Name: Ex Vivo Imaging postnatal du cervelet granules migration cellulaire utilisant confocale Macroscopie (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-05-12T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 10 s
Description: Découvrez l'imagerie ex vivo du cervelet postnatal pour visualiser la migration des cellules granulaires par macroscopie confocale. Cette méthode permet d'étudier les facteurs endogènes régulant la migration neuronale.

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Ce travail a été soutenu par l&#39;Institut de recherche et d&#39;innovation en biomédecine (IRIB), la plate-forme de la Normandie d&#39;imagerie cellulaire (PRIMACEN), l&#39;Inserm, IBiSA, l&#39;Université de Rouen, le Fonds européen de développement régional (FEDER - PERENE, Interreg 4A), LARC-Neurosciences réseau et de la Région Haute-Normandie.

Animaux (mâle ou rats Wistar femelles) sont nés et élevés dans une animalerie accrédité (approbation B.76-451-04), selon le guide français pour le soin et l&#39;utilisation des animaux de laboratoire. Des expériences ont été menées sous la supervision de chercheurs autorisés (MB, DV et LG) en conformité avec la directive européenne Conseil de la Communauté (2010/63 / UE du 22 Septembre 2010) et le ministère français de l&#39;Agriculture. 1. Préparation des supports et outils <ol><li> Dans une enceinte de sécurité biologique, préparer la BSS 1x Hank (HBSS) dans l&#39;eau stérile de 10x solution stock contenant CaCl2 (1,85 g / l) / MgSO 4 (0,9767 g / l) sans MgCl 2. Ajouter NaHCO 3 (350 pg / ml) à 1x solution de HBSS. </li><li> Dans une enceinte de sécurité biologique, ajouter N2 supplément (à partir d&#39;une solution stock 100x) et de la pénicilline (100 unités / ml) -streptomycin (0,1 mg / ml) solution à moyen Eagle modifié (DMEM) nutriment mix de Dulbeccoture F-12 (1: 1). </li><li> Dans des conditions stériles, préparer une aliquote (25 ul, 2 mM) du colorant fluorescent cytoplasmique cellulaire appelée Tracker vert dans du DMSO (1,075 ml à 1 mg). Diluer une aliquote de 5 ml de DMEM dans un tube conique de 15 ml. </li><li> Préparer rempli seau à glace pour garder les médias à 4 ° C. </li><li> Décontaminer laboratoire paillasses et des outils avec 70% d&#39;éthanol. </li></ol> 2. Dissection du cervelet de rats P10 <ol><li> Décapiter rapidement ratons (P10) avec des ciseaux courbes de fonctionnement derrière les oreilles afin d&#39;obtenir le début de la moelle épinière. </li><li> A l&#39;arrière-côté de la tête décapitée, faire une incision médiane de la peau du cou pour le nez avec iris ciseaux fins et séparer la peau du crâne avec iris ciseaux fins et Dumont # 3 forceps. </li><li> Utilisez des ciseaux fins de l&#39;iris pour faire délicatement deux incisions latérales de la base dans la région rostrale du crâne. Retirer le crâne disséqué avec deux # 3 forceps. Détachez le soutien-gorgeà partir de toute adhérence avec le crâne en utilisant les mêmes forceps. </li><li> Transférer le cerveau avec l&#39;extrémité d&#39;une spatule de cuillère à boîte de Petri (Ø 35 mm) contenant 2 ml de milieu HBSS glacée. </li><li> Mettez la boîte de Petri contenant le cerveau dans une plus grande boîte de Petri (Ø 100 mm) rempli de glace et transfert à l&#39;étape de la loupe binoculaire. </li><li> Sous un stéréomicroscope, isoler le cervelet du cerveau par dilacération utilisant deux # 3 forceps. De même, retirer la moelle épinière résiduelle et la pie-mère-membrane. </li><li> Transférer le cervelet dans une nouvelle boîte de Pétri HBSS-rempli (Ø 35 mm, 2 ml) avec l&#39;extrémité de la cuillère d&#39;une spatule et garder sur la glace. </li></ol> 3. Préparation des aigus cervelet tranches <ol><li> Sous la loupe binoculaire, couper le cervelet entre les vermis et l&#39;hémisphère droit comme indiqué par les deux têtes flèche dans la figure 2A avec une poignée de scalpel norme n ° 3 solide et une lame chirurgicale # 15. </li><li> Mettre une goutte de cyanoacrylate colle sur la platine de vibratome et attendre 15 à 25 secondes pour éliminer les vapeurs de solvants toxiques. </li><li> Recueillir le cervelet de coupe avec la fin de la cuillère d&#39;une spatule et éliminer l&#39;excès de HBSS avec des serviettes en papier propre. </li><li> Apportez le cervelet près de la platine. Fixer le bord de coupe de la platine et attendre 10 sec. </li><li> Insérez le disque d&#39;échantillon dans le bac tampon avec le manipulateur, et le faire pivoter afin de l&#39;axe transversal du cervelet est perpendiculaire au porte-couteau. Fixer le disque de l&#39;échantillon avec une clé Allen et remplir doucement le bac tampon avec du milieu HBSS jusqu&#39;à ce que le cervelet est couvert. </li><li> Charge de la glace pilée dans le bain de refroidissement. </li><li> Nettoyer les lames trois fois avec de l&#39;éthanol à 70% afin d&#39;éliminer toute l&#39;huile. </li><li> Insérez la lame dans le porte-couteau et le fixer avec la vis de serrage. </li><li> Placez le bord droite de la lame derrière le bord arrière (de la vue de l&#39;utilisateur) de l&#39;échantillon et le définir comme un point de départ. Utilisez commandement avancé pour définir til le point final après le bord avant de l&#39;échantillon. </li><li> Sélectionnez sectionnement vitesse à 2,5 et sectionnement fréquence à 8. Sélectionnez épaisseur de dégrossissage à 180 um. Démarrer une découpe de tissu. </li><li> Pick-up chaque section en utilisant un verre à large alésage tronqué pipette et transférer Pasteur à HBSS contenant boîte de Petri (Ø 35 mm) conservé dans la glace. </li><li> L&#39;utilisation de deux # 5 pince, retirer les méninges soin du cervelet lorsque interférer avec la lame. Collectez un maximum de 5 tranches par cervelet (Figure 2B, C). </li><li> Retirez les méninges des tranches de cervelet soigneusement avec deux pinces # 5 sous la loupe binoculaire et séparer délicatement les lobules pour une meilleure charge de sonde. </li></ol> 4. coloration fluorescente de vie Interneurones <ol><li> Transfert tranches de cervelet avec une pipette de Pasteur verre à large alésage tronqué à une plaque de 6 puits (max 3 tranches / par puits). Aspirer le milieu HBSS. </li><li> Incuber tranches (3 max) dans 5 ml de loading solution du colorant fluorescent (10 uM). </li><li> Pour protéger de la lumière, couvrir la microplaque de papier d&#39;aluminium. Mettez-le sur une table gyro-mobile à 35 tours par minute pendant 10 min à température ambiante pour faciliter l&#39;étiquetage de la cellule. </li><li> tranches de transfert sur ​​la membrane d&#39;un Transwell insérer (3,0 um taille des pores; Figure 2D) avec une pipette de Pasteur verre à large alésage tronqué. Aspirer le milieu de chargement avec pipette. </li><li> Retirer l&#39;insert et remplissez le puits avec 1,9 ml de DMEM. Remplacer l&#39;insert et ajouter 100 ul de DMEM sur le dessus de la tranche pour couvrir le tissu. </li><li> Placer la plaque contenant les inserts de culture dans la chambre de l&#39;incubateur (37 ° C, 5% de CO 2) pendant 2 heures ce qui est suffisant pour observer GC dans le ML. Lie tissus plates pour permettre la fixation sur la membrane de l&#39;insert (figure 2E). Veiller à ce que les tranches sont pas de séchage. </li></ol> 5. Ex vivo Imaging Grâce confocale Macroscopie <ol><li> Transférer la plaque sansle couvercle en plastique dans un incubateur attaché à la barre d&#39;un macroscope confocal. Placez un couvercle de verre sur l&#39;insert de plaque de la macroscope. Maintenir la température de la chambre à 37,0 ° C ± 0,5 ° C, et de fournir les tranches avec un débit de gaz constant (95% O 2, 5% CO 2) à travers l&#39;insert en forme de plaque pour maintenir le pH constant. Attendez 2 heures supplémentaires avant l&#39;expérience time-lapse. </li><li> La distance Pour visualiser la migration de GC dans les tranches de tissu, éclairer la préparation avec une longueur d&#39;onde de lumière de 488 nm à l&#39;aide d&#39;une diode laser à travers un macroscope de confocal à balayage laser équipé d&#39;un objectif à sec X2 (travail: 39 mm, diamètre: 58 mm, NA = 0,234), et de détecter l&#39;émission de fluorescence de 500 à 530 nm. <ol><li> Pour résoudre finement le mouvement de GC, acquérir des images avec un facteur de zoom optique supplémentaire de 1,5 à 2,0. Récupérer des images de GN dans un plan focal unique ou jusqu&#39;à 10 plans focaux différents le long de l&#39;axe z toutes les 30 min jusqu&#39;à 12 heures. </li></ol></li&gt; <li> Si nécessaire, retirez le couvercle de verre et ajouter des petits volumes (1-10 pi) d&#39;activateurs biologiques ou inhibiteurs dans DMEM avec une pipette de 10 ul d&#39;étudier leur effet sur la migration de GC. </li></ol> Suivi 6. Cell <ol><li> Pour chaque temps du film, effectuer une projection z-pile à travers le mode de type ecart dans ImageJ. Moduler le contraste et les niveaux des images successives de luminosité afin de faciliter l&#39;identification et le suivi des GC étiquetés. Carte manuellement chaque position sur l&#39;instantané de référence (à t = 0). <ol><li> Utilisez le &quot;suivi manuel&quot; plug-in dans le menu de particules Analyse et de déterminer en cliquant sur le point de chaque corps de la cellule de gravité pendant time-lapse. Exporter les données de suivi premières dans un tableur. </li></ol></li><li> Réorganiser les données de suivi premières exportées de ImageJ avec un programme intelligent de maison (http://primacen.fr, écrite dans le code PHP) qui identifient chaque cellule et les positions associées. Utilisation du programme, calculate la distance totale parcourue et la vitesse moyenne de la migration pour chaque cellule. Classer et comparer les caractéristiques de la migration des cellules dans des conditions de contrôle et de traitement en vertu de filtres appropriés, en utilisant le même programme. </li></ol>

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</ol>

Les auteurs ont rien à révéler.

Ce protocole décrit la culture des aigus P10 rat tranches de cervelet dans le système Transwell et le marquage fluorescent de GC avec un colorant fluorescent vert pour étudier la migration cellulaire au cours du développement postnatale par macroscopie confocale. Ce protocole permet des observations de la migration des cellules pour une période allant jusqu&#39;à 12 heures et les essais des rôles possibles des facteurs de la migration y compris les agonistes ou antagonistes des neuropeptides, des inhibiteurs d&#39;enzymes, des modulateurs de signalisation cellulaire ou de substances toxiques lors de l&#39;expérience de régulation. Un petit trou dans l&#39;insert de membrane avec une pointe de pipette est nécessaire pour faciliter l&#39;administration de composés dans le milieu d&#39;incubation. Une pointe recourbée pipette fait maison peut être utilisé pour faciliter la livraison de la solution. Une question d&#39;études sur la migration cellulaire sur la vie des tranches de tissu est que les mouvements du tissu lui-même peuvent faire le suivi difficile cellule. Alors que les approches précédentes ont proposé de stabiliser doucement sliCES avec un filet de nylon ou d&#39;une mince couche de queue de rat collagène 7,17, un avantage majeur de cette technologie est le transfert simple et directe d&#39;une plaque de culture de 6 puits contenant tranches de cervelet sur ​​des pièces de membrane de l&#39;incubateur à CO2 sous l&#39;objectif d&#39;un macroscope confocal. Température intégrée et CO 2 contrôleurs fournissent également des paramètres environnementaux appropriés et constants essentielles pour la migration des cellules 9. Par conséquent, les conditions de culture sont conservés pendant les observations et les mouvements de tissus sont minimisées puisque les tranches sont bien fixées à l&#39;insert de membrane. La stabilisation du tissu est contrôlée par suite de la position du ou des bords de tranche des cellules de Purkinje qui doivent être résolus références lors de l&#39;acquisition. En outre, tranches de cervelet (entre 12 et 18) répartis dans les 6 puits de la plaque peuvent être rapidement observées en détail avec une platine motorisée et un zoom optique. En raison de la grande distance de travail (X2, 39 mm) de l&#39;objectif à sec, épi-observation est exempt d&#39;immersion et de l&#39;administration de composés dans le milieu de culture est beaucoup plus facile. Par conséquent, les paramètres environnementaux et les similitudes de soutien de la culture en CO 2 incubateur et confocale macroscopie conduisent à la conservation maximale de l&#39;échantillon biologique. Un autre avantage du protocole est le grand champ de vision et par conséquent le grand nombre de cellules qui peuvent être observées simultanément. Par exemple, nous avons déterminé précédemment que la densité de GC fluorescentes avec migration radiale dans le ML est 1124 ± 138 cellules / mm 2 18. Macroscopie confocale (X2, NA = 0,234) a une résolution latérale inférieure par rapport à la microscopie confocale (40X, NA = 1,25), mais les corps cellulaires de GC peuvent être facilement suivis et la vitesse moyenne de la migration est comparable entre les deux approches technologique 7,18 . Outre l&#39;amélioration technique pour les acquisitions d&#39;image, la qualité des tranches de tissu et ela qualité de l&#39;étiquetage des e sont des points clés pour les expériences réussies. Toujours garder les médias et les tissus sur la glace au cours des processus de dissection, d&#39;éliminer l&#39;huile sur vibratome lames et ne pas utiliser des tranches de tissu en contact avec de la colle. Les coupes sagittales et transversales sont adaptées radiales et la migration tangentielle respectivement. Utiliser différentes longueurs d&#39;incubation approprié pour la détection dans les différentes couches du cortex du cervelet. Temps d&#39;incubation longs (jusqu&#39;à 8 heures) sont nécessaires pour détecter la migration de nombreux GC dans le PCL et l&#39;IGL. Depuis la migration de GC est un processus physiologique pendant des fenêtres spatio-temporels spécifiques, le contrôle positif est que les cellules doivent migrer correctement. En particulier, de nombreux GC broche dans le ML est l&#39;un des principaux indicateurs de santé pour les tranches sagittales du cervelet. Pour le démarrage des expériences, l&#39;observation des mouvements de GC dans le ML est suggéré. En effet, la forme de GC avec le corps cellulaire allongé verticalement doit être considérée comme un point de commencer ac de référencequisition avec commande successive (2 heures) et de traitement (2 h) les périodes qui peuvent être facilement effectuées dans le ML. Les colorants fluorescents comme la famille Cell Tracker ou des protéines fluorescentes exprimées à travers des constructions génétiques peuvent être utilisés comme traceurs pour les études de migration cellulaire. En raison de la cinétique lente de la migration de GC (1 pile toutes les 30 min), des expériences multicolores peuvent également être effectuées en mode séquentiel depuis 4 lasers faisceaux (405, 488, 532 et 633 nm) sont disponibles sur le système. Considérant la migration radiale centripète et centrifuge, suivi d&#39;autres interneurones peut également être réalisée 18. En particulier, de nombreux types de cellules et moins peuvent être plus facilement localisées avec un grand champ de vision. Enfin, ce protocole peut être utilisé pour étudier la migration cellulaire à d&#39;autres stades du développement cérébelleux mais aussi d&#39;autres zones du cerveau.

Dans le cervelet développement, huit différents types de neurones sont produits de façon séquentielle entre la deuxième semaine embryonnaire et la deuxième semaine post-natale chez les rongeurs 1. Originaire initialement à partir, une zone germinative primaire, cellules granulaires immatures (GC) sont les derniers à être neurones produits à partir de la couche externe granulaire (EGL), une zone germinative secondaire 2. Pendant les trois premières semaines après la naissance, le cortex cérébelleux est une structure feuilletée organisée en quatre couches comprenant la EGL, la couche moléculaire (ML), la couche de Purkinje de cellule (PCL) et la couche granulaire interne (IGL) (figure 1). Grâce à la migration centripète, immature GC, interneurones glutamatergiques, atteindre l&#39;IGL un délai d&#39;environ deux jours. À la troisième semaine postnatale, l&#39;EGL disparaît et l&#39;IGL constitue ce qu&#39;on appelle la couche granulaire (GL) dans le cervelet adulte. Dans le GL, GC recevoir entrées synaptiques excitateurs de fibres moussues et les cellules de la brosse unipolaires, etentrées synaptiques inhibitrices de axones des cellules de Golgi. Dans le ML, les axones du GC font synapses excitatrices avec neurones GABAergiques, y compris les cellules de Purkinje, les cellules, les cellules étoilées du panier, et des cellules de Golgi 2. L&#39;observation en temps réel du mouvement de cellule dans tranches de cervelet aiguës obtenues à partir de rongeurs postnatales démontre que GC modifient leur forme de façon concomitante avec des changements dans les modalités et la vitesse de migration au cours de leur parcours dans le cortex cérébelleux 3. Au cours des deux premières semaines après la naissance, précurseurs GC prolifèrent activement au sommet de l&#39;EGL. Dans la partie médiane de l&#39;EGL, postmitotique GC migrer tangentiellement dans le sens de leur processus plus large. A la frontière EGL-ML, GC ralentir leur mouvement, les cellules commencent à entrer dans un processus verticale courte descendante dans le ML. Dans le ML, GC ont un corps cellulaire allongé verticalement, un processus de fuite mince et un processus conduisant plus volumineux, et de migrer radialement le long des fibres gliales Bergmann. Dans lePCL, GC arrêter leur mouvement mais après une phase stationnaire prolongée (2 heures), ils traversent la frontière PCL-IGL. Dans l&#39;IGL, GC migrent vers le fond de la couche en l&#39;absence de support de fibres gliales. Une fois les conseils du processus menant approcher la frontière affaire IGL-blanc (WM), GC lente et cesser leur mouvement. Les sections transversales du cervelet sont préférés pour l&#39;étude des migrations tangentielles dans le EGL tout coupes sagittales sont dédiés à la migration radiale dans le ML, PCL et IGL. Certains facteurs de régulation des mouvements de GC, y compris neuropeptides (par exemple, la somatostatine, PACAP) ont été identifiés à ce jour, mais les mécanismes complets impliqués dans le contrôle spatio-temporel de la migration de GC dans chaque couche corticale sont encore largement inconnus 1,4,5,6. migration de GC a été étudié au cours des 20 dernières années par le biais de vidéos et de microscopie confocale en utilisant un éclairage la lumière soit transmis pour cellules cultivées isolées ou détection de fluorescence pour acutranches cérébelleuses Te. Dil Initialement lipophiles, et plus récemment &quot;cellule Tracker&quot; colorants et des protéines fluorescentes exprimé cellules ont été utilisées pour confocale ou microscopie à deux photons 7,8. Des expériences réussies dépendent d&#39;un certain nombre de procédures spécifiques qui rendent le protocole simple mais pas facile. En particulier, des tranches aiguës doivent être stabilisés au cours des observations généralement avec un nylon réseau maillé fait maison 9. L&#39;intensité de l&#39;éclairage la lumière doit être aussi faible que possible pour éviter la phototoxicité et photoblanchiment tel que proposé par balayage multipoint approche microscope confocal. En outre, la température et le CO 2 sont des paramètres environnementaux clés depuis l&#39;instabilité peuvent affecter la migration neuronale. Pour faciliter et affiner les procédures expérimentales, nous avons développé un protocole macroscopie confocale qui limite les mouvements de tranche, assure paramètres environnementaux constants, réduit photoblanchiment, augmente le champ de vision (de l&#39;ordre de millimètres) et consequremment le nombre de cellules (des dizaines) qui peuvent être suivis grâce à l&#39;analyse d&#39;image. Ainsi, 180 um tranches épaisses sont mises en culture sur des inserts à membranes, et des plaques à 6 puits sont directement transférés sous un objectif motorisé 2X d&#39;un macroscope confocal commercial équipé d&#39;un grand incubation chambre, la température et le CO 2 contrôleurs et un système de commande de vibration. Temps-déchéances et z-piles sont ensuite effectuées sur plusieurs heures et des outils pharmacologiques ou des molécules bioactives peuvent être ajoutés ou livrés dans le milieu d&#39;incubation. Cette méthode peut également être adapté pour étudier la migration des autres types de neurones dans le cerveau cervelet ou à différents stades de développement.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco' s modified eagle medium (DMEM) mélange de nutriments F-12</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8437</td><td></td></tr><tr><td>Hank’s balanced salt solution 10x</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1641</td><td></td></tr><tr><td>PACAP38</td><td>INRS, Canada</td><td></td><td>Bourgault et al., 200919</td></tr><tr><td>PAI-1</td><td>Calbiochem</td><td>528208</td><td></td></tr><tr><td>supplément N-2</td><td>Fisher Scientific / Gibco/ invitrogen</td><td>O973</td><td></td></tr><tr><td>Colle cyanoacrylate</td><td>Loctite</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cell Tracker Vert CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C2925</td><td></td></tr><tr><td>Polyester Transwell-Clear inserts</td><td>Corning</td><td>3452</td><td></td></tr><tr><td>Pénicilline-Streptomycine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr><tr><td>Cluster de culture cellulaire 6 puits</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP231-100</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire 35 mm de diamètre</td><td>BD Falcon</td><td>353004</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture tissulaire 100 mm de diamètre</td><td>Thermo SCIENTIFIC</td><td>130182</td><td></td></tr><tr><td>Tube en polypropylène (15 ml)</td><td>BD Falcon 352096</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Éthanol 70 %</td><td>Fisher Chemical</td><td>E/0800DF/21</td><td></td></tr><tr><td>Enceinte de sécurité biologique hotte</td><td>Thermo Scientific</td><td>MSC9 Classe II A2</td><td></td></tr><tr><td>Pipette à volume réglable (0,5-10 & micro ; L)</td><td>Eppendorf</td><td>4910 000.018</td><td></td></tr><tr><td>Gyro-rocker, SSL3</td><td>Stuart</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2 incubateur, Hera Cell 150</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microtome à lames vibrantes, VT1000S</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Macroscope confocal, TCS LSI</td> Contrôleur de température <td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>PeCon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>CO2-contrôleur</td><td>PeCon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>, M205 C</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux de travail, courbés, émoussés/émoussés</td><td>Medicon</td><td>03.03.17</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux à iris fins trempés, droits, tranchants/tranchants</td><td>FST</td><td>149090-11</td><td></td></tr><tr><td>Pinces Dumont #3 et #5</td><td>FST</td><td>11293-00 et 11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Lames d’injecteur de vibratome/simple tranchant</td><td>Leica Microsystems</td><td>39053250</td><td></td></tr><tr><td>Manche de scalpel standard #3 solide</td><td>FST</td><td>10003-12</td><td></td></tr><tr><td>Lame chirurgicale #15</td><td>Swann-Morton</td><td>205</td><td></td></tr></tbody></table>

ex vivo imaging postnatal du cervelet granules migration cellulaire utilisant confocale macroscopie

Ex Vivo Imaging of Postnatal Cerebellar Granule Cell Migration Using Confocal Macroscopy

Au cours du développement postnatal, les cellules granulaires immatures (interneurones excitateurs) présentent une migration tangentielle dans la couche granulaire externe, et ensuite la migration radiale dans la couche moléculaire et la couche de cellules de Purkinje pour atteindre la couche granulaire interne du cortex cérébelleux. Par défaut dans les processus migratoires induit soit la mort cellulaire ou à la mauvaise des neurones, conduisant à des déficits dans diverses fonctions du cervelet. La migration de cellules granulaires centripète implique plusieurs mécanismes, tels que la chimiotaxie et la dégradation de la matrice extracellulaire, pour guider les cellules vers leur position finale, mais les facteurs qui régulent la migration cellulaire dans chaque couche corticale ne sont que partiellement connu. Dans notre procédé, des tranches cérébelleuses aigus sont préparés à partir P10 rats, les cellules granulaires sont marqués avec un marqueur cytoplasmique fluorescent et les tissus sont mis en culture sur des inserts à membranes de 4 à 10 heures avant de commencer la surveillance en temps réel de la migration cellulaire par macroscopie confocale à 37 ° C dans leprésence de CO 2. Au cours de leur migration dans les différentes couches corticales du cervelet, les cellules granulaires peuvent être exposés à des agonistes de neuropeptides ou antagonistes, inhibiteurs de la protéase, inhibiteurs d&#39;effecteurs intracellulaires ou même des substances toxiques comme l&#39;alcool ou le méthylmercure pour enquêter sur leur rôle possible dans la régulation de la migration neuronale .

Dans le cervelet postnatale précoce, GC présentent d&#39;importants changements dans leur mode et de la vitesse de la migration comme ils traversent différentes couches corticales 1 (figure 1). Cet article donne des exemples de résultats qui peuvent être obtenus par l&#39;étude de la migration de GC dans leur milieu naturel cellulaire. P10 rat des tranches de tissu cérébelleux marqués avec un colorant fluorescent vert sont examinés sous un macroscope confocal (figure 3A) et nous montrent que GC migrer radialement dans le ML avec une vitesse moyenne de 18 um / h (figure 3B, C). À ce jour, le rôle des interactions / communications entre les cellules neuronales et gliales y compris les facteurs réglementaires et des mécanismes moléculaires impliqués dans le contrôle de la migration cellulaire dans chaque couche corticale sont en grande partie inconnus. Par conséquent, la question principale est d&#39;identifier les neuropeptides, les neurotransmetteurs, neurotrophines et des composants de la matrice extracellulaire qui pourraient jouer un rôle dans ces corticale couche spécifiquechangements fic de la vitesse au cours de leur processus de migration. Hypophysaire adénylate cyclase polypeptide activateur (PACAP) est détectée principalement dans la PCL, mais également dans le ML et le IGL pendant les deux premières semaines après la naissance chez les rongeurs 7,10,11. Application de PACAP38 (10 -6 M) dans le milieu de culture a entraîné une diminution de la vitesse de 79% de la GC dans la ML. Par exemple, la vitesse de migration de GC dans le ML est passé de 11,9 um / h dans des conditions de contrôle à 2,5 um / h après l&#39;administration de PACAP38 (figure 4A). l&#39;activateur du plasminogène de type tissulaire (tPA) est un membre de la cascade protéolytique conduisant à la dégradation de la matrice extracellulaire des composants (EM), tels que des molécules d&#39;adhésion cellulaire ou de la laminine 12,13. tPA et le plasminogène, un substrat de tPA, sont détectées dans les couches corticales pendant le développement du cervelet 14,15,16 postnatal. L&#39;administration de PAI-1 (10 -7 M), un inhibiteur endogène de tPA, réduit de 78% le GCla migration dans le ML. Par exemple, GC réduit la vitesse de migration dans le ML de 19,2 um / h dans des conditions de contrôle à 4,2 um / h après l&#39;addition de PAI-1 (figure 4B). Ces résultats indiquent que PACAP exerce un effet inhibiteur direct sur les mouvements de GC et que la serine protease de tPA facilite la migration de GC dans la ML du cervelet de rat en développement. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig1.jpg" /> Figure 1: représentation 3D de la migration de GC dans le cortex cérébelleux postnatale. 1-4, Extension du processus de GC et de la migration tangentielle dans le EGL. 5, la migration radiale dans le ML long des fibres gliales Bergmann. 6, phase stationnaire transitoire dans le PCL. 7, la migration des cellules gliales indépendante radiale dans le IGL. 8, achèvement de migration de GC GC dans la IGL, de cellules granulaires, en rouge;. EGL, La couche granulaire externe; B, Bergmann glie, en violet foncé; G, cellule de Golgi, en jaune; cf, fibres grimpantes, en bleu; g, cellules granulaires postmigratory, en vert clair; IGL, couche granulaire interne; mft, fibres moussues terminal, en vert foncé; ML, couche moléculaire; P, cellule de Purkinje, en violet clair; couche de cellules PCL, Purkinje. Ce chiffre a été modifié depuis 5. <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig2.jpg" /> Figure 2: Ex vivo culture de P10 tranches de cervelet (A) cervelet disséqués à partir P10 rat.. Barre d&#39;échelle = 6 mm. (B) La photographie de la vie de 180 um d&#39;épaisseur tranche cérébelleuse travers stéréomicroscopie. Barre d&#39;échelle = 3 mm. (C) Aun plus fort grossissement, les quatre couches corticales (EGL, ML, PCL, IGL) du cervelet sont déjà distinguées. Barre d&#39;échelle = 1 mm. (D) Après marquage fluorescent, des coupes de tissu sont placés sur des inserts de culture (diamètre 24 mm) dans une plaque à 6 puits. (E) de la représentation schématique d&#39;un insert de culture avec la membrane de polyester culture de tissu traité. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52810/52810fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît, cliquez ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig3.jpg" /> Figure 3: la migration dynamique de GC dans les couches corticales du P10 de rat cervelet (A) Vue Macroconfocal (xyz, de projection 2D) d&#39;une tranche P10 cérébelleux de rat dans lequel GC sont marqués avec un colorant fluorescent cytoplasmique verte.. La barre d&#39;échelle = 75 um. (B) d&#39;imagerie time-lapse montrant GCles mouvements dans le ML par macroscopie confocale pour 4 heures dans des conditions de contrôle. Asterisk symbole (*) marque le soma GC. Temps écoulé (en minutes) est indiqué en bas de chaque photomicrographie. La barre d&#39;échelle = 10 um. (C) des changements séquentiels dans la distance parcourue par GC soma. <img alt="Figure 4" src="/files/ftp_upload/52810/52810fig4.jpg" /> Figure 4:. Effet de l&#39;inhibiteur de neuropeptide et protease de la migration de GC (A) GC a été suivi dans la ML par macroscopie confocale pendant 2 heures dans des conditions de contrôle et ensuite pendant 2 heures en présence d&#39;un polypeptide adénylate-activation de l&#39;hypophyse adénylate (PACAP). (B) GC a été suivi dans la ML par macroscopie confocale pendant 2 heures dans des conditions de contrôle et ensuite pendant 2 heures en présence d&#39;inhibiteur de l&#39;activateur du plasminogène-1 (PAI-1).

Au cours du développement postnatal du cervelet, les cellules granulaires immatures provenant de la zone germinale présentent des modalités de migration distinctes pour atteindre leur destination finale et établir des réseaux neuronaux. Ce protocole décrit la préparation des coupes cérébelleuses et l’approche macroscopique confocale utilisée pour étudier les facteurs qui régulent la migration neuronale.

Ex Vivo Imaging postnatal du cervelet granules migration cellulaire utilisant confocale Macroscopie

During postnatal development, immature granule cells (excitatory interneurons) exhibit tangential migration in the external granular layer, and then ...

L'objectif général de cette procédure est de visualiser des neurones en migration dans des tranches de cerveau vivantes. Pour ce faire, on commence par disséquer le cervelet d'un rat âgé de 10 jours (P10). Les étapes suivantes consistent à préparer des tranches aiguës de cervelet et à marquer les neurones à l'aide d'une sonde fluorescente.Ensuite, l'expérience en lapse de temps est réalisée par imagerie confocale macro ou microscopie confocale. La dernière étape consiste à suivre les neurones dans les films obtenus. En définitive, la microscopie ex vivo est utilisée pour montrer le rôle de facteurs endogènes ou de substances toxiques qui régulent la migration neuronale.L'avantage principal de cette technique par rapport aux méthodes existantes telles que la microscopie confocale réside dans le fait que l'imagerie macro-confocale augmente le champ de vision, permettant ainsi d'observer directement des tranches cérébrales placées sur l'insert inguinal. J'ai eu l'idée de cette méthode pour la première fois lorsque j'ai éprouvé des difficultés à transférer et stabiliser des tranches cérébrales pour des expériences de microscopie confocale. Commencez par accéder au crâne de la tête d'un raton décéphalé âgé de 10 jours (P10), à l'aide de ciseaux à iris fins, effectuez délicatement deux incisions latérales partant de la base jusqu'à la région rostrale du crâne. Ensuite, retirez le crâne disséqué à l'aide de deux pincettes n°3, en rompant toute adhérence entre le cerveau et le crâne.Maintenant, prélevez le cerveau à l’aide de l’extrémité cuillère d’une spatule et placez-le dans une boîte de Pétri de 35 millimètres contenant deux millilitres de HBSS froid sur de la glace. Ensuite, sous un microscope stéréo, isolez le cervelet du cerveau par des incisions en D à l’aide de deux pincettes n°3. Transférez le cervelet avec la spatule dans une nouvelle boîte contenant du tampon glacé.Ensuite, à l’aide des mêmes outils, retirez et jetez le cordon rachidien résiduel et la membrane pelliculaire. Préparez un manche de scalpel solide n°3 muni d’une lame chirurgicale n°15. À l’aide de la lame et sous microscope stéréo, sectionnez le cervelet entre le vermis et l’hémisphère droit.Maintenant, au vibratome, déposez une goutte de colle de cyanoacrylate sur le disque d'échantillon et attendez de 15 à 25 secondes pour que les vapeurs du solvant se dissipent avant de transférer le cervelet sur le disque. Ensuite, fixez le bord du cervelet au disque d'échantillon et attendez 10 secondes. Maintenant, à l’aide du manipulateur, insérez le disque d'échantillon dans le bac tampon de manière à ce que l’axe transversal du cervelet soit perpendiculaire au porte-lame.Veillez à fixer le disque à l'aide d'une clé en aluminium. Ensuite, recouvrez soigneusement le cervelet avec du HBSS et placez de la glace pilée dans le bain réfrigérant. Pour découper l'échantillon, positionnez une lame nettoyée de manière à ce que son tranchant se trouve juste derrière le bord postérieur de l'échantillon.Définissez ce point comme position de départ pour l’imprégnation. Utilisez ensuite la commande d’avancement pour définir le point final juste après le bord avant de l’échantillon. Réglez maintenant l’épaisseur de coupe à 180 micromètres.Ensuite, réglez la vitesse de découpage à 2,5 et la fréquence à huit, puis commencez à découper l'échantillon. Récoltez jusqu'à cinq tranches par cervelet. Prélevez chaque section à l’aide d’une pipette en verre large tronquée.Transférez les sections dans une boîte contenant du HBSS froid sur de la glace. Après avoir collecté les tranches sous un microscope stéréo, retirez soigneusement les méninges à l’aide de deux pincettes de taille cinq. En outre, séparez délicatement les LOE pour faciliter le chargement de la sonde.Après avoir sectionné l'échantillon, utilisez une pipette large tronquée pour le transférer, avec du HBSS, dans une plaque à six puits, en plaçant jusqu'à trois sections par puits. Ensuite, après avoir vidé le milieu de chaque puits chargé, ajoutez cinq millilitres de solution de chargement contenant 10 micromoles du colorant fluorescent, protégez les échantillons de la lumière en recouvrant la plaque d'une feuille d'aluminium. Puis placez la plaque sur un agitateur réglé à 35 tr/min.Laisser la plaque incuber pendant 10 minutes à température ambiante afin que le colorant marque les puits cellulaires. Transférer ensuite les tranches comme précédemment sur la membrane d'un insert transwell possédant des pores de trois microns. Aspirer ensuite le milieu de chargement, en ne laissant que les tranches.Retirez maintenant l'insertion et les tranches afin de remplir la cavité avec 1,9 millilitre de DMEM. Remettez ensuite l'insertion en place et ajoutez 100 microlitres supplémentaires de DMEM pour recouvrir les tissus. Incubez cette préparation pendant deux heures, après quoi les cellules granulaires deviendront visibles.Transférez la plaque sans son couvercle dans une chambre environnementale avec un débit de gaz constant sur un microscope confocal. Ensuite, placez une lame de verre sur l'insert de la plaque du microscope confocal pour les expériences en enregistrement temporel. Laissez les cellules s'incuber dans la chambre pendant deux heures supplémentaires avant de poursuivre.Pour visualiser la migration des cellules granulaires dans les tranches de tissu, éclairez le prélèvement avec une lumière de 488 nanomètres et utilisez un objectif sec de deux x. Détectez les émissions fluorescentes comprises entre 500 et 530 nanomètres à l’aide d’ImageJ. Pour chaque image du film en accéléré, effectuez une projection Zack en mode écart type, puis ajustez le contraste et les niveaux de luminosité de chaque image afin que les cellules granulaires marquées soient facilement visibles. Sélectionnez ensuite le module de suivi manuel dans le menu d’analyse des particules.Utilisez le plugin pour cliquer sur le point central de chaque corps cellulaire étiqueté tout au long de la séquence d'images en lapse de temps. Ensuite, exportez les données brutes de suivi vers un tableur pour une analyse ultérieure. Réorganisez les données brutes exportées d'Image J à l'aide d'un outil maison intelligent qui identifie chaque cellule et les positions associées à l'aide du programme.Calculez la distance totale parcourue et la vitesse moyenne de migration pour chaque cellule. Dans le cervelet postnatal précoce, les cellules granuleuses présentent des changements importants dans leur mode et leur vitesse de migration lorsqu'elles traversent différentes couches corticales. Les cellules granuleuses marquées au CTG dans des tranches de tissu cérébelleux de rat PM ont été examinées.Comme décrit, les cellules granuleuses ont migré radialement dans la couche moléculaire avec une vitesse moyenne de 18 micromètres par heure. Un autre prélèvement a ensuite été utilisé pour tester l'effet de médicaments censés modifier la vitesse de migration. L'ajout de pay cap 38 dans le milieu de culture a entraîné une diminution de 79 % de la vitesse des cellules granuleuses dans la couche moléculaire, soit une baisse à 2,5 micromètres par heure.L'administration de PI un, un inhibiteur du TPA endogène, a réduit la vitesse de migration des cellules granulaires de 78 % par rapport à la vitesse témoin, soit 4,2 micromètres par heure. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de suivre les cellules dans le ballon théorique en développement. Lorsque vous tentez cette procédure, il est important de se rappeler de maintenir des paramètres environnementaux appropriés et constants, essentiels à la migration cellulaire après son développement.Cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine des neurosciences pour explorer les processus sensoriels dans le cerveau.

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Nous décrivons un protocole en temps réel videoimaging de la migration neuronale dans le cerveau antérieur de la souris. La migration de viralement étiquetés ou greffés précurseurs neuronales a été enregistré en direct en utilisant des tranches aiguës imagerie à grand champ fluorescent avec un intervalle d'acquisition relativement rapide pour étudier les différentes phases de la migration cellulaire, y compris les durées des phases stationnaire et la migration et la vitesse de migration.

Imagerie time-lapse de la migration des neuroblastes en tranches aiguës du cerveau antérieur souris adultes

Source : Chan, U., et al., Utilisation de l’électroporation postnatale in vivo pour étudier la morphologie des neurones granulaires cérébelleux et le développement des synapses. J. Vis. Exp. (2021).Cette vidéo démontre l’analyse du développement des neurones granulaires cérébelleux en imageant des tranches de tissu cérébral préfixées de souris marquées avec une protéine fluorescente, Capturer des images haute résolution de la pile Z avec un microscope confocal et mesurer les paramètres...

Visualisation de la synaptogenèse des neurones granulaires cérébelleux à différents stades de développement

Source : Bénard, M., et al. Ex Vivo Imagerie de la migration cellulaire granulaire cérébelleuse postnatale à l’aide de la macroscopie confocale. J. Vis. Exp. (2015)Cette vidéo présente une méthode macroscopique confocale pour suivre la migration ex vivo des cellules granulaires dans des tranches cérébelleuses à partir de cerveaux de rats postnatals.

Imagerie ex vivo de la migration postnatale des cellules granulaires cérébelleuses à l’aide de la macroscopie confocale

la migration des neuroblastes est un événement fondamental dans la neurogenèse postnatale. Nous décrivons un protocole pour l'étiquetage efficace des neuroblastes par électroporation in vivo postnatale et la visualisation ultérieure de leur migration à l'aide de l'imagerie time-lapse de tranches de cerveau de courte durée. Nous incluons une description pour l'analyse quantitative de la dynamique des neuroblastes par suivi vidéo.

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Morphogenèse neuronale et la migration sont des événements cruciaux qui sous-tendent le développement normal du cerveau. Ici, nous décrivons des méthodes pour manipuler génétiquement les neurones granulaires du cervelet en culture et le cervelet en développement pour l'évaluation de la morphologie et les caractéristiques de migration des neurones.

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La couche de granules cérébelleux externe est le site de la plus grande amplification de transit dans le cerveau en développement. Ici, nous présentons un protocole de cibler la modification génétique de cette couche au sommet de la prolifération utilisant ex électroporation et la culture de tranches de cervelet vivo à partir embryonnaires Jour 14 embryons de poulet.

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L&#39;imagerie confocale temporelle des neurones migrateurs dans la culture de tranches organotypiques du cerveau embryonnaire de souris en utilisant<em&gt; Dans Utero</em&gt; Electroporation

Ici, nous fournissons une méthode fiable et peu coûteuse pour générer organotypiques électroporation cerveau d’embryons de souris appropriés pour la microscopie confocale et techniques d’imagerie en direct.

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Découvrez l'imagerie ex vivo du cervelet postnatal pour visualiser la migration des cellules granulaires par macroscopie confocale. Cette méthode permet d'étudier les facteurs endogènes régulant la migration neuronale.

Ex Vivo Imaging postnatal du cervelet granules migration cellulaire utilisant confocale Macroscopie

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