Tranche Patch Clamp Technique d’analyse de plasticité induite par l’apprentissage

Bonjour, je m’appelle Dai Mitsushima. Ici, nous allons vous montrer comment faire des coupes de cerveau chez des animaux dressés en comparant les données de patch clamp chez des animaux non entraînés. Nous pouvons analyser la plasticité synaptique induite par l’apprentissage.

Bonjour, je m’appelle Hiroyuki Kida. Dans cette expérience, nous avons étudié le neuromécanisme du fonctionnement du moteur en utilisant le test de la tige du rotor. Le test de la tige du rotor est largement utilisé pour évaluer la cognition motrice des rongeurs.

L’avantage de cette méthode est que nous pouvons modifier le niveau de découverte pendant l’essai en augmentant la vitesse du rotateur. Test de tige de rotor. Avant la tâche du moteur, l’appareil de la tige du rotor doit être réglé en mode d’accélération de 4 à 40 tr/min pendant 300 secondes.

Des rats ont été amenés à effectuer dix tentatives pour chaque test. Dans l’intervalle de temps entre les tentatives était de 30 secondes. Lors de la première séance d’entraînement, les rats tombent généralement de la tige, même à basse vitesse et marchent parfois dans la mauvaise direction.

Après avoir répété l’entraînement, cependant, le rat peut marcher à une vitesse plus élevée. En mesurant la latence sur la tige, nous pouvons estimer les performances d’apprentissage de la compétence par le rat. Ici, nous pouvons voir les résultats du test de la tige du rotor.

Comme le montre cette figure, deux jours d’entraînement suffisent pour acquérir la motricité. Par rapport à la latence lors du premier essai, l’analyse post-hoc a montré une amélioration significative lors de l’essai final des jours d’entraînement. En mesurant la latence sur la tige, nous pouvons estimer les performances d’apprentissage de la compétence par le rat.

Ensuite, nous vous montrerons un test d’évitement inhibiteur. Ce test est utile pour analyser les performances d’apprentissage contextuel. L’appareil d’évitement inhibiteur se compose de côtés lumineux et sombres séparés par une trappe.

Au cours de la séance d’entraînement, les rats sont placés dans la zone éclairée et on leur donne un court laps de temps pour s’acclimater à l’environnement. Une fois la porte ouverte, les rats sont libres d’entrer dans la zone sombre à volonté. En entrant dans la zone sombre, la porte est fermée et les rats reçoivent un léger choc électrique pendant deux secondes.

Après avoir été renvoyés dans leurs cages pendant 30 minutes à la fin de l’essai, les rats sont à nouveau placés dans la zone éclairée de l’appareil. Trente minutes après le choc, les rats entraînés ont constamment montré une latence plus longue avant d’entrer dans la zone sombre. Ici, nous pouvons voir les résultats du test d’évitement inhibiteur.

Après le choc électrique, les rats ont appris à éviter la zone sombre et à rester du côté éclairé, ce qu’ils ne préféreraient pas normalement. Cette tendance à éviter le côté obscurci indique l’acquisition de souvenirs contextuels. Tranches de cerveau post-entraînement.

Avant l’incision, nous refroidissons tous les ciseaux, hémostats et béchers avec de la glace pilée. Vous pouvez voir ici notre préparation à la dissection. La dissection cérébrale doit être effectuée le plus rapidement possible.

Après une anesthésie profonde, le rat est placé dans un plateau peu profond avec de la glace pilée et une incision est pratiquée pour ouvrir la cavité abdominale. Après l’incision du diaphragme, une autre incision latérale est pratiquée. Pour ouvrir la cavité thoracique, le cartilage costal doit être aggloméré à l’aide d’un hémostat.

Après avoir exposé le cœur, une aiguille en acier inoxydable de calibre 18 est insérée dans la partie postérieure du ventricule gauche. La pointe de l’aiguille doit être visible à travers la paroi de l’aorte. Après avoir coupé le pavillon droit, la perfusion commence.

Assurez-vous que l’aiguille et la seringue sont d’abord remplies d’un tampon de dissection glacé gazeux. Toutes les bulles d’air doivent également être éliminées avant la perfusion. Tout d’abord, coupez à l’arrière du crâne.

Faites ensuite une coupe latérale, suivie d’une coupe centrale pour exposer le cerveau. Lors de la dissection, le cerveau doit être placé dans un tampon glacé bouillonnant pendant cinq minutes. Avant de procéder à la dissection, le papier filtre doit être humide à l’aide d’un tampon glacé.

Ensuite, le cerveau est placé sur une scène en acier inoxydable glacée. L’angle de l’étape de coupe est crucial pour garantir un angle de coupe correct pour la tranche de cerveau. Un angle incorrect pourrait potentiellement couper les neurones pyramidaux cibles.

Après la coupe, une goutte de superglue doit être placée sur la platine du vibratone. Pour assurer une adhérence étanche, l’excès de tampon de dissection doit être éliminé à l’aide d’un morceau de papier filtre. À l’aide du vibratone, de fines tranches de cerveau peuvent être maintenues dans un tampon glacé bouillonnant.

Notre zone cible est le cortex moteur primaire. La zone cérébrale cible peut être coupée à l’aide de ciseaux à iris. La chambre d’interface peut être fabriquée à l’aide d’un récipient alimentaire en plastique.

Le couvercle de la chambre d’interface est nécessaire pour contenir le gaz. Les coupes sont observées à l’aide d’un microscope infrarouge-DIC. Ici, nous pouvons voir un exemple de neurones de couche 2/3 dans le cortex moteur primaire.

Les pipettes d’enregistrement de patchs sont remplies de la solution intracellulaire appropriée. La solution pour l’analyse de la pince de courant est différente de l’analyse de la pince de tension. Des résultats représentatifs.

La technique de la pince de courant est utile pour analyser les propriétés intrinsèques des cellules. Après l’entraînement à la tige du rotor, nous avons pu obtenir les données de pince de courant à partir des neurones de couche 2/3 du cortex moteur primaire. Le panneau A indique les traces typiques induites par les injections de courant.

Le panneau B indique la relation entre le courant injecté et le nombre de pointes. Les rats entraînés d’un jour ont induit moins de pointes, tandis que les rats entraînés pendant deux jours ont induit beaucoup plus de pointes que les rats non entraînés. Comme on peut le voir dans les panneaux inférieurs, les rats entraînés d’un jour présentaient un potentiel de repos plus faible, un seuil de pointe plus élevé et une post-hyperpolarisation plus profonde.

Les rats entraînés pendant deux jours ont montré un potentiel de repos et une résistance membranaire plus élevés. La technique de la pince de tension est utile pour analyser la plasticité synaptique induite par l’apprentissage. Ici, nous pouvons voir des données de neurones CA1 après un entraînement contextuel.

Nous avons obtenu des courants post-synaptiques miniatures à partir de neurones CA1 induits par des vésicules uniques de glutamate ou de GABA. Les panneaux A et B montrent des traces représentatives de courant post-synaptique miniature. En présence de tétrodotoxine, des EPSC miniatures à moins 16 millivolts et des IPSC miniatures à zéro millivolts ont été mesurés séquentiellement dans les mêmes neurones.

Le panneau C montre des graphiques bidimensionnels des amplitudes miniatures EPSC et IPSC miniatures chez des rats non entraînés, entraînés, non appariés et ambulants. Le panneau D montre les tracés des fréquences miniatures. Comme on peut le voir dans les panneaux inférieurs, les entraînements contextuels ont considérablement renforcé les synapses excitatrices et inhibitrices, favorisant la diversité des entrées synaptiques vers les neurones.

En résumé, la technique de la pince de courant est utile pour analyser les changements induits par l’apprentissage dans les propriétés cellulaires. De plus, la technique de la pince de tension est un outil puissant pour analyser la plasticité induite par l’apprentissage au niveau des synapses excitatrices et inhibitrices. Les résultats détaillés de ces analyses sont disponibles dans les publications suivantes.