Ex Vivo Imaging postnatal du cervelet granules migration cellulaire utilisant confocale Macroscopie

L’objectif global de cette procédure est de visualiser la migration des neurones dans des tranches de cerveau vivantes. Ceci est accompli en disséquant d’abord le cervelet d’un rat P 10. Les prochaines étapes consistent à préparer des coupes cérébelleuses aiguës et à marquer les neurones à l’aide d’une sonde fluorescente.

Ensuite, l’expérience time-lapse est réalisée par imagerie macro-confocale ou microscopie confocale. La dernière étape consiste à suivre les neurones dans les films résultants. Enfin, la microscopie ex vivo est utilisée pour montrer le rôle des facteurs endogènes ou des substances toxiques qui régulent la migration neuronale.

Le principal avantage de cette technique par rapport aux méthodes existantes comme la microscopie confocale, est que l’imagerie macro confocale augmente la sensation de vue en laissant des tranches d’art cérébral directement placées sur l’insert de l’aine. J’ai d’abord, eu l’idée de cette méthode lorsque j’ai eu des difficultés à transférer et stabiliser des tranches d’art cérébral pour des expériences de microscopie confocale Commencez par avoir accès au crâne d’une tête de raton P 10 décapitée, à l’aide de fines ciseaux à iris faites délicatement deux incisions latérales de la base à la région rostrale du crâne. Retirez ensuite le crâne disséqué à l’aide de deux pinces numéro trois, brisant ainsi toute adhérence entre le cerveau et le crâne.

Maintenant, retirez le cerveau avec l’extrémité d’une cuillère d’une spatule et mettez-le dans une boîte de Pétri de 35 millimètres avec deux millilitres de HBSS froid sur de la glace. Maintenant, sous un stéréomicroscope, isolez le cervelet du cerveau par des lacérations D à l’aide de deux pinces numéro trois. Versez le cervelet dans un nouveau plat avec un tampon glacé.

Ensuite, à l’aide des mêmes outils, retirez et jetez la moelle épinière résiduelle et la membrane de pelage. Préparez un manche de scalpel solide numéro trois avec une lame chirurgicale numéro 15. À l’aide de la lame sous un stéréomicroscope, coupez le cervelet entre le verus et l’hémisphère droit.

Maintenant, au niveau du vibrato, mettez une goutte de colle cyanocrylate sur le disque de l’échantillon et attendez 15 à 25 secondes que la vapeur de solvant se dissipe avant de transférer le cervelet sur le disque. Ensuite, fixez le bord du cervelet au disque de l’échantillon et attendez 10 secondes. Maintenant, à l’aide du manipulateur, insérez le disque d’échantillon dans le plateau tampon de sorte que l’axe transversal du cervelet soit perpendiculaire au porte-couteau.

Assurez-vous de fixer le disque à l’aide d’une clé à molette. Ensuite, couvrez soigneusement le cervelet avec HBSS et chargez de la glace pilée dans le bain de refroidissement. Pour trancher l’échantillon, placez une lame nettoyée, de sorte que son bord soit juste derrière le bord arrière de l’échantillon.

Définissez-le comme le point de départ du glaçage. Utilisez ensuite la commande forward pour définir le point d’extrémité juste au-delà du bord avant de l’échantillon. Réglez maintenant l’épaisseur de la tranche à 180 microns.

Réglez ensuite la vitesse de sectionnement sur 2,5 et la fréquence sur huit, et commencez à sectionner l’échantillon. Prélevez jusqu’à cinq tranches par cervelet. Prélevez chaque section à l’aide d’une pipette tronquée en verre de sanglier.

Transférez les sections dans un plat contenant du HBSS froid sur de la glace. Après avoir recueilli les tranches au microscope stéréoscopique, retirez soigneusement les méninges à l’aide de deux pinces numéro cinq. Séparez également doucement les LOE pour une meilleure charge de la sonde.

Après avoir tranché l’échantillon, utilisez une pipette de verrat large tronquée pour les transférer avec un peu de HBSS dans une charge de plaque à six puits jusqu’à trois tranches dans chaque puits. Ensuite, après avoir vidé le support dans chaque chargé, ajoutez bien cinq millilitres de solution de chargement contenant 10 micromolaires du colorant fluorescent pour protéger les échantillons de la lumière, couvrez la plaque avec une feuille d’aluminium. Placez ensuite la plaque sur un mutateur réglé à 35 RPM.

Laissez la plaque incuber pendant 10 minutes à température ambiante pour laisser le colorant bien étiqueter les cellules. Transférez maintenant les tranches comme précédemment dans la membrane d’un insert transwell qui a des pores de trois microns. Aspirez ensuite le milieu de chargement en ne laissant que les tranches.

Retirez maintenant l’insert et les tranches pour remplir le puits avec 1,9 millilitres de DMEM. Remettez ensuite l’insert et ajoutez encore 100 microlitres de DMEM pour couvrir les mouchoirs. Incuber cette préparation pendant deux heures, après quoi les cellules granulaires seront visibles.

Transférez la plaque sans le couvercle dans une chambre environnementale avec un flux de gaz constant sur un microscope confocal. Placez ensuite le couvercle en verre sur l’insert de la plaque du microscope confocal pour les expériences en accéléré. Laissez les cellules incuber dans la chambre pendant deux heures supplémentaires avant de continuer.

Pour visualiser la migration des cellules granulaires dans les tranches de tissu, éclairez la préparation avec une lumière de 488 nanomètres et utilisez un objectif sec deux x. Détectez les émissions fluorescentes de 500 à 530 nanomètres à l’aide de l’image J.Pour chaque image du film en accéléré, effectuez une projection Zack à l’aide du mode écart-type, ajustez les niveaux de contraste et de luminosité de chaque image afin que les cellules granulaires étiquetées soient faciles à voir. Maintenant, choisissez le plugin de suivi manuel dans le menu d’analyse des particules.

Utilisez le plugin pour cliquer sur le point central de chaque corps de cellule étiqueté tout au long de la séquence d’images en accéléré. Exportez ensuite les données de suivi brutes vers une feuille de calcul pour une analyse plus approfondie. Réorganisez les données de suivi brutes exportées de l’image J à l’aide d’un outil maison intelligent qui identifie chaque cellule et les positions associées à l’aide du programme.

Calculez la distance totale parcourue et la vitesse moyenne de migration de chaque cellule. Dans le cervelet postnatal précoce, les cellules granulaires présentent des changements significatifs dans leur mode et leur vitesse de migration lorsqu’elles traversent différentes couches corticales. Des cellules granulaires marquées au CTG dans des tranches de tissu cérébelleux de rat PM ont été examinées.

Comme décrit, les cellules granulaires ont migré radialement dans la couche moléculaire à une vitesse moyenne de 18 microns par heure. Une autre préparation a ensuite été utilisée pour tester l’effet des drogues censées modifier le taux de migration. L’application du plafond salarial 38 au milieu de culture a entraîné une diminution de 79 % de la vitesse des cellules granulaires dans la couche moléculaire, soit une baisse à 2,5 microns par heure.

L’administration de PI one, un inhibiteur de la TPA endogène, a réduit la vitesse de migration des cellules granulaires de 78 %, passant de la vitesse de contrôle à 4,2 microns par heure. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de suivre les cellules dans le ballon théorique en développement. Pendant que j’essaie cette procédure, il est important de se rappeler de fournir des paramètres environnementaux appropriés et constants essentiels pour la migration cellulaire après son développement.

Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer les processus factuels dans le cerveau.