Name: Tranche Patch Clamp Technique d’analyse de plasticité induite par l’apprentissage (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-11T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 56 s
Description: Apprenez la technique de patch clamp sur tranche pour analyser la plasticité synaptique induite par l'apprentissage chez le rat. Cette méthode électrophysiologique permet d'étudier les propriétés neuronales et les mécanismes de la mémoire.

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Nous tenons à remercier m. Paw-Min-Thein-Oo, Dr. Han-TREHET-Zin et Mme H. Tsurutani pour leur assistance technique. Ce projet a bénéficié de subventions pour jeunes scientifiques (H.K. et Y.S.), B de la recherche scientifique (D.M.), C de la recherche scientifique (D.M.) et en domaines innovants (D.M.), depuis le ministère de l’éducation, Sports, Culture, Science, la recherche scientifique et Technologie du Japon.

tous les logement des animaux et des interventions chirurgicales étaient conformes aux lignes directrices pour l’Animal Experimentation de Yamaguchi University School of Medicine et ont été approuvés par le Comité emploi de Yamaguchi et d’institutionnels animalier Université.
 1. animaux <ol><li>utiliser des rats Sprague-Dawley mâles âgés de 4 à 5 semaines (28 à 31 jours d’âge).</li>
	<li>Abritent les rats dans des cages en plastique individuels (40 cm × 25 cm × 25 cm) maintenues à une température constante (23 ° C ± 1 ° C) sous un cycle lumière/obscurité de 12 h. Donner des rats ad libitum accès à l’eau et de nourriture.</li>
</ol> 2. Essais de tige rotor <ol><li>d’enquêter sur la motricité, l’apprentissage, sous réserve de tous les rats à l’épreuve de tige rotor (diamètre de la tige 7 cm ; largeur de voie 8,9 cm ; hauteur de chute 26,7 cm) pour 1 ou 2 jours consécutifs ( Figure 1 a dans Kida et al., 2016 7). Exécuter la tâche dans une pièce calme, température contrôlée (23 ± 1 ° C). Ne pas déranger ou gérer des rats avant le test.</li>
	<li>Régler la tige du rotor à mode d’accélération, qui augmente linéairement de 4 rotations/min à 40 rotations/minute (8 min/π à π/min 80) en 5 min.</li>
	<li>Mettre le rat sur la tige de rotation au repos. Vérifiez que tous les membres sont sur la tige.</li>
	<li>Mesurer la latence à l’automne de la tige rotative pour évaluer la performance du moteur à.</li>
	<li>Permettre à tous les rats 10 essais (essais) avec des intervalles de 30 s.</li>
	<li>Si le rat tombe de la tige rotative, posez-le sur la tige après un intervalle de 10-20 s.</li>
	<li>Sacrifier le rat avec une surdose de pentobarbital (400 mg/kg) 30 min après la dernière épreuve. Injecter des rats témoins non formés avec la même dose d’anesthésie dans leurs cages maison.</li>
</ol> 3. Essai d’évitement inhibiteur <ol><li>d’enquêter sur l’apprentissage contextuel, sujet rats à un test d’évitement inhibitrice (IA) ( Figure 1 dans Mitsushima et al., 2011, 2013 10 , 11) Eviter des expériences épisodiques sur le jour de l’expérience comme entrer en contact avec d’autres, changement de cage ou de nettoyage. Exécuter la tâche dans une pièce calme, température contrôlée (23 ± 1 ° C). 
	Remarque : L’appareil de musculation IA est une boîte acrylique deux-chambré (longueur 33 cm, largeur 58 cm ; hauteur 33 cm). Il a un bon côté éclairé et un côté dark choc qui sont séparées par une trappe ( Figure 1).</li>
	<li>Placer le rat dans le côté sécuritaire (éclairé) de la zone éclairée. Gérer le rat doucement sans stress.</li>
	<li>Attendre une courte période (10 à 20 s) s’acclimater le rat pour l’environnement.</li>
	<li>Ouvrir la porte coulissante pour permettre le rat entrer dans la zone sombre à volonté.</li>
	<li>Mesurer la latence (s) avant le rat ne pénètre dans le côté obscur roman de la boîte. La latence du premier essai représente le rat &#39; s la performance avant l’entraînement.</li>
	<li>Après l’entrée dans le côté obscur, fermer la porte et appliquer un choc brouillés pied électrique (2 s, 1,6 mA) par l’intermédiaire de tiges d’acier électriques définie dans le plancher de la boîte. Permettre des rats de portique d’explorer l’appareil de musculation pendant 1 min sans être choqué. Maison des rats non appariés dans une cage de choc illuminé pendant plusieurs jours et tout à coup donnent le choc sans expériences épisodiques. Manipulez avec douceur sans stress dans tous les groupes.</li>
	<li>Garder chaque rat dans la zone sombre pour 10 s avant de la retourner à la maison cage.</li>
	<li>À 30 min après le choc du pied, placez à nouveau le rat dans le côté lumineux de la boîte. Mesurer la latence pour entrer dans le côté obscur.</li>
	<li>Retourner le rat à la cage.</li>
	<li>À 60 min après le choc, sacrifier le rat avec une surdose de pentobarbital (400 mg/kg). Gérez le rat doucement et injecter l’anesthésie par voie intrapéritonéale. Chez les rats de témoins non formés, injecter l’anesthésie dans leur maison sans l’expérience décrite ci-dessus.</li>
</ol> 4. Tampon de dissection <ol><li>dissoudre les cristaux de 0,195 g NaH 2 PO 4-2 H 2 O, 0,188 g KCl, g 0,074 CaCl 2, g 1,423 MgCl 2-6 H 2 O et 12,579 g de chlorure de choline dans l’eau ultrapure (900 mL à 950 mL) . Voir le tableau 1.</li>
	<li>Dissoudre les cristaux d’acide ascorbique 2,340 g, sel de sodium de l’acide pyruvique 0,342 g, g 2,100 NaHCO 3 et 4,500 g de glucose.</li>
	<li>Ajouter de l’eau à 1000 mL. La gamme de l’osmolalité se situera entre 290 mOsm/L et 300 mOsm/L. Adjust osmolalité en ajoutant de l’eau ultrapure, si c’est sur la plage.</li>
	<li>La solution avec 5 % de CO 2 de bulle / mélange à des températures glacées pendant 5 min avant utilisation de gaz 95 % O 2.</li>
</ol> 5. Liquide céphalo-rachidien artificiel (FSCA) <ol><li>dissoudre des cristaux de 0,186 g KCl, 6,700 g NaCl et 0,156 g NaH 2 PO 4-2 H 2 O en eau ultrapure (900 mL à 950 mL). Voir le tableau 2.</li>
	<li>Bulle avec le mélange de gaz pendant 5 min.</li>
	<li>Dissoudre les cristaux de 1,800 g glucose et g 2,184 NaHCO 3 et ajouter 4 mL MgCl 2 et 4 mL CaCl 2 de 1 M en stock solutions.</li>
	<li>Ajouter de l’eau à 1000 mL. La gamme de l’osmolalité se situera entre 290 mOsm/L et 295 mOsm/L. Adjust osmolalité en ajoutant de l’eau ultrapure, si c’est sur la plage.</li>
	<li>Bulle avec le préalable de mélange gaz utiliser.</li>
</ol> 6. Des solutions intracellulaires <ol><li>pour les enregistrements de courant-clamp (tableau 3), dissoudre 0,0746 g KCl, solution dans 180 mL d’eau ultrapure mère 6,089 g K-gluconate, 0,476 g HEPES, g 0,0456 EGTA et 500 µL du MgCl 2 de 1 M (ajuster le pH à 7,2 avec KOH).
	<ol><li>Ajouter g 0,4408 Na 2 - ATP, g 0,0418 Na 3 - GTP et g 0,510 Na-phosphocréatine. Ajouter de l’eau à 200 mL et ajuster le pH à 7,35 avec KOH.</li>
		<li>Ajuster l’osmolalité à environ 290 mOsm/L en ajoutant de l’eau ultrapure.</li>
		<li>Store en aliquotes de 1 mL dans le congélateur (-30 ° C).</li>
	</ol></li> <li>Pour les enregistrements de voltage clamp (tableau 4), dissoudre 5,244 g CsMeSO 3, g 0,672 CsCl, 0,476 g HEPES, g 0,0456 EGTA et 500 µL du MgCl 2 de 1 M en stock solutions dans 180 mL d’eau ultrapure. Ajuster le pH à 7,2 avec CsOH. Les enregistrements mEPSP et mIPSP, utilisez concentration modifiée de 5,814 CsMeSO 3 et g 0,252 CsCl pour ajuster le potentiel d’inversion du récepteur GABA A réponse 11.
	<ol><li>Ajouter g 0,4408 Na 2 - ATP, g 0,0418 Na 3 - GTP et g 0,510 Na-phosphocréatine. Ajouter de l’eau à 200 mL et ajuster le pH à 7,35 avec CsOH.</li>
		<li>Ajuster l’osmolalité à environ 290 mOsm/L en ajoutant de l’eau ultrapure.</li>
		<li>Store en aliquotes de 1 mL dans le congélateur (-30 ° C).</li>
	</ol></li></ol> 7. Tranchez la préparation <ol><li>préalable à sacrifier, de refroidissement tous les outils de dissection avec glace pilée ( Figure 2 a). Ajouter environ 500 mL d’eau froide dans le récipient de la glace pilée pour augmenter la surface de contact. Cette procédure a été décrit précédemment 10 , 11 , 12. 
	Remarque : Les outils ici sont : grands ciseaux, ciseaux iris, une spatule, une spatule micro, forceps, pince à épiler, un bécher de 200 mL en acier inoxydable, une lame pour cerveau faucheuse, une seringue de perfusion cardiaque 120 mL remplie avec le tampon de dissection traité avec le mélange de gaz, un tube de silicone (20 cm) relié à une aiguille de calibre 18 aplatie, un stade de dissection du cerveau en acier inoxydable (épaisseur = 3 mm, ϕ = 12 cm) et une étape de montage pour le vibratome (ϕ = 5 cm).</li>
	<li>Sacrifier le rat 30 min après avoir terminé le paradigme comportemental par anesthésier il avec un surdosage de pentobarbital (400 mg/kg de poids corporel). Effectuer la préparation de tranche rapidement pour que les tranches soient aussi sains que possible 10 , 11 , 12. Le cerveau extrprotocole d’action respecte toutes les normes vétérinaires pour notre Université.</li>
	<li>Remplir une seringue de 120 mL avec le tampon de dissection glacee (tableau 1) barboter avec un 5 % CO 2 / 95 % O 2 mélange de gaz. Éliminez les bulles d’air avant perfusion.</li>
	<li>Après avoir exposé le cœur, introduire l’aiguille dans la partie postérieure du ventricule gauche.</li>
	<li>Perform transcardial perfusion du cerveau manuellement à l’aide de la seringue. Plus gros rats nécessitent plus tampon de dissection pour perfusion. Submerger le cerveau avec le tampon de dissection glacée pendant 5 min. bulle le tampon en permanence pendant la submersion.</li>
	<li>Couper le côté postérieur du cerveau à un parallèle de l’angle de l’orientation dendritique de la région corticale de cible à l’aide d’une lame. Puisque le cerveau est debout sur la scène de dissection avec le bas de l’extrémité coupée, l’angle initial détermine l’angle de toutes les tranches de cerveau ultérieures. Cette étape est cruciale ( Figure 2 b). Un angle incorrect peut couper à travers les neurones pyramidaux cible. 
	Remarque : Les outils ici sont : une lame pour coupe de cerveau, un filtre en papier (ϕ = 10 cm), une étape de dissection du cerveau en acier inoxydable (épaisseur = 3 mm, ϕ = 12 cm), une spatule, une colle, un compte-goutte et une étape de montage pour le vibratome (ϕ = 5 cm).</li>
	<li>Coupe coupes de cerveau coronale épais de 350 µm en utilisant un vibratome. Remplir la chambre de dissection avec tampon glacee barboter avec un 5 % CO 2 / 95 % O 2 gaz mélange ( Figure 2). La mémoire tampon de bulle en permanence pendant la tranche de cerveau.</li>
	<li>Trim à la périphérie de la zone de la cible à l’aide de ciseaux iris.</li>
	<li>Laver les tranches taillées doucement à température ambiante FSCA barboter avec 5 % de CO 2 / 95 % O 2 (tableau 2).</li>
	Tranches de <li>maintenir la taillée dans une chambre d’interface jusqu'à ce que l’enregistrement soit effectué ( Figure 2D et E). Incubation pendant 1 h dans l’hémicycle améliore l’état des cellules, mais les phénotypes changent si les tranches sont incubés pendant plus de 10 heures. Fermer le couvercle de la chambre pour encadrer les gaz et le liquide de petit gouttes de fsca.</li>
</ol> 8. Cellule entière patch clamp de Remarque : enregistrements de germes entiers nécessitent un amplificateur et un filtre passe-bas qui est réglé sur une fréquence de coupure de 5 kHz. Les signaux sont numérisés et stockés dans un PC. Les données stockées sont analysées en mode hors connexion ( Figure 3 a).
<ol><li>Créer les électrodes de verre à l’aide d’un extracteur horizontal. Remplir les électrodes avec une solution appropriée (tableaux 3 et 4) à l’aide d’une seringue de 1 mL polyéthylène ordinaire attaché à un tube de verre fin et un filtre de 0,22 µm.</li>
	<li>Avant le contact avec la cellule, maintenir la pression positive et ajuster la pipette actuelle à zéro.</li>
	<li>Après avoir formé un joint gigaohm, appliquer une pression négative à la rupture de la membrane de la cellule (cellule entière configuration dans Figure 3F).</li>
</ol> 9. Analyse de courant-clamp <ol><li>Propriétés de la membrane cellulaire <ol><li>remplissent le patch enregistrement pipettes avec la solution intracellulaire pour des enregistrements de courant-clamp (tableau 3). La résistance de la pipette est comprise entre 4 MΩ et 7 MΩ dans le fsca.</li>
		<li>Après la membrane se rompt, maintenir la tension membranaire à -60 mV en mode V-pince. Ensuite, passer de &#34; bain &#34; mode de &#34; cellule &#34; mode dans le test de la membrane à l’aide de logiciels pour mesurer les propriétés de cellule intrinsèques tels que la capacité de la membrane, la résistance et la constante de temps.</li>
	</ol></li> <li>Étude injection <ol><li>après avoir enregistré les propriétés de cellule intrinsèques, changez le mode de V-pince à piste (I = 0) /I-CLAMP NORMAL pour l’injection de courant. Notez que le potentiel de jonction liquide ne doit pas être corrigée 10.</li>
		<li>Inject actuel dans la cellule pour Mme 300 varier l’intensité du courant par étapes de &#8722; pA 100 à + 550 pA avec des augmentations de 50-pA. Compter le nombre d’épis (potentiels d’action) provoquée par les injections actuelles.</li>
		<li>Mesurer la tension minimale nécessaire pour induire un potentiel d’action (c’est la tension de seuil).</li>
		<li>Calculer l’amplitude du potentiel consécutif positif comme la différence entre la tension au début de l’épi et la plus basse tension atteint au cours de la post-hyperpolarisation 7.</li>
	</ol></li></ol> 10. Analyse de voltage clamp <ol><li>l’AMPA/NMDA ratio Remarque : ratio de l’AMPA/NMDA est une façon conventionnelle afin d’évaluer la plasticité postsynaptique de 7 , les synapses excitatrices glutamatergiques 8 , 9 , 10 , 11. Cependant, Notez que l’augmentation concomitante des deux composantes ne peut-être modifier le ratio 13.
	<ol><li>Perfuse la chambre d’enregistrement avec une solution physiologique barboter avec le mélange de gaz et maintenir la température à 22 ° C à 25 ° C. Ajouter 0,1 mM la picrotoxine à la solution pour bloquer le GABA A - réponse et ajouter 4 µM 2- chloroadénosine pour stabiliser la réponse neuronale évoqués 14.</li>
		<li>Remplir le patch enregistrement pipettes avec la solution intracellulaire pour voltage clamp enregistrements (tableau 4). Vérifiez la résistance de la pipette d’enregistrement dans le fsca. La résistance est comprise entre 4 MΩ et MΩ 7.</li>
		<li>Pour l’enregistrement dans les neurones pyramidaux de couche II/III dans le M1, placez un bipolaire tungstène électrode 200 µm à 300 µm latérale aux cellules d’être enregistrées, sous la surface pial dans la région de la représentation des membres antérieurs de stimulant (2 mm latéral à la ligne médiane) 15 , 16 , 17.</li>
		<li>Pour l’enregistrement dans un neurone pyramidal CA1, placer le stimulant µm d’électrode 200 à 300 µm latérale (fibre collatérale de Schaffer) ou médiale (voie temporoammonic) aux cellules qui sera enregistré ( Figure 3 b).</li>
		<li>Augmenter l’intensité de la stimulation jusqu'à la réponse synaptique &#62; 10 PA.</li>
		<li>Calculer le ratio de l’AMPA/NMDA comme le rapport entre le pic de courant mesuré à &#8722; 60 mV au courant mesuré à + 40 mV à 150 MS après le début de la stimulation. Notez que des traces de 50 à 100 devraient être en moyenne pour calculer le taux de.</li>
	</ol></li> <li>Enregistrements courants postsynaptiques miniature Remarque : les courants postsynaptiques excitateurs Miniature (mEPSCs) sont censés correspondent aux réponses induites par la libération présynaptique d’une vésicule simple du glutamate 18 . En revanche, les courants postsynaptiques inhibitrice miniature (mIPSCs) sont censés correspondent aux réponses induites par la libération présynaptique d’une vésicule simple de GABA 18. Augmentation de l’amplitude des mEPSCs et mIPSCs reflète transmission postsynaptique renforcer, tout augmente en cas de fréquence compte de l’augmentation du nombre de synapses fonctionnelles ou la probabilité de libération présynaptique 11 .
	<ol><li>Remplir la pipette enregistrement mis à jour le solution intracellulaire (tableau 4) pour ajuster le potentiel d’inversion du courant médiée par les récepteurs GABA A à -60 mV.</li>
		<li>Ajouter 0,5 de la tétrodotoxine µM à la baignoire pour bloquer les potentiels d’action spontanées.</li>
		<li>Maintenir la tension à -60 mV à rECORD les événements CPSEM pendant 5 min.</li>
		<li>Changement l’exploitation potentielle à 0 mV aux événements mIPSC record pendant 5 min. Parce que M1 neurones offrent des possibilités des courants médiée par les récepteurs AMPA inversion légèrement plus élevée, les mIPSCs des neurones de M1 sont comptabilisées au + 15 mV avec 0,1 mM APV.</li>
		<li>Attendre quelques minutes que le courant se stabilise.</li>
		<li>Enregistrer les événements de mIPSC pendant 5 min.</li>
		<li>Détecter les événements de la miniature à l’aide du logiciel et utiliser des événements supérieure à 10 pA pour l’analyse. Compter le nombre d’événements mEPSCs ou mIPSCs pendant 5 min déterminer la fréquence. En moyenne les amplitudes des événements pour obtenir l’amplitude moyenne.</li>
		<li>Confirmer si traitement bain avec 10 µM CNQX ou avec 10 µM bicuculline néfopam bloque les événements mEPSCs et mIPSCs, respectivement.</li>
	</ol></li> <li>Analyse jumelés-impulsion Remarque : plasticité présynaptique peut être analysée à l’aide d’impulsions pairées analyse. Une augmentation du taux d’impulsions pairées suggère une diminution du glutamate présynaptique ou GABA release probabilité 7 , 10 , 11.
	<ol><li>Pour analyser les synapses excitatrices, ajouter la picrotoxine 0,1 mM et enregistrer la réponse à -60 mV. Bien que nous avons ajouté 4 µM 2-chloroadénosine pour le bain, nous devons garder à l’esprit que le médicament influe sur la probabilité de libération présynaptique 14.</li>
		<li>Pour analyser des synapses inhibitrices, ajouter 0,1 mM APV et 4 µM 2-chloroadénosine à la salle de bain et d’enregistrer la réponse à 0 mV. Dans les neurones de la M1, enregistrer la réponse + 15 mV.</li>
		<li>Appliquer des impulsions jumelées avec un intervalle de relance inter de ms 100 ou 200 m</li>
		<li>Enregistrer 50-100 traces séquentiels à chaque exploitation potentielle et les valeurs moyennes de.</li>
		<li>Calculer le rapport de pulsation jumelé comme le rapport de la deuxième pointe à la première crête du courant postsynaptique.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêt. Nous confirmons que nous avons lu la position de la revue sur les enjeux éthique publication et nous affirmons que ce rapport est conforme à ces directives. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, collecte de données ou l’analyse, la décision de publier ou la préparation du manuscrit.

La limitation majeure de la technique du patch clamp tranche est l’enregistrement en préparation de la tranche, qui peut-être ne pas refléter ce qui passe in vivo. Bien que l’analyse in vivo courant-clamp est plus fiable, il est techniquement difficile à obtenir suffisamment de données à partir d’animaux conscients. Chaque neurone pyramidal ayant des propriétés cellulaires différentes, un nombre suffisant de cellules est nécessaire pour analyser correctement les différences dans les neurones après la formation. En outre, analyse de voltage clamp nécessite un traitement continu avec CNQX, APV ou bicuculline pour déterminer la nature des réponses postsynaptiques. Pour analyser les réponses de miniature induites par une seule vésicule de glutamate ou GABA, un traitement continu avec la tétrodotoxine est nécessaire pour bloquer des potentiels d’action spontanées. Bien que la technique d’imagerie multiphotonique récemment mise au point est puissante pour l’analyse des changements morphologiques dans les synapses excitatrices19, une technique du combiné patch clamp est nécessaire pour analyser la fonction des synapses en vivo. Actuellement, il est assez difficile d’analyser les changements morphologiques au niveau des synapses inhibitrices, car les synapses inhibitrices plus ne font pas d’épines. A cette époque, le patch clamp de la tranche serait la technique plus adaptée pour analyser les propriétés de cellule ou les fonctions des synapses excitatrices/inhibitrices dans animaux entraînés.
Selon l’analyse de courant-clamp (Figure 4), nous avons récemment rapporté plasticité intrinsèque induite par l’apprentissage moteur, dans les neurones de couche II/III. Plus précisément, les rats entraînés 1 jour montrent une diminution significative au repos potentiel membranaire et une augmentation du seuil de spike. Les rats entraînés 2 jours montrent une augmentation significative au potentiel de membrane qui a conduit à l’excitabilité accrue de repos. Ces résultats suggèrent qu’ont été les changements dynamiques dans la plasticité intrinsèque des M1 couche II/III neurones de rats entraînés. Bride de tension supplémentaire l’analyse a révélé une augmentation du ratio d’impulsions pairées dans 1 jour de rats entraînés, ce qui suggère qu’il y avait une diminution transitoire de la probabilité de libération présynaptique GABA7. Il est donc possible que désinhibition de GABA au niveau de la couche II/III de synapses pouvant déclencher la plasticité induite par l’apprentissage qui en résulte dans le M1. À l’appui de cela, préparation de tranches de l’autoroute M1 exige le traitement de bain avec un bloqueur des récepteurs GABAA pour induire LTP20.
Analyse des potentiels post-synaptiques miniature est un moyen puissant pour détecter la plasticité synaptique chez les animaux formés à l’IA. Séquentiel d’enregistrement de mEPSCs et mIPSCs en un seul neurone CA1 permet l’analyse de la force synaptique excitatrice/inhibiteur de chaque neurone individuel. Depuis un seul mE (I) CFP réponse est attribuée à une seule vésicule de glutamate ou GABA, une augmentation dans le mE (I) CFP amplitude suggère renforcement postsynaptique. Selon mE (I) l’analyse de la CFP, nous avons constaté des différences individuelles dans la force des excitateurs/inhibiteur d’entrée dans chaque neurone CA1 (Figure 5). Formation de IA clairement promu la diversité dans la force synaptique, mais cela n’a pas observé dans les autres groupes (tableau 5).
La diversité synaptique induite par l’apprentissage peut être analysée mathématiquement. En calculant la probabilité d’apparition de chaque point, les données de chaque neurone peuvent être converties en soi-entropie (bit) à l’aide de la théorie de l’information de Claude E. Shannon21. Un point avec une probabilité forte apparence (autour du niveau moyen) indique faible auto-entropie, tandis qu’un point avec une probabilité très rare (un point dévié) indique haute auto-entropie. Comparativement aux rats non formés, l’auto-entropie par neurone a été nettement augmenté chez les rats entraînés IA mais pas en non appariée ou portique rats22. Cette analyse suggère qu’il y avait une augmentation intra-CA1 information après l’apprentissage contextuel.
La technique du patch clamp tranche permet également de peur indicée conditionnement des études dans l' amygdale latérale9 et pour les études d’expérience sensorielle dans le cortex de baril8. En outre, cette technique peut servir à diverses autres techniques pour complément d’enquête. Par exemple, la médiation virus protéine fluorescente verte (GFP)-gène tagged livraison technique peut être combinée avec la technique du patch clamp pour analyser la fonction des molécules spécifiques. En outre, focale microinjection d’un traceur rétrograde peut être utilisée pour visualiser des neurones spécifiques de ce projet à une zone spécifique. Puis, en utilisant la technique de courant-clamp, les propriétés spécifiques des cellules peuvent être analysées dans les neurones visualisée23. En outre, microscopie biphotonique à balayage laser combinant avec deux photons laser uncaging de glutamate a été utilisée pour démontrer la croissance axée sur la colonne vertébrale et la réponse EPSC souris corticale couche de neurones pyramidaux II/III19. Ainsi, la technique du patch clamp tranche sera améliorée en le combinant avec nouveaux produits chimiques, la livraison de gène et les techniques de manipulation de photo.

La technique de patch clamp, développée par Neher et Sakmann, a été largement utilisée pour des expériences électrophysiologiques1. La cellule entière patch clamp technique2 peut servir à enregistrer intracellulaire et tension à l’aide du sceau de gigaohm de la membrane cellulaire. La courant-clamp technique nous permet d’analyser les différences dans les propriétés de la membrane comme potentiel, la résistance et capacité3de repos. La technique de voltage clamp nous permet d’analyser la plasticité synaptique induite par l’apprentissage au niveau des synapses excitatrices et inhibitrices.
Le cortex moteur primaire (M1) est une région centrale qui est essentielle pour faire des mouvements volontaires qualifiés. Des études électrophysiologiques antérieures ont démontré l’élaboration de la potentialisation à long terme (LTP)-comme la plasticité en couche II/III excitateur synapses après métier formation moteur4. De plus, in vivo études supplémentaires d’imagerie démontre le remodelage des épines dendritiques M1 après une habile pour atteindre tâche5,6. Toutefois, la plasticité synaptique et intrinsèque induite par l’apprentissage n’a pas été démontrée dans les neurones de la M1.
Nous avons récemment rapporté qu’une tâche de tige rotor promu variations dynamiques glutamatergique et GABAergiques synapses et altéré la plasticité intrinsèque dans M1 couche II/III neurones7. Ici, nous avons utilisé la technique du patch clamp tranche d’enquêter sur la plasticité induite par l’apprentissage. Cette technique peut également servir à enquêter sur d’autres types de plasticité dépendante de l’expérience dans d’autres régions du cerveau. Par exemple, entrée sensorielle dans le cortex de baril peut renforcer la LPCA médiée par les récepteurs excitateur entrée en couche de neurones II/III8et conditionnement de peur indicé renforce les entrées excitateurs sur les neurones de l’amygdale latérale, qui est nécessaire pour peur de mémoire9. En outre, apprentissage contextuel crée la diversité en termes d’entrées synaptiques excitatrices et inhibitrices dans hippocampe CA1 neurones10,11.

<table><tbody><tr><td>Tapis roulants Rota-Rod</td><td>Med Associates Inc.</td><td>ENV577</td><td></td></tr><tr><td>boîte d’évitement inhibiteur</td><td>Shinano Seisakusho</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pentobarbital</td><td>Kyoritsu Seiyaku</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blade</td><td>Nisshin EM Co., Ltd</td><td>LC05Z</td><td></td></tr><tr><td>Seringue de perfusion cardiaque</td><td>JMS Co., Ltd</td><td>JS-S00S</td><td></td></tr><tr><td>Vibratome</td><td>&nbsp ; Leica Microsystems</td><td>VT-1200</td><td></td></tr><tr><td>Extracteur horizontal</td><td>Sutter Instrument</td><td>Modèle P97</td><td></td></tr><tr><td>Microfilm 34 gauge</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>MF34G-5</td><td></td></tr><tr><td>0.22 &micro ; m</td><td>filter Millipore</td><td>SLGVR04NL</td><td></td></tr><tr><td>Axopatch&ndash ; Amplificateur 1D&nbsp ;</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Digidata 1440 Carte AD</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Logiciel pCLAMP 10</td><td>Axon Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Microscope vertical</td><td>Olympus</td><td>BX51WI</td><td></td></tr><tr><td>Caméra CCD</td><td>Olympus</td><td>U-CMAD3</td><td></td></tr><tr><td>Contrôleur de caméra</td><td>Hamamatsu Photonics K.K.</td><td>C2741</td><td></td></tr><tr><td>Stimulateur</td><td>Nihon Kohden</td><td>SEN-3301</td><td></td></tr><tr><td>Isolateur</td><td>Nihon Kohden</td><td>SS-104J</td><td></td></tr><tr><td>Manipulateur motorisé</td><td>Sutter Instrument</td><td>MP-285</td><td></td></tr><tr><td>Micromanipulateur</td><td>Narishige</td><td>NMN-21</td><td></td></tr><tr><td>Pompe péristaltique&nbsp ;</td><td>Gilson, Inc</td><td>MINIPULS&reg ; 3</td><td></td></tr><tr><td>Électrode capillaire en verre</td><td>Narishige</td><td>GD-1.5</td><td></td></tr><tr><td>Ag/AgCl&nbsp ;</td><td>World Precision Instruments, Inc</td><td>EP4</td><td></td></tr><tr><td>Slice Anchor</td><td>Warner instruments</td><td>64-0252</td><td></td></tr><tr><td>Électrode de stimulus</td><td>Unique Medical Co., Ltd</td><td>KU201-025B</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Dissection buffer/ artificiel CSF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaH2PO4 &bull ; 2H2O</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>163-03545</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>039-00475</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 &bull ; 6H2O</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>135-00165</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de choline&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C7527</td><td></td></tr><tr><td>Acide ascorbique</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>190-01255</td><td></td></tr><tr><td>Acide pyruvique Na</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>199-03062</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>28-1850-5</td><td></td></tr><tr><td>Glucose</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>07-0680-5</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td>Company</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Intracellular solution</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>K-Gluconate</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>G4500</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>346-01373</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>348-01311</td><td></td></tr><tr><td>Na2 ATP</td><td>Nacalai Tesque</td><td>01072-24</td><td></td></tr><tr><td>Na3 GTP</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>G-8877</td><td></td></tr><tr><td>Na phosphocréatine</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>P-7936</td><td></td></tr><tr><td>CsMeSO3</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C1426</td><td></td></tr><tr><td>CsCl</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>033-01953</td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td>Company</td><td>Catalog Number</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Drugs in aCSF</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>2-Chloroadenosine</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C5134</td><td></td></tr><tr><td>Picrotoxine&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>P-1675</td><td></td></tr><tr><td>Tétrodotoxine</td><td>Wako Pure Chemical Industries</td><td>207-15901</td><td></td></tr><tr><td>CNQX&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>C239</td><td></td></tr><tr><td>APV</td><td>Sigma-Aldrich Co.</td><td>A5282</td><td></td></tr></tbody></table>

tranche patch clamp technique d’analyse de plasticité induite par l’apprentissage

Slice Patch Clamp Technique for Analyzing Learning-Induced Plasticity

La technique du patch clamp tranche est un outil puissant pour étudier la plasticité neuronale induite par l’apprentissage dans certaines régions du cerveau. Pour analyser la plasticité induite de moteur d’apprentissage, nous avons formé des rats en utilisant une tâche de tige rotor accélérée. Rats a accompli la tâche 10 fois à intervalles de 30 s pour 1 ou 2 jours. Performance a été significativement améliorée sur les jours de formation par rapport au premier procès. Ensuite, nous avons préparé tranches cérébrale aiguë du cortex moteur primaire (M1) chez les rats non formés et entraînés. Courant-clamp analyse a montré des changements dynamiques dans le potentiel de membrane, seuil de spike, post-hyperpolarisation et la résistance de la membrane de repos dans les neurones pyramidaux de la couche II/III. Injection de courant induit des pointes plus nombreux en 2 jours les rats entraînés que chez les témoins non formés.
Pour analyser l’apprentissage contextuel plasticité induite, nous avons formé des rats en utilisant une tâche d’évitement inhibitrice (IA). Après avoir connu un choc dans le côté obscur d’une boîte, les rats ont appris à, éviter de rester dans le côté lumineux. Nous avons préparé des tranches d’hippocampe aiguës non formés, formés à l’IA, non apparié et les rats de portique. Analyse de voltage clamp a servi à enregistrer dans l’ordre miniature excitatrices et inhibitrices courants postsynaptiques (mEPSCs et mIPSCs) du même neurone CA1. Nous avons trouvé différentes amplitudes moyennes de CPSEM et mIPSC dans chaque neurone CA1, suggérant que chaque neurone avait différentes forces post-synaptique à ses synapses excitatrices et inhibitrices. En outre, par rapport aux témoins non formés, formés à l’IA des rats avaient amplitudes plus élevées, CPSEM et mIPSC, avec une grande diversité. Ces résultats suggèrent qu’apprentissage contextuel crée la diversité postsynaptique dans les synapses excitatrices et inhibitrices à chaque neurone de CA1.
AMPA ou GABA récepteursA semblent à la médiation les courants postsynaptiques, depuis le traitement bain avec CNQX ou bicuculline bloqué les événements CPSEM ou mIPSC, respectivement. Cette technique peut servir à étudier les différents types d’apprentissage dans d’autres régions, telles que le cortex sensoriel et l’amygdale.

La technique du patch clamp tranche est une méthode efficace pour analyser les changements induits par l’apprentissage dans les propriétés intrinsèques et la plasticité des synapses excitatrices ou inhibitrices.

Tranche Patch Clamp Technique d’analyse de plasticité induite par l’apprentissage

The slice patch clamp technique is a powerful tool for investigating learning-induced neural plasticity in specific brain regions. To analyze ...

Bonjour, je m'appelle Dai Mitsushima. Ici, nous allons vous montrer comment préparer des tranches cérébrales chez des animaux entraînés en comparant les données de patch clamp obtenues chez des animaux non entraînés. Nous pouvons ainsi analyser la plasticité synaptique induite par l'apprentissage.Bonjour, je m'appelle Hiroyuki Kida. Dans cette expérience, nous avons étudié le mécanisme neuromoteur de la course à l'aide du test de la tige rotative. Le test de la tige rotative est couramment utilisé pour évaluer la cognition motrice des rongeurs.L'avantage de cette méthode est que nous pouvons modifier le niveau de découverte pendant le test en augmentant la vitesse du rotateur. Test de la tige rotative. Avant la tâche motrice, l'appareil de la tige rotative doit être réglé en mode accéléré, passant de 4 à 40 tr/min sur une période de 300 secondes.Les rats ont effectué dix tentatives pour chaque test. L'intervalle de temps entre les tentatives était de 30 secondes. Au cours de la première séance d'entraînement, les rats tombent généralement de la tige, même à faible vitesse, et marchent parfois dans la mauvaise direction.Après avoir répété l'entraînement, cependant, le rat peut marcher à une vitesse plus élevée. En mesurant la latence sur la tige, nous pouvons estimer la performance d'apprentissage du rat pour cette habileté. Ici, nous pouvons observer les résultats du test de la tige rotative.Comme le montre cette figure, deux jours d'entraînement suffisent pour acquérir la compétence motrice. Par rapport à la latence du premier essai, une analyse a posteriori a révélé une amélioration significative lors du dernier essai des jours d'entraînement. En mesurant la latence sur la barre, nous pouvons estimer la performance d'apprentissage de la compétence chez le rat.Ensuite, nous allons vous présenter un test d'évitement inhibiteur. Ce test est utile pour analyser les performances d'apprentissage contextuel. L'appareil d'évitement inhibiteur est composé de deux compartiments, clair et sombre, séparés par une porte coulissante.Pendant la séance d'entraînement, les rats sont placés dans la zone éclairée et disposent d'un court laps de temps pour s'habituer à l'environnement. Une fois la porte ouverte, les rats peuvent entrer librement dans la zone sombre. Dès qu'ils pénètrent dans la zone sombre, la porte est fermée et les rats reçoivent une légère décharge électrique pendant deux secondes.Après avoir été replacés dans leurs cages pendant 30 minutes à l'issue de l'essai, les rats sont de nouveau placés dans la zone éclairée de l'appareil. Trente minutes après le choc, les rats entraînés ont systématiquement montré une latence plus longue avant d'entrer dans la zone sombre. Ici, nous pouvons observer les résultats du test d'évitement inhibiteur.Après le choc électrique, les rats ont appris à éviter la zone assombrie et à rester du côté éclairé, qu'ils n'auraient normalement pas préféré. Cette tendance à éviter le côté assombri indique l'acquisition de souvenirs contextuels. Préparation de tranches cérébrales après l'entraînement.Avant l'incision, nous refroidissons toutes les ciseaux, pinces hémostatiques et béchers avec de la glace pilée. Ici, vous pouvez voir notre préparation pour la dissection. La dissection cérébrale doit être effectuée aussi rapidement que possible.Après que le rat a été profondément anesthésié, il est placé dans un bac peu profond contenant de la glace pilée et une incision est pratiquée pour ouvrir la cavité abdominale. Après l'incision du diaphragme, une autre incision latérale est effectuée. Pour ouvrir la cavité thoracique, le cartilage costal doit être pincé à l’aide d’un hémostat.Après avoir exposé le cœur, une aiguille en acier inoxydable de 18 g est insérée dans la partie postérieure du ventricule gauche. La pointe de l'aiguille doit être visible à travers la paroi de l'aorte. Après avoir coupé l'oreillette droite, la perfusion est commencée.Veillez à ce que l'aiguille et la seringue soient d'abord remplies de tampon de dissection glacé saturé de gaz. Toutes les bulles d'air doivent également être éliminées avant la perfusion. Commencez par sectionner à l'arrière du crâne.Effectuez ensuite une coupe latérale, suivie d'une coupe médiane pour exposer le cerveau. Après la dissection, le cerveau doit être placé dans un tampon glacé sous bulles pendant cinq minutes. Avant de poursuivre la dissection, le papier filtre doit être humidifié à l’aide de tampon glacé.Ensuite, le cerveau est placé sur un plateau en acier inoxydable refroidi par de la glace. L'angle du plateau de coupe est crucial pour garantir un angle de coupe correct du tranché de cerveau. Un angle inapproprié pourrait potentiellement sectionner les neurones pyramidaux ciblés.Après la taille, une goutte de colle forte doit être déposée sur la platine du vibratome. Pour assurer une adhérence étroite, l'excès de tampon de dissection doit être éliminé à l'aide d'un morceau de papier filtre. À l'aide du vibratome, des tranches cérébrales fines peuvent être réalisées et maintenues dans un tampon froid saturé de gaz.Notre zone cible est le cortex moteur primaire. La région cérébrale cible peut être découpée à l’aide de ciseaux Iris. La chambre d’interface peut être fabriquée à partir d’un récipient plastique alimentaire.Le couvercle de la chambre d'interface est nécessaire pour contenir le gaz. Les tranches sont observées à l'aide d'un microscope infrarouge-DIC. Ici, nous pouvons voir un exemple de neurones de la couche 2/3 du cortex moteur primaire.Les micropipettes pour l’enregistrement en mode « patch » sont remplies avec la solution intracellulaire appropriée. La solution utilisée pour l’analyse en mode courant imposé diffère de celle utilisée pour l’analyse en mode tension imposée. Résultats représentatifs.La technique du clampage de courant est utile pour analyser les propriétés intrinsèques des cellules. Après l'entraînement au bâton rotatif, nous avons pu obtenir les données de clampage de courant provenant des neurones de la couche 2/3 du cortex moteur primaire. Le panneau A indique des tracés typiques induits par des injections de courant.Le panneau B indique la relation entre le courant injecté et le nombre d'potentiels d'action. Les rats entraînés pendant un jour ont produit moins de potentiels d'action, tandis que les rats entraînés pendant deux jours ont produit beaucoup plus de potentiels d'action que les rats non entraînés. Comme on peut le voir dans les panneaux inférieurs, les rats entraînés pendant un jour présentaient un potentiel de repos plus bas, un seuil d'potentiel d'action plus élevé et une hyperpolarisation post-synaptique plus profonde.Les rats entraînés pendant deux jours présentaient un potentiel de repos et une résistance membranaire plus élevés. La technique du clampage de voltage est utile pour analyser la plasticité synaptique induite par l'apprentissage. Ici, nous pouvons observer des données provenant de neurones CA1 après un entraînement contextuel.Nous avons obtenu des courants post-synaptiques unitaires provenant de neurones CA1 induits par des vésicules uniques de glutamate ou de GABA. Les panneaux A et B montrent des tracés représentatifs de courants post-synaptiques unitaires. En présence de tétradotoxine, les EPSC unitaires à moins 16 millivolts et les IPSC unitaires à zéro millivolt ont été mesurés successivement dans les mêmes neurones.Le panneau C montre des graphiques bidimensionnels des amplitudes des PSCe et des PSCIe chez des rats non entraînés, entraînés, non appariés et ayant subi un simple passage. Le panneau D présente les graphiques des fréquences des PSCe. Comme on peut le voir dans les panneaux inférieurs, les entraînements contextuels ont significativement renforcé à la fois les synapses excitatrices et inhibitrices, favorisant ainsi la diversité des entrées synaptiques vers les neurones.En résumé, la technique du clampage en courant est utile pour analyser les changements induits par l'apprentissage dans les propriétés cellulaires. De même, la technique du clampage en tension est un outil puissant pour étudier la plasticité induite par l'apprentissage au niveau des synapses excitatrices et inhibitrices. Les résultats détaillés de ces analyses sont disponibles dans les publications suivantes.

slice-patch-clamp-technique-for-analyzing-learning-induced-plasticity

Research

Recherche

JoVE Journal

Neuroscience

Neurosciences

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