites D-lysine. Pour les plaques de 4 puits, plaque de 0,5 mL, donnant 7,5 x 10 5 cellules par puits. Pour les plats de 35 mm, plaque 4 mL, ce qui donne 6 x 10 6 cellules / plaque.</li>
	<li>Après 24 h, ajouter furanoside arabino-β-cytosine (AraC) aux plaques pour réduire la contamination gliale. Pour chaque mL de médias 0,5 µL de 20 mM AraC est requise. Ajout de l’AraC ne nécessite pas un changement de support. Si les cellules doivent être conservés pendant 7-8 jours, répétez ce traitement au jour 3.</li>
	<li>Maintenir les cultures dans un 5 % CO 2 incubateur à 37 ° C et se nourrissent avec 100 µL de 100 mM de glucose ajoutée à la culture pour tous 2 mL de médias depuis 5 jours tous les 2 jours. Un changement de support complet n’est pas nécessaire.</li>
</ol> 4. Emballage de lentivirus, de Purification et de titrage Remarque : le protocole pour l’emballage, la concentration, la purification et la titration des lentivirus a déjà été décrite en détail sans l’utilisation d’un kit 28, y compris des méthodes alternatives pour le titrage, tels que l’écoulement cytometry 29. Nous présentons ici brièvement le protocole utilisé dans notre laboratoire pour la production de lentivirus pour étudier les lésions neuronales à l’aide de la solution de purification de virus rapide et un kit de titrage des gènes de qPCR.
<ol><li>Cellules Hek293T de plaque dans les récipients de culture de 10 cm avec Dulbecco &#39; s modified Eagle &#39; s milieu essentiel minimal (DMEM) additionné de 10 % FBS. Pour l’obtention d’un titre viral élevé, croître au moins 5 plaques de cellules Hek293T pour chaque transfection. S’assurer que le jour des cellules de transfection sont 70 % anastomosé. Changer de média trois heures avant la transfection.</li>
	<li>Pour chaque transfection, préparer deux tubes. Dans le tube 1 ajouter 1,5 mL de milieu de sérum MEM-réduit et 41 µL de réactif de transfection, bien mélanger. Dans le tube 2, ajouter 1,5 mL de médias de sérum MEM-réduit et 6 µg de plasmide de transfert, 6 µg du CMVp-dR8.2 vecteur (plasmide d’emballage), 3 µg CMVp-VSV-G vecteur (plasmide enveloppe) et 35 µL de réactif de renforceur p3000 (livré avec lipofectamine). Mélangez bien et combiner tubes 1 et 2, vortex et incuber pendant 15 min.</li>
	<li>Supprimer 50 % des médias de Hek293T plaques et ajouter des complexes ADN-lipidiques aux cellules. Incuber pendant 6 heures à 37 ° C, 5 % de CO 2. Retirez les supports et remplacer par 5 mL de DMEM fraîche, incuber pendant la nuit.</li>
	<li>À 24 h après transfection, recueillir le premier lot de surnageant viral de chaque plaque. Gardez les médias virales à 4 ° C et ajouter 5 mL de supports neufs dans chaque boîte de cellules Hek293T. Incuber pendant la nuit.</li>
	<li>48 h après transfection, recueillir le deuxième lot de surnageant viral, combinez-le avec le premier lot et centrifuger combiné surnageant viral pendant 10 min à 600 x g.</li>
	<li>Filtrer le liquide surnageant à travers un filtre avec 45 µm taille de pore.</li>
	<li>Purifier le virus à l’aide d’une solution de purification rapide de virus. Pour chaque 45 mL du surnageant viral, ajouter 5 mL de solution de liaison des gènes, mix et centrifugation pendant 10 min à &#62; 5 000 x g et 4 ° C.</li>
	<li>Enlever le surnageant avec précaution pour ne pas déranger le culot.</li>
	<li>Ajouter 20-40 µL de milieu et remettre en suspension l’extrait concentré. Aliquote et les conserver à -80 ° C.</li>
	<li>Pour obtenir le titre des gènes, un kit de titrage des gènes de qPCR est utilisé. Diluer 2 µL de virus purifié dans 500 µL de PBS. Ajouter 2 µL du virus dilué à 18 µL de tampon de lyse de virus (fourni dans le kit).</li>
	<li>Ensemble à trois différentes réactions de q-RT-PCR dans triplicates et l’étiquette comme contrôle viral de lysat, positif 1 (STD1) et contrôle positif 2 (STD2). Pour chaque réaction ajouter, 12,5 µL de 2 x qPCR MasterMix, 2,5 µL de soit virale lysat ou STD1 (fourni dans le kit) ou STD2 (fourni dans le kit) et 10 µL de réactif-mix (fourni dans le kit) en tubes PCR de 0,2 mL.</li>
	<li>Définir le programme de la PCR comme suit : 20 min à 42 ° C pour la transcription inverse, 10 min à 95 ° C pour l’activation de l’enzyme, 40 cycles de 15 s à 95 ° C pour la dénaturation et à 1 min à 60 ° C pour le recuit et l’extension.</li>
	<li>Calculer le titre viral en utilisant cette formule : 
	Titre du viral lysat = 5 x 10, 7 / 2 3(Ctx-Ct1)/(Ct2-Ct1). 
	CTX = valeur Ct moyenne d’échantillon inconnu, Ct1 = valeur moyenne de STD1, Ct2 = valeur moyenne de STD2. 
	NOTE : SCT peuvent être mieux transduite avec lentivirus ou infectés avec les adénovirus selon le mode de l’étude des blessures. Ajout de lentivirus à un MOI de 2-3 à la solution de culture cellulaire au moment de l’électrodéposition est utilisé pour étudier le NMDA induit signalisation au 7e jour de la culture. Cela se traduit par plus de 80 % la transduction et convient de poursuivre avec des analyses biochimiques de ces neurones ( Figure 2). Ajout des adénovirus au jour 5 de culture (chez MOI 50) et d’étudier la NMDA induit signalisation à jour 7-8 est utilisé pour d’autres techniques comme l’imagerie. Ce traitement entraîne moins de 10 % infection des neurones, ce qui est idéal pour l’imagerie et la co-localisation des protéines. Adénovirus peuvent servir au moment de l’électrodéposition d’étudier l’ADN des dommages induits par la mort cellulaire par addition de camptothécine au jour 2-3 ou un stress oxydatif par addition d’eau oxygénée. La présence de protéines de fluorescence (GFP, DP, PCP ou YFP) taggée pour le gène d’intérêt peut servir à estimer le pourcentage transduction et la toxicité potentielle. Avec le ministère de l’intérieur recommandée, nous voyons la toxicité minimale et maximale transduction ( Figure 3).</li>
</ol> 5. Modélisation des lésions neuronales <ol><li>pour induire la NMDA induit l’excitotoxicité neuronale, après 7 jours in vitro, traiter SCT avec 100 µM NMDA et glycine 10 µM pour 1 h. remplacer tous le milieu par milieu conditionné de cultures parallèles avec no traitement. Cette concentration entraîne la mort cellulaire de 50 % à 24h post traitement ( Figure 3). Fragmentation mitochondriale est évidente au post-traitement de 6 à 8 heures (voir Jean-Asl et al. 26 , 27).</li> <li>pour induire la mort cellulaire induite par le ROS (stress oxydatif), traiter les neuroNS avec 75-100 µM peroxyde d’hydrogène (H 2 O 2) et les interrupteurs à conditionné médias de cultures parallèles après une exposition de 5 min à 2 H 2 O. Remarque, en raison de l’instabilité de l’H 2 O 2, optimiser la concentration à un niveau qui induit la mort des cellules en culture après 24 h de traitement 50-70 %.</li>
	<li>Pour induire l’ADN endommager la mort cellulaire induite, traiter le SCT avec 10 µM camptothécine. Cette concentration induit plus que la mort cellulaire de 50 % en 24 h. fragmentation mitochondriale et signalisation d’apoptose précoce produit 2-3 h après l’addition de camptothécine à cette concentration (voir Jean-Asl et al. 18)</li> <li>pour induire la faible K + induit l’apoptose neuronale au SCT, changer les milieux contenant 25 mM K + de médias de potassium faible avec 5 mM K + après 7 jours in vitro.</li></ol>

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<li>Holubowska, A., Mukherjee, C., Vadhvani, M., Stegmuller, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+manipulation+of+cerebellar+granule+neurons+in+vitro+and+in+vivo+to+study+neuronal+morphology+and+migration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Genetic manipulation of cerebellar granule neurons in vitro and in vivo to study neuronal morphology and migration.</a> J Vis Exp. (85), (2014).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous fournissons ici une méthode simple pour la mise en culture de neurones granule cervelet de souris primaire (SCT), de perte et de gain d’études de fonction et la modélisation des différents mécanismes de mort cellulaire. Plusieurs facteurs affectent la reproductibilité des résultats à l’aide de cette procédure qui nécessitent une surveillance étroite. Il s’agit de la pureté de la culture, y compris l’élimination des cellules gliales dans la culture, à la confluence de la culture et de maintenir les cellules en bonne ...

Neurones cérébelleux granule (SCT) sont bien caractérisés en culture et ont servi comme un modèle efficace pour étudier la mort neuronale et développement 1,2,3,4,5, 6. l’expression précoce des récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA) en CGN cultures in vitro rend un modèle attrayant pour étudier NMDA induite par la signalisation. L’activation de ces récepteurs NMDA en conjonction avec la dépolarisation de la membrane est utilisée pour modéliser la stimulation de l’activité neuronale physiologiques et a permis pour la recherche sur les mécanismes de la plasticité synaptique 7,8. Au contraire, une stimulation excessive de ces récepteurs par ligand NMDA peut être utilisée pour modéliser l’excitotoxicité, des principaux mécanismes de la perte neuronale dans l’aigu des lésions cérébrales et neurodégénératives maladies 9. Un mécanisme pour l’induction de l’excitotoxicité est par famine ATP en oxygène réduite, comme on le voit avec les lésions neuronales aiguës. Cela se traduit par une dépolarisation membranaire et des concentrations élevées de glutamate de sortie au niveau de la synapse. La surstimulation subséquente du récepteur NMDA par élevés de glutamate provoque Ca2 + afflux excessif par l’intermédiaire de ces récepteurs, qui à son tour active plusieurs voies y compris Ca2 +-activation de protéases, phospholipases, et endonucléases, entraînant la dégradation incontrôlée des composantes cellulaires essentielles et mort cellulaire. En outre, haute intracellulaire Ca2 + conduit à la génération de radicaux libres d’oxygène et mitochondriale dommages 10,11.
Bien que la majorité de la perte neuronale suite excitotoxicité neuronale induite par le NMDA est due à l’influx de calcium et Bax/Bak indépendant, les autres mécanismes de mort cellulaire ne peuvent être exclus de ce modèle. L’apparition des deux nécrotiques et apoptose comme la mort cellulaire en raison de l’excitotoxicité est partiellement due à la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) et des lésions de l’ADN provoquée par le haut intracellulaire Ca2 + niveaux 12. Dommages à l’ADN se traduit par la mort neuronale par le biais de mécanismes apoptotiques, étant en corrélation avec les caractéristiques de la mort cellulaire par apoptose, comme l’apparition de masses de chromatine et corps apoptotiques. Induction de l’apoptose est médiée par la libération du cytochrome c par la mitochondrie et s’est avérée être tributaire de Bax/Bak oligomérisation 13. Bax/Bak oligomérisation favorise la formation de pores dans la membrane mitochondriale externe, aboutissant à la libération du cytochrome c et l’activation de pro-apoptotic régulateurs comme on le voit avec une lésion ischémique doux 14.
Génération de ROS est un problème important dans le cerveau en raison du faible niveau endogène d’antioxydants, couplés avec l’exigence d’oxygène importante pour fonctionnement neuronal 15. Lorsqu’il est exposé à un événement ischémique, l’oxyde nitrique synthase est augmentée, production d’oxyde nitrique et d’espèces réactives de l’oxygène 14. L’augmentation de la concentration des radicaux d’oxygène peut entraîner des dommages à l’ADN et indirectement provoquer famine énergétique. Des niveaux élevés de cassures double brin de l’ADN sont corrigées par l’activation de poly ADP-ribose polymérase 1 (PARP-1), une protéine de la chromatine lié aux eucaryote responsable de catalyser le transfert d’unités d’ADP-ribose de NAD+, un processus faisant partie intégrante de Réparation de l’ADN 16. Cependant, avec des dommages excessifs à cause du stress oxydatif, activation de PARP-1 peut provoquer famine énergétique en raison de la vidange accrue sur NAD+, de substrat nécessaire à la production d’ATP par phosphorylation oxydative. En fin de compte, le stress oxydatif va déclencher l’apoptose d’une manière dépendante de Bax/Bak conduisant à la libération du cytochrome mitochondrique c et a été montré pour induire le remodelage mitochondriale dans SCT 17.
Enfin, les variations de concentration de chlorure de potassium (KCl) dans les cultures de la CGN peuvent être utilisées pour modéliser les bas potassium/dépolarisation médiée par apoptose 18,19,20. Lorsqu’ils sont exposés à de faibles concentrations de K+, SCT subissent des changements physiologiques distincts, ce qui entraîne des réductions de la respiration mitochondriale et la glycolyse, attribuée à la réduction de la demande cellulaire 21, ainsi que réduction des niveaux de facteur nucléaire-κB (NFκB) qui réglemente les activités, notamment l’inflammation et la transmission synaptique, 22. Ce modèle est particulièrement intéressant pour l’étude de la mort cellulaire au cours du développement neuronal. L’environnement K+ faible plus étroitement ressemble à des conditions physiologiques et provoque des signes de mort cellulaire vu au cours du développement neuronal 23.
En résumé, le SCT fournit un modèle depuis longtemps afin d’étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents de la mort neuronale et la dégénérescence. Le protocole suivant permettra d’isolement et culture du SCT, expression ou la répression d’une voie génétique particulière à l’aide de virus et l’induction de la mort neuronale par des mécanismes différents représentant la dégénérescence et les lésions neuronales.

<table><tbody><tr><td>kit de titrage lentivitral qPCR&nbsp ;</td><td>ABM</td><td>#LV900</td><td></td></tr><tr><td>solution rapide de purification des virus&nbsp ;</td><td>ABM</td><td>#LV999</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-dR8.2</td><td>Addgene</td><td>#8455</td><td></td></tr><tr><td>pCMV-VS.VG</td><td>Addgene</td><td>#8454</td><td></td></tr><tr><td>Eau distillée&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>#15230162</td><td></td></tr><tr><td>200 mM L-Glutamine&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>#25030081</td> 35 mm Nunc boîtes de culture Gibco#174913 <td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PowerUP SYBR green master mix</td><td>life technologies</td><td>#A25742</td><td></td></tr><tr><td>BSA V Solution</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#A-8412</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2 &bull ; 2H2O</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#C-7902&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Camptothécine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#C-9911</td><td></td></tr><tr><td>Blanc d’œuf de poule Inhibiteur de trypsine&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#10109878001</td><td></td></tr><tr><td>Cytosine bêta-D-Arabino Furanoside</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#C-1768</td><td></td></tr><tr><td>D-(+)-Glucose&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G-7528</td><td></td></tr><tr><td>DNase1&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#11284932001</td><td></td></tr><tr><td>Eagle-minimal essential medium</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#M-2279</td><td></td></tr><tr><td>Glycine</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G-5417</td><td></td></tr><tr><td>Sérum de veau fœtal dialysé inactivé par la chaleur&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#F-0392</td><td></td></tr><tr><td>Tampon Hepes&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#H-0887</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#216763</td><td></td></tr><tr><td>50 mg/mL Gentamycine&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#G-1397</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#M-2643</td><td></td></tr><tr><td>Acide N-méthyl-D-aspartique</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#M-3262</td><td></td></tr><tr><td>Solution de rouge de phénol&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#P-0290</td><td></td></tr><tr><td>Trypsine&nbsp ;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>#T-4549</td><td></td></tr><tr><td>Lipofectamine 3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>Réactif amplificateur p3000</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>L3000-008</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Sérum réduit Thermo</td><td>Fisher Scientific</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>KCl&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>#CABDH9258</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>#CABDH9286</td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4H2O&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>#CABDH9298</td><td></td></tr><tr><td>Poly D-lysine&nbsp ;</td><td>VWR</td><td>#89134-858</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Wisent</td><td>#319-005-CL</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Wisent</td><td>#080-450</td><td></td></tr></tbody></table>

modélisation de la mort neuronale et la dégénérescence de neurones granules primaires de cervelet de souris

Modeling Neuronal Death and Degeneration in Mouse Primary Cerebellar Granule Neurons

Neurones cérébelleux granule (SCT) sont un modèle neuronal fréquemment utilisé, formant une abondante population homogène dans le cervelet. Compte tenu de leur développement après l’accouchement, l’abondance et l’accessibilité, SCT est un modèle idéal pour étudier les processus neuronaux, y compris le développement neuronal, la migration neuronale et la stimulation de l’activité neuronale physiologique. En outre, cultures CGN fournissent un excellent modèle pour l’étude des différents modes de mort cellulaire, y compris l’excitotoxicité et l’apoptose. Moins d’une semaine dans la culture, SCT exprime des récepteurs N-méthyl-D-aspartate (NMDA), un récepteur de glutamate ionotropiques spécifiques avec de nombreuses fonctions essentielles de santé neuronale et la maladie. L’ajout de faibles concentrations de NMDA en conjonction avec la dépolarisation de la membrane pour rongeurs cultures primaires de CGN a été utilisée pour modéliser la stimulation de l’activité neuronale physiologique tandis que l’ajout de concentrations élevées de NMDA peut être employée pour modéliser lésions neuronales excitotoxiques. Ici, une méthode d’isolement et de culture du SCT de chiots âgés de 6 jours ainsi que la manipulation génétique du SCT par adénovirus et lentivirus sont décrits. Nous avons également présents protocoles optimisés sur la façon de stimuler l’excitotoxicité induite par le NMDA, l’apoptose induite par la basse-potassium, stress oxydatif et lésions de l’ADN après transduction de ces neurones.

Avec dissection minutieuse, le cerveau intact doit être retiré avec un minimum de dommages, comme le montre la Figure 1 a-B. Effort devrait être prise pour minimiser les dommages au cerveau pendant l’enlèvement, en particulier dommages au cervelet. Endommager le cervelet fait pour compliquer l’identification et l’élimination complète des méninges et augmente la probabilité de contamination de la culture neuronale. Après ont enlevé les méninge...

Ce protocole décrit une méthode simple pour isoler et cultiver les neurones de granule cérébral de souris primaire (SCT) de petits 6-7 jours vieux, transduction efficace du SCT pour la perte et gain d’études de fonction et modélisation excitotoxicité neuronale induite par le NMDA, la mort cellulaire induite par la basse-potassium, lésions de l’ADN et le stress oxydatif en utilisant le même modèle de culture.

Modélisation de la mort neuronale et la dégénérescence de neurones granules primaires de cervelet de souris

Cerebellar granule neurons (CGNs) are a commonly used neuronal model, forming an abundant homogeneous population in the cerebellum. In light of their ...

L'objectif général de cette procédure est de produire des populations pures et saines de neurones granulaires cérébelleux, de les manipuler génétiquement et de modéliser différents mécanismes de lésion neuronale en culture primaire in vitro. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la lésion neuronale. Nous utilisons ce protocole pour étudier les mécanismes moléculaires sous-jacents aux lésions nerveuses consécutives aux traumatismes cérébraux aigus et aux maladies neurodégénératives.Le principal avantage de ce protocole est que nous pouvons modéliser différents mécanismes de mort cellulaire, tels que l'excitotoxicité, le stress oxydatif, les lésions de l'ADN et les événements développementaux, à l'aide du système de culture. Bien que cette méthode puisse fournir des informations sur les lésions neuronales, elle peut également être utilisée avec des neurones cérébelleux de rat pour étudier l'activité neuronale et la morphogenèse en réponse à des facteurs de croissance et à des événements secondaires. Pour extraire le cerveau d'une souris âgée de six à sept jours, utilisez une paire de forceps pour saisir la tête, puis, à l'aide de ciseaux de microdissection, coupez la peau dans la direction antérieure vers la tête.Reculer la peau pour découvrir le crâne. Ensuite, pénétrer le crâne avec la pointe des ciseaux et couper en direction antérieure et latérale. En prenant soin de ne pas endommager le cervelet et afin de faciliter l'identification et l'élimination des méninges, utiliser ensuite une pince pour soulever le crâne et exposer le cerveau.À l’aide d’une pince ou d’une spatule, extraire délicatement le cerveau dans une solution de dissection froide. Pour isoler le cervelet, placer le cerveau dans la solution de dissection supplémentée en sulfate de magnésium et maintenir la solution ainsi que le cerveau sur de la glace. Sous le microscope de dissection, retirer les méninges à l’aide d’une pince fine, puis disséquer le cervelet du cerveau dans la solution de dissection contenant du sulfate de magnésium.Cela facilite le retrait des méninges résiduelles et permet de s’insinuer entre les couches pour nettoyer les circonvolutions cérébelleuses. La présence de méninges dans la culture neuronale entraîne une mauvaise santé cellulaire et, in fine, la mort cellulaire. Il est donc essentiel de s’assurer de l’élimination complète des méninges avant de procéder à la culture.Ensuite, retourner le cervelet sur sa face ventrale et s'assurer du retrait du plexus choroïde. Puis, transférer les cervelets dans une boîte de 35 millimètres contenant un millilitre de solution de dissection enrichie en sulfate de magnésium. Hacher les tissus en petits morceaux et les transférer dans un tube de 50 millilitres contenant 30 millilitres de solution de dissection tamponnée au sulfate de magnésium.À cette étape, centrifuger le tube de 15 millilitres contenant le tissu cérébral haché pendant cinq minutes à 644 ×g et à 4 °C. Ensuite, éliminer le surnageant et ajouter 10 millilitres de solution de trypsine pour la dissection. Puis agiter l'ensemble à grande vitesse pendant 15 minutes à 37 °C.Ajoutez deux millilitres de solution d'inhibiteur de la trypsine un dans le tube et agitez doucement pendant deux minutes. Ensuite, centrifugez le tube pendant cinq minutes à 644 ×g et à 4 °C. Au bout de cinq minutes, éliminez le surnageant et ajoutez deux millilitres de solution d'inhibiteurs de la trypsine deux avant de transférer le mélange dans un tube de 15 millilitres.Ensuite, triturer le tissu dans le tube de 15 millilitres jusqu'à ce que la solution devienne trouble. Laisser reposer pendant cinq minutes. Puis éliminer le surnageant clair et le transférer dans un nouveau tube contenant un millilitre de solution de dissection supplémentée en chlorure de calcium.Ajoutez encore deux millilitres de solution d'inhibiteur de la trypsine 2 au fond du tube contenant le culot. Effectuez une nouvelle pipetage et laissez reposer pendant cinq minutes. Retirez le surnageant et ajoutez-le au tube contenant le surnageant de l'étape précédente.Répétez ce processus jusqu'à ce que la majeure partie du tissu soit dissociée mécaniquement. Ajoutez 0,3 millilitre de solution de dissection supplémentée en chlorure de calcium pour chaque millilitre de surnageant recueilli. Mélangez le contenu du tube, puis centrifugez pendant cinq minutes à 644 ×g à température ambiante.Ensuite, retirez le surnageant. Ajoutez 10 millilitres de milieu frais au culot et mélangez. Puis comptez les cellules viables et diluez-les à une concentration de 1,5 × 10⁶ cellules par millilitre.Ensemencez les cellules sur les plaques préparées au préalable avec de la poly-D-lysine. Pour les plaques à quatre puits, ensemencez 0,5 millilitre de l'échantillon, soit 7,5 × 10⁵ cellules par puits. Pour les boîtes de 35 millimètres, ensemencez 4 millilitres de l'échantillon, soit 6 × 10⁶ cellules par boîte.Pour les lamelles, ensemencer 0,5 millilitre contenant 7,5 × 10⁵ cellules par puits. Après 24 heures, ajouter de l'AraC aux plaques afin de réduire la contamination gliale. Si les cellules doivent être conservées pendant sept à huit jours, répéter ce traitement au troisième jour et maintenir les cultures dans un incubateur à 5 % CO₂ à 37 degrés Celsius.Pour les cultures maintenues plus de cinq jours, alimenter la culture en glucose tous les deux jours à partir du jour cinq. Pour induire une excitotoxicité neuronale avec le NMDA, après sept jours in vitro, traiter les neurones granulaires cérébelleux avec 100 micromolaire de NMDA et 10 micromolaire de glycine pendant une heure. Ensuite, remplacer le milieu par du milieu conditionné provenant de cultures parallèles non traitées.Cette concentration entraîne une mort cellulaire de 50 % après 24 heures de traitement. Pour induire la mort cellulaire par espèces réactives de l'oxygène, traitez les neurones avec du peroxyde d'hydrogène à une concentration de 75 à 100 micromolaire pendant cinq minutes. Après cinq minutes, remplacez par le milieu conditionné provenant de cultures parallèles.En raison de l'instabilité du peroxyde d'hydrogène, la concentration doit être optimisée à un niveau induisant une mort cellulaire comprise entre 50 et 70 % après 24 heures. Cette concentration se situe généralement entre 75 et 100 micromolaire. Pour induire la mort cellulaire par dommages à l'ADN, traitez les neurones granulaires cérébelleux avec 10 micromolaire de camptothécine afin d'induire plus de 50 % de mort cellulaire en 24 heures.Pour induire l'apoptose neuronale par faible concentration de potassium dans les neurones granulaires cérébelleux, remplacer le milieu contenant 25 millimolar de potassium par un milieu à faible teneur en potassium (5 millimolar) après sept jours in vitro. Les neurones ont été transduits avec un lentivirus exprimant RFP à un MOI de 3 au moment de la mise en culture. Fixation et coloration réalisées après sept jours in vitro.La co-localisation du signal RFP avec MAP2 et Hoechst est présentée afin de démontrer la présence de neurones sains entièrement transduits par les lentivirus. Les images présentées ici représentent les analyses d'un test de viabilité réalisées sur des neurones infectés avec différents MOI d'adénovirus afin d'évaluer la toxicité. L'infection de neurones granulaires cérébelleux par un adénovirus exprimant LacZ à un MOI compris entre 25 et 50 permet une efficacité maximale tout en maintenant une toxicité minimale.Moins de 1 % de différence de survie cellulaire par rapport au témoin est observée lors de l'infection à ce MOI. Ces images montrent la coloration au Hoechst de neurones granulaires cérébelleux témoins et de neurones granulaires cérébelleux traités au NMDA pour induire la mort cellulaire. Remarquez la formation de noyaux pyknotiques après le traitement au NMDA.Ceci indique une mort cellulaire et peut être observé dans environ 50 % de la culture 24 heures après le traitement avec 100 micromolaire de NMDA et 10 micromolaire de glycine. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en deux heures et demie avec six cerveaux de souris, si elle est effectuée correctement. Lors de l'exécution de cette technique, il est important d'utiliser une technique aseptique et des instruments chirurgicaux enchaînés selon les besoins afin de minimiser le risque de contamination de la culture.Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour étudier le développement neuronal et les lésions neuronales dans des neurones primaires de souris. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure de cultiver des neurones granulaires cérébelleux, de les manipuler génétiquement à l'aide de virus et d'induire divers mécanismes de lésion nerveuse. Suite à cette procédure, d'autres méthodes comme l'immunofluorescence ou les tests de viabilité cellulaire peuvent être réalisées afin de répondre à des questions telles que savoir si un gène d'intérêt améliore la survie cellulaire en réponse à l'excitotoxicité, au stress oxydatif ou aux dommages de l'ADN.

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Nous présentons ici une méthode pour isoler et cultiver des cellules granulaires du cervelet et les neurones neurones progénitrices granulaires du cervelet de souris postnatale.

Isolement et culture de la Post-Natal cellules granulaires du cervelet de la souris progénitrices Neuron et les neurones

Cette vidéo montre la technique d’isolement et de culture des neurones granulaires cérébelleux primaires de souris. Les cellules sont traitées avec un antimétabolite pour éliminer les cellules gliales proliférantes et produire une culture pure de neurones granulaires cérébelleux.

Isolement et culture de neurones granulaires cérébelleux primaires de souris

Cette vidéo démontre la génération d’un modèle de lésion neuronale dans les neurones primaires du granule cérébelleux de souris. Il décrit les étapes impliquées dans l’induction de lésions neuronales à l’aide de NMDA, un agoniste des récepteurs de neurotransmetteurs excitateurs, et de glycine, un co-agoniste. Le NMDA et la glycine se lient à des récepteurs neuronaux spécifiques, provoquant leur surstimulation et entraînant un afflux massif de calcium intracellulaire, ce qui entraîne des...

Modélisation des lésions neuronales dans les neurones granulaires cérébelleux primaires de souris

Cette vidéo décrit la génération d’un modèle de lésion neuronale à l’aide d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) dans les neurones primaires du cervelet de souris. Il détaille le processus d’induction du stress oxydatif par l’ajout de fortes concentrations de peroxyde d’hydrogène. L’exposition aux ROS provoque des cassures de brins d’ADN et une instabilité génomique. De plus, l’oxydation des protéines cellulaires altère leurs fonctions, tandis que la peroxydation lipidique compromet l’intégrité...

Modélisation de la mort neuronale induite par les espèces réactives de l’oxygène dans les neurones des granules cérébelleux de souris

Source : Chan, U., et al., Utilisation de l’électroporation postnatale in vivo pour étudier la morphologie des neurones granulaires cérébelleux et le développement des synapses. J. Vis. Exp. (2021).Cette vidéo démontre l’analyse du développement des neurones granulaires cérébelleux en imageant des tranches de tissu cérébral préfixées de souris marquées avec une protéine fluorescente, Capturer des images haute résolution de la pile Z avec un microscope confocal et mesurer les paramètres...

Visualisation de la synaptogenèse des neurones granulaires cérébelleux à différents stades de développement

Morphogenèse neuronale et la migration sont des événements cruciaux qui sous-tendent le développement normal du cerveau. Ici, nous décrivons des méthodes pour manipuler génétiquement les neurones granulaires du cervelet en culture et le cervelet en développement pour l'évaluation de la morphologie et les caractéristiques de migration des neurones.

Manipulation génétique des neurones du cervelet granules<em&gt; In Vitro</em&gt; Et<em&gt; In Vivo</em&gt; À étudier neuronale Morphologie et migration

La couche de granules cérébelleux externe est le site de la plus grande amplification de transit dans le cerveau en développement. Ici, nous présentons un protocole de cibler la modification génétique de cette couche au sommet de la prolifération utilisant ex électroporation et la culture de tranches de cervelet vivo à partir embryonnaires Jour 14 embryons de poulet.

Culture ex vivo de Chick cervelet tranches et spatialement ciblées électroporation de granules précurseurs de cellules

Ce protocole décrit comment mesurer avec précision la viabilité neuronale à l'aide de la diurétate de fluorescéine (FDA) et de la double coloration à l'iodure de propidium (PI) dans des neurones de granules cérébelleux cultivés, une culture neuronale primaire utilisée comme modèle in vitro dans les recherches en neuroscience et neuropharmacologie.

Évaluation de la viabilité neuronale à l&#39;aide de diacétate de fluorescéine-iodure de propidium Double coloration dans la culture du neurone de granulé céréalier

Mener des expériences in vitro pour refléter les conditions in vivo aussi adéquatement que possible n'est pas une tâche facile. L'utilisation des cultures cellulaires primaires est une étape importante vers la compréhension de la biologie cellulaire dans un organisme entier. Le protocole fourni décrit comment se développer avec succès et cultiver les neurones cérévelaires embryonnaires de souris.

Culture primaire des neurones isolés du cervelet de souris embryonnaire

Nous décrivons ici une méthode pour visualiser la synaptogenèse des neurones granulaires dans le cervelet de la souris au cours du développement cérébral postnatal lorsque ces cellules affinent leurs structures synaptiques et forment des synapses pour s’intégrer dans le circuit cérébral global.

Utilisation de l’électroporation postnatale in vivo pour étudier la morphologie des neurones cérébelleux granulaires et le développement des synapses

Découvrez la modélisation de la mort neuronale et la dégénérescence des neurones granules cérébelleux de souris. Cette méthode permet d'étudier les mécanismes d'excitotoxicité, de stress oxydatif et de dommages à l'ADN.

Modélisation de la mort neuronale et la dégénérescence de neurones granules primaires de cervelet de souris

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