Enquête de Synaptic étiquetage / capture et de la Croix-capture à l'aide aiguë coupes d'hippocampe des rongeurs

L’objectif global de cette procédure est d’étudier la plasticité à long terme et ses processus associatifs tels que le marquage synaptique, la capture et le marquage croisé dans les neurones paramétalliques CA one à l’aide de tranches d’hippocampe Q de rongeurs. Ceci est accompli en disséquant d’abord le cerveau et en isolant rapidement l’hippocampe dans le liquide céphalo-rachidien artificiel oxygéné froid. La deuxième étape consiste à préparer des tranches d’hippocampe aiguës à l’aide d’une trancheuse manuelle et à les incuber dans une chambre d’interface.

Ensuite, deux électrodes de stimulation et deux électrodes d’enregistrement sont placées dans la région CA un pour enregistrer les réponses EPSP et de pointe de la population à partir de deux entrées synaptiques. La dernière étape consiste à induire une forme transitoire de plasticité dans une entrée synaptique et une forme persistante de plasticité dans une autre entrée dans une fenêtre de temps spécifique. En fin de compte, les réponses EPSP sur le terrain des deux entrées sont enregistrées pendant de longues périodes afin d’étudier les mécanismes de capture de marquage synaptique et de capture croisée.

Le marquage et la capture synaptiques fournissent une base conceptuelle sur la façon dont la mémoire à court terme se transforme en mémoire à long terme dans un laps de temps donné. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle car les étapes expérimentales sont difficiles à apprendre car elles impliquent une stimulation et un enregistrement à partir de plusieurs entrées synaptiques. Mahesh Shira, machette et maima Sharma, des étudiants diplômés de mon laboratoire, feront la démonstration de la procédure.

Pour commencer cette procédure, préparez un LCR et faites-le bouillonner avec 95 % d’oxygène et 5 % de dioxyde de carbone. Remplissez le fond de la chambre d’interface avec de l’eau distillée à environ 70 % de sa capacité. Allumez ensuite le régulateur de température préréglé à 32 degrés Celsius.

Ensuite, lavez la chambre supérieure pendant 10 à 15 minutes en faisant couler de l’eau distillée à travers le tube d’entrée à un débit élevé avant de passer à un LCR à un débit d’un millilitre par minute. Placez ensuite un filet dans la chambre supérieure pour fournir une surface de repos aux tranches. Démarrez le carbogène dans la chambre inférieure, immergez le tube d’entrée dans le LCR A qui est en cours de carbogène.

Attendez 20 minutes pour que le LCR A soit saturé de carbogène et qu’il remplisse la chambre supérieure. Dans cette étape, montez une lame de rasoir sur le hachoir à tissus et assurez-vous que le tranchant est uniformément aligné. Testez en hachant un petit papier filtre pour vous assurer que la lame est bien fixée.

Réglez ensuite le vernier micromètre coulissant sur sa position de départ. Maintenant, obtenez la tête d’un rat euthanasié et à l’aide d’un ciseau à iris, faites une incision à travers le crâne postérieur pour retirer le tronc cérébral. Faites ensuite une petite incision le long du côté droit du crâne et une incision plus longue sur le côté gauche.

Retirez soigneusement le crâne avec un UR osseux en partant du côté gauche et en allant vers le côté droit du crâne. Pour révéler le cortex et la fine couche de dure-mère qui le recouvre, retirez soigneusement la dure-mère à l’aide d’une spatule fine, puis retirez les plaques frontales avec l’os. Par la suite, retirez la dure-mère restante spécifiquement dans la jonction entre le cortex et le cervelet avec l’extrémité plate d’une spatule, et évitez d’endommager le cerveau en maintenant la pression vers le haut.

À l’aide de la spatule, versez doucement le cerveau dans une boîte de Pétri sur un bloc de refroidissement en aluminium rempli de LCR A froid et gazéifié pour isoler l’hippocampe à l’aide d’un scalpel numéro 11, faites une coupe franche pour enlever le cervelet et une autre coupe pour enlever un quart de la partie antérieure du cerveau. Faites ensuite une coupe sagittale peu profonde le long de la ligne médiane. En commençant par la ligne médiane.

Retirez soigneusement le cortex avec le détartreur à faucille pour révéler l’hippocampe dorsal. Après cela, retirez la couche de cortex au-dessus de l’hippocampe. Faites une petite incision à la commissure de l’hippocampe.

Retirez délicatement l’hippocampe avec le détartreur à faucille, en commençant par l’extrémité dorsale en effectuant des mouvements de roulement. Par la suite, retirez le cortex et les tissus conjonctifs autour de l’hippocampe isolé à l’aide de l’extrémité incurvée du détartreur à faucille. Pour trancher le tissu de l’hippocampe, placez un morceau d’un papier filtre watman de 30 millimètres imbibé de LCR sur l’étage de tranchage de la trancheuse manuelle.

Transférez le tissu de l’hippocampe sur le papier filtre. À l’aide de l’extrémité plate de l’écalaire de la faucille, déplacez le papier filtre pour aligner l’hippocampe dans une orientation correcte par rapport à la lame de la trancheuse, de sorte que l’hippocampe soit coupé à un angle d’environ 70 degrés par rapport au fia. Ensuite, épongez l’excès de solution entourant le tissu de l’hippocampe.

À l’aide d’un papier filtre plié, coupez l’hippocampe transversalement et jetez le tissu de l’extrémité de l’hippocampe où la morphologie de la tranche n’est pas claire. Ensuite, coupez le tissu restant en tranches de 400 microns d’épaisseur en ajustant le vernier micromètre après chaque tour de tranchage. Après chaque coupe, transférez doucement la tranche de la lame à l’aide d’un pinceau à poils doux dans un petit bécher rempli de LCR A gazéifié à froid.

Ensuite, transférez délicatement les tranches sur le filet dans la chambre de coupe à l’aide d’une pipette en plastique propre. À l’aide d’une pointe large, ajustez soigneusement la position des tranches de manière à faciliter la localisation des électrodes et la vérification de l’enregistrement pour vous assurer que les tranches sont suffisamment entourées d’une couche de LCR A, mais pas complètement immergées. Après cela, couvrez la chambre et incubez les tranches pendant deux à trois heures dans des expériences de marquage et de capture synaptiques.

Au microscope, positionnez les deux électrodes de stimulation dans la couche radiale atome de la région CA une pour stimuler les fibres collatérales de Schaffer et lors de l’électrode d’enregistrement dans la région dendritique apicale d’environ une à mi-chemin entre les électrodes de stimulation. Pour enregistrer les réponses F-E-P-S-P, placez une autre électrode d’enregistrement dans la strate paride. Couche DO pour l’enregistrement du pic de population.

Lorsque toutes les électrodes touchent la tranche, effectuez un test de stimulation pour vous assurer qu’un signal EPSP de champ approprié peut être obtenu dans les deux entrées. Une fois qu’un signal F-E-P-S-P correct est obtenu, abaissez soigneusement les électrodes d’environ 200 microns à l’aide des boutons de mouvement fins des manipulateurs. Attendez ensuite 20 minutes pour que la tranche récupère.

Après cela, déterminez la relation entrée-sortie en mesurant la pente du champ EPSP sur une gamme d’intensités de courant de 20 microampères à 100 microampères. Ensuite, pour chaque entrée, réglez l’intensité de stimulation qui évoque 40 % de la pente maximale de l’EPSP du champ comme stimuli constants tout au long de l’expérience. Après 15 à 20 minutes, commencez à enregistrer l’enregistrement de base une ligne de base stable d’au moins 30 à 60 minutes avant l’induction L-T-P-L-T-D dans une entrée, induire une LTP précoce à l’aide d’un protocole de tétine faible consistant en une seule stimulation à haute fréquence.

Alors que l’autre entrée continue d’enregistrer la ligne de base 30 minutes après l’induction précoce de la LTP, induire une LTP tardive dans l’entrée S deux, en utilisant un protocole de tétine fort impliquant une stimulation répétée à haute fréquence avec un intervalle intertrain de 10 minutes. Ensuite, enregistrez les réponses EPSP du champ pour des durées étendues afin de révéler la transformation du LTP précoce dans l’entrée S un en LTP tardif par le marquage et la capture synaptiques. De même, dans une expérience de capture croisée, induire d’abord une LTP précoce et une entrée suivie 30 minutes plus tard d’une induction tardive LTD dans une autre entrée, en utilisant un protocole de stimulation basse fréquence fort composé de 900 rafales sur une durée de 15 minutes.

Enregistrez ensuite les réponses EPSP du champ pendant des durées prolongées pour révéler la transformation du LTP précoce dans l’entrée S un en LTP tardif par la capture croisée. Dans cette représentation, deux électrodes de stimulation sont positionnées dans l’atome radial de la couche radiale de la région CA un pour stimuler deux entrées synaptiques indépendantes mais chevauchantes. Sur CA, un neurone paramétallique, deux électrodes d’enregistrement extracellulaires.

L’un pour enregistrer F-E-P-S-P à partir du compartiment dendritique apical. Et un autre pour enregistrer le pic de population somatique des corps cellulaires paramétalliques sont situés dans l’atome radi et le stratum para respectivement. Cette figure montre la semaine précédant le paradigme fort pour étudier le marquage et la capture synaptiques.

Une tétine faible est appliquée à S un pour induire une LTP précoce, suivie d’une forte tétine de S deux à 30 minutes pour induire une LTP tardive, et cette figure montre la semaine précédant le paradigme fort pour étudier le marquage croisé. La LTP précoce est induite par une faible tétine dans S un, suivie de l’induction d’une LTD tardive dans S deux à l’aide d’un protocole de stimulation à basse fréquence forte. Après 30 minutes dans S un, le LTP précoce est transformé en LTP tardif d’une durée de six heures, montrant le marquage croisé et la capture.

Une fois maîtrisée, cette technique de dissection et de préparation de tranche peut être réalisée très rapidement en trois à cinq minutes. Ainsi, la viabilité des tranches peut être préservée pour des enregistrements à long terme. En utilisant cette méthode, on peut également tester les effets de différents agents pharmacologiques sur les processus de marquage et de capture synaptiques.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de mener des expériences de plasticité fonctionnelle à long terme et des processus de marquage et de capture synaptiques.