Tranche Patch Clamp Technique d’analyse de plasticité induite par l’apprentissage

Bonjour, je m'appelle Dai Mitsushima. Ici, nous allons vous montrer comment préparer des tranches cérébrales chez des animaux entraînés en comparant les données de patch clamp obtenues chez des animaux non entraînés. Nous pouvons ainsi analyser la plasticité synaptique induite par l'apprentissage.

Bonjour, je m'appelle Hiroyuki Kida. Dans cette expérience, nous avons étudié le mécanisme neuromoteur de la course à l'aide du test de la tige rotative. Le test de la tige rotative est couramment utilisé pour évaluer la cognition motrice des rongeurs.

L'avantage de cette méthode est que nous pouvons modifier le niveau de découverte pendant le test en augmentant la vitesse du rotateur. Test de la tige rotative. Avant la tâche motrice, l'appareil de la tige rotative doit être réglé en mode accéléré, passant de 4 à 40 tr/min sur une période de 300 secondes.

Les rats ont effectué dix tentatives pour chaque test. L'intervalle de temps entre les tentatives était de 30 secondes. Au cours de la première séance d'entraînement, les rats tombent généralement de la tige, même à faible vitesse, et marchent parfois dans la mauvaise direction.

Après avoir répété l'entraînement, cependant, le rat peut marcher à une vitesse plus élevée. En mesurant la latence sur la tige, nous pouvons estimer la performance d'apprentissage du rat pour cette habileté. Ici, nous pouvons observer les résultats du test de la tige rotative.

Comme le montre cette figure, deux jours d'entraînement suffisent pour acquérir la compétence motrice. Par rapport à la latence du premier essai, une analyse a posteriori a révélé une amélioration significative lors du dernier essai des jours d'entraînement. En mesurant la latence sur la barre, nous pouvons estimer la performance d'apprentissage de la compétence chez le rat.

Ensuite, nous allons vous présenter un test d'évitement inhibiteur. Ce test est utile pour analyser les performances d'apprentissage contextuel. L'appareil d'évitement inhibiteur est composé de deux compartiments, clair et sombre, séparés par une porte coulissante.

Pendant la séance d'entraînement, les rats sont placés dans la zone éclairée et disposent d'un court laps de temps pour s'habituer à l'environnement. Une fois la porte ouverte, les rats peuvent entrer librement dans la zone sombre. Dès qu'ils pénètrent dans la zone sombre, la porte est fermée et les rats reçoivent une légère décharge électrique pendant deux secondes.

Après avoir été replacés dans leurs cages pendant 30 minutes à l'issue de l'essai, les rats sont de nouveau placés dans la zone éclairée de l'appareil. Trente minutes après le choc, les rats entraînés ont systématiquement montré une latence plus longue avant d'entrer dans la zone sombre. Ici, nous pouvons observer les résultats du test d'évitement inhibiteur.

Après le choc électrique, les rats ont appris à éviter la zone assombrie et à rester du côté éclairé, qu'ils n'auraient normalement pas préféré. Cette tendance à éviter le côté assombri indique l'acquisition de souvenirs contextuels. Préparation de tranches cérébrales après l'entraînement.

Avant l'incision, nous refroidissons toutes les ciseaux, pinces hémostatiques et béchers avec de la glace pilée. Ici, vous pouvez voir notre préparation pour la dissection. La dissection cérébrale doit être effectuée aussi rapidement que possible.

Après que le rat a été profondément anesthésié, il est placé dans un bac peu profond contenant de la glace pilée et une incision est pratiquée pour ouvrir la cavité abdominale. Après l'incision du diaphragme, une autre incision latérale est effectuée. Pour ouvrir la cavité thoracique, le cartilage costal doit être pincé à l’aide d’un hémostat.

Après avoir exposé le cœur, une aiguille en acier inoxydable de 18 g est insérée dans la partie postérieure du ventricule gauche. La pointe de l'aiguille doit être visible à travers la paroi de l'aorte. Après avoir coupé l'oreillette droite, la perfusion est commencée.

Veillez à ce que l'aiguille et la seringue soient d'abord remplies de tampon de dissection glacé saturé de gaz. Toutes les bulles d'air doivent également être éliminées avant la perfusion. Commencez par sectionner à l'arrière du crâne.

Effectuez ensuite une coupe latérale, suivie d'une coupe médiane pour exposer le cerveau. Après la dissection, le cerveau doit être placé dans un tampon glacé sous bulles pendant cinq minutes. Avant de poursuivre la dissection, le papier filtre doit être humidifié à l’aide de tampon glacé.

Ensuite, le cerveau est placé sur un plateau en acier inoxydable refroidi par de la glace. L'angle du plateau de coupe est crucial pour garantir un angle de coupe correct du tranché de cerveau. Un angle inapproprié pourrait potentiellement sectionner les neurones pyramidaux ciblés.

Après la taille, une goutte de colle forte doit être déposée sur la platine du vibratome. Pour assurer une adhérence étroite, l'excès de tampon de dissection doit être éliminé à l'aide d'un morceau de papier filtre. À l'aide du vibratome, des tranches cérébrales fines peuvent être réalisées et maintenues dans un tampon froid saturé de gaz.

Notre zone cible est le cortex moteur primaire. La région cérébrale cible peut être découpée à l’aide de ciseaux Iris. La chambre d’interface peut être fabriquée à partir d’un récipient plastique alimentaire.

Le couvercle de la chambre d'interface est nécessaire pour contenir le gaz. Les tranches sont observées à l'aide d'un microscope infrarouge-DIC. Ici, nous pouvons voir un exemple de neurones de la couche 2/3 du cortex moteur primaire.

Les micropipettes pour l’enregistrement en mode « patch » sont remplies avec la solution intracellulaire appropriée. La solution utilisée pour l’analyse en mode courant imposé diffère de celle utilisée pour l’analyse en mode tension imposée. Résultats représentatifs.

La technique du clampage de courant est utile pour analyser les propriétés intrinsèques des cellules. Après l'entraînement au bâton rotatif, nous avons pu obtenir les données de clampage de courant provenant des neurones de la couche 2/3 du cortex moteur primaire. Le panneau A indique des tracés typiques induits par des injections de courant.

Le panneau B indique la relation entre le courant injecté et le nombre d'potentiels d'action. Les rats entraînés pendant un jour ont produit moins de potentiels d'action, tandis que les rats entraînés pendant deux jours ont produit beaucoup plus de potentiels d'action que les rats non entraînés. Comme on peut le voir dans les panneaux inférieurs, les rats entraînés pendant un jour présentaient un potentiel de repos plus bas, un seuil d'potentiel d'action plus élevé et une hyperpolarisation post-synaptique plus profonde.

Les rats entraînés pendant deux jours présentaient un potentiel de repos et une résistance membranaire plus élevés. La technique du clampage de voltage est utile pour analyser la plasticité synaptique induite par l'apprentissage. Ici, nous pouvons observer des données provenant de neurones CA1 après un entraînement contextuel.

Nous avons obtenu des courants post-synaptiques unitaires provenant de neurones CA1 induits par des vésicules uniques de glutamate ou de GABA. Les panneaux A et B montrent des tracés représentatifs de courants post-synaptiques unitaires. En présence de tétradotoxine, les EPSC unitaires à moins 16 millivolts et les IPSC unitaires à zéro millivolt ont été mesurés successivement dans les mêmes neurones.

Le panneau C montre des graphiques bidimensionnels des amplitudes des PSCe et des PSCIe chez des rats non entraînés, entraînés, non appariés et ayant subi un simple passage. Le panneau D présente les graphiques des fréquences des PSCe. Comme on peut le voir dans les panneaux inférieurs, les entraînements contextuels ont significativement renforcé à la fois les synapses excitatrices et inhibitrices, favorisant ainsi la diversité des entrées synaptiques vers les neurones.

En résumé, la technique du clampage en courant est utile pour analyser les changements induits par l'apprentissage dans les propriétés cellulaires. De même, la technique du clampage en tension est un outil puissant pour étudier la plasticité induite par l'apprentissage au niveau des synapses excitatrices et inhibitrices. Les résultats détaillés de ces analyses sont disponibles dans les publications suivantes.