Enquête de Synaptic étiquetage / capture et de la Croix-capture à l'aide aiguë coupes d'hippocampe des rongeurs

Le but global de cette procédure est d'étudier la plasticité à long terme et ses processus associatifs tels que le marquage synaptique, la capture et le marquage croisé dans les neurones paramédiaux du CA1 à l'aide de tranches hippocampiques Q provenant de rongeurs. Cela est réalisé en premier lieu en disséquant le cerveau et en isolant rapidement l'hippocampe dans un liquide céphalo-rachidien artificiel froid et oxygéné. La deuxième étape consiste à préparer des tranches hippocampiques aiguës à l'aide d'un découpeur manuel de tissus et à les incuber dans une chambre d'interface.

Deux électrodes de stimulation et deux électrodes d'enregistrement sont ensuite placées dans la région CA1 afin d'enregistrer les réponses en PPSE de champ et en pic de population provenant de deux entrées synaptiques. La dernière étape consiste à induire une forme transitoire de plasticité dans une entrée synaptique et une forme persistante de plasticité dans une autre entrée, dans une fenêtre temporelle spécifique. Enfin, les réponses en PPSE de champ provenant des deux entrées sont enregistrées pendant des durées prolongées afin d'étudier les mécanismes de marquage synaptique, de capture et de capture croisée.

L'étiquetage et la capture synaptiques fournissent une base conceptuelle expliquant comment la mémoire à court terme se transforme en mémoire à long terme au cours d'une période spécifique. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes expérimentales sont difficiles à apprendre, impliquant la stimulation et l'enregistrement à partir de multiples entrées synaptiques. La procédure sera démontrée par Mahesh Shira, machete et maima Sharma, étudiants diplômés de mon laboratoire.

Pour commencer cette procédure, préparez un LCR A et faites-y barboter un mélange de 95 % d'oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone. Remplissez le fond de la chambre d'interface avec de l'eau distillée jusqu'à environ 70 % de sa capacité. Ensuite, allumez le contrôleur de température réglé à 32 degrés Celsius.

Ensuite, lavez la chambre supérieure pendant 10 à 15 minutes en faisant circuler de l'eau distillée à travers le tube d'entrée à un débit élevé, avant de passer à un LCS A à un débit d'un millilitre par minute. Placez ensuite un filet dans la chambre supérieure afin de fournir une surface de repos pour les tranches. Amorcez le carbogène dans la chambre inférieure en immergeant le tube d'entrée dans le LCS A qui est continuellement carbogéné.

Prévoir 20 minutes pour que le LCR A soit saturé de carbogène et remplisse la chambre supérieure. Dans cette étape, fixer une lame de rasoir sur le hachoir à tissus et s'assurer que le tranchant est parfaitement aligné. Faire un test en hachant un petit morceau de papier filtre afin de vérifier que la lame est bien fixée.

Ensuite, régler le micromètre vernier coulissant à sa position initiale. Prendre maintenant la tête d'un rat euthanasié et, à l'aide de ciseaux à iridectomie, pratiquer une incision à travers le crâne postérieur pour retirer le tronc cérébral. Puis effectuer une petite incision le long du côté droit du crâne et une incision plus longue du côté gauche.

Retirer soigneusement le crâne avec un burin osseux en partant du côté gauche et en se déplaçant vers le côté droit du crâne. Pour exposer le cortex et la fine couche de dure-mère qui le recouvre, enlever délicatement la dure-mère à l’aide d’une spatule fine, puis retirer les plaques frontales avec le burin osseux. Ensuite, éliminer le reste de la dure-mère, en particulier au niveau de la jonction entre le cortex et le cervelet, à l’aide de l’extrémité plate de la spatule, en veillant à ne pas endommager le cerveau en maintenant la pression vers le haut.

À l’aide de la spatule, prélever délicatement le cerveau et le déposer dans une boîte de Pétri placée sur un bloc réfrigérant en aluminium contenant du liquide A CSF froid et carbogazéifié, afin d’isoler l’hippocampe à l’aide d’un scalpel n°11. Effectuer une incision droite pour retirer le cervelet, puis une autre incision pour enlever un quart de la portion antérieure du cerveau. Ensuite, pratiquer une incision sagittale superficielle le long de la ligne médiane, en partant de celle-ci.

Retirer soigneusement le cortex avec le curet en forme de faucille afin de découvrir l'hippocampe dorsal. Ensuite, enlever la couche de cortex située au-dessus de l'hippocampe. Pratiquer une petite incision dans le commissure hippocampique.

Retirer délicatement l'hippocampe avec le scalpel en forme de faucille, en partant de l'extrémité dorsale en utilisant des mouvements de roulis. Ensuite, retirer tout cortex et tissus conjonctifs entourant l'hippocampe isolé à l’aide de l’extrémité courbe du scalpel en forme de faucille. Pour découper le tissu hippocampique, placer un morceau de papier filtre Watman de 30 millimètres imbibé de LCS sur le plateau de sectionnement du découpeur manuel.

Transférez le tissu hippocampique sur le papier filtre. À l’aide de l’extrémité plate du scalpel en forme de faucille, déplacez le papier filtre afin d’aligner l’hippocampe dans une orientation appropriée par rapport à la lame du coupeur, de sorte que l’hippocampe soit sectionné selon un angle d’environ 70 degrés par rapport au fia. Ensuite, absorbez la solution excédentaire entourant le tissu hippocampique.

Avec un papier filtre plié, sectionnez l'hippocampe transversalement et écartez les tissus situés à l'extrémité extrême de l'hippocampe, où la morphologie des tranches n'est pas claire. Ensuite, découpez le tissu restant en tranches de 400 micromètres d'épaisseur en ajustant le micromètre vernier après chaque série de coupes. Après chaque coupe, transférez délicatement la tranche de la lame à l'aide d'un pinceau à poils doux vers un petit bécher rempli de liquide A CSF froid et carbogasé.

Ensuite, transférez délicatement les tranches sur le filet dans la chambre à tranches à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique propre. À l’aide d’une pipette à embout large, ajustez soigneusement la position des tranches de manière à faciliter le positionnement de l’électrode et la vérification de l’enregistrement, en veillant à ce que les tranches soient suffisamment entourées par une couche de ASCF, sans toutefois être complètement immergées. Ensuite, couvrez la chambre et incubez les tranches pendant deux à trois heures dans le cadre d’expériences de marquage et de capture synaptiques.

Sous le microscope, positionner les deux électrodes de stimulation dans la couche radiatum du CA1 afin de stimuler les fibres collatérales de Schaffer, et placer une électrode d’enregistrement dans la région dendritique apicale du CA1, à mi-chemin entre les électrodes de stimulation. Pour enregistrer les réponses F-E-P-S-P, placer une autre électrode d’enregistrement dans la couche stratum pyramidale pour l’enregistrement du pic de population.

Lorsque toutes les électrodes touchent la tranche, appliquez une stimulation d'essai afin de vérifier qu'un signal de PPS évoquée convenable peut être obtenu dans les deux entrées. Une fois un signal F-E-P-S-P correct obtenu, abaissez soigneusement les électrodes d'environ 200 micromètres supplémentaires à l’aide des molettes de réglage fin des manipulateurs. Attendez ensuite 20 minutes pour permettre à la tranche de se rétablir.

Ensuite, déterminez la relation entrée-sortie en mesurant la pente du PPS évoqué en champ en fonction d'une gamme d'intensités de courant allant de 20 microampères à 100 microampères. Puis, pour chaque entrée, fixez l'intensité de stimulation provoquant 40 % de la pente maximale du PPS évoqué en champ comme stimulus constant tout au long de l'expérience. Après 15 à 20 minutes, commencez l'enregistrement d'une ligne de base stable d'au moins 30 à 60 minutes avant l'induction de la PPL-PTD dans une entrée, puis induisez une PPL précoce à l'aide d'un protocole de tétrain faible composé d'une seule stimulation à haute fréquence.

Alors que l'autre entrée continue d'enregistrer la ligne de base pendant 30 minutes après l'induction de la PLT précoce, induisez une PLT tardive dans l'entrée S deux, en utilisant un protocole de tétrain fort impliquant une stimulation à haute fréquence répétée avec un intervalle inter-tétrain de 10 minutes. Ensuite, enregistrez les réponses du PEPS évoqué pendant des durées prolongées afin de révéler la transformation de la PLT précoce dans l'entrée S un en PLT tardive par le marquage synaptique et la capture. De manière similaire, dans une expérience de capture croisée, induisez d'abord une PLT précoce dans une entrée, suivie 30 minutes plus tard par l'induction d'une DPT tardive dans une autre entrée, en utilisant un protocole de stimulation à basse fréquence intense composé de 900 salves sur une durée de 15 minutes.

Ensuite, enregistrez les réponses du PEPS de champ pendant des durées prolongées afin de révéler la transformation du LTP précoce dans l'entrée S1 en LTP tardif par le phénomène de capture croisée. Dans cette représentation, deux électrodes de stimulation sont positionnées dans la couche radiatum du secteur CA1 pour stimuler deux entrées synaptiques indépendantes mais partiellement superposées. Vers les neurones paramédians du CA1, deux électrodes d'enregistrement extracellulaires.

Un pour enregistrer le F-E-P-S-P à partir du compartiment dendritique apical. Et un autre pour enregistrer le pic de population somatique à partir des corps cellulaires paramétraux situés respectivement dans le stratum radiatum et le stratum para. Cette figure montre la semaine précédant le paradigme fort permettant d'étudier le marquage synaptique et la capture.

Une tétranie faible est appliquée à S un pour induire une LTP précoce, suivie d'une tétranie forte de S deux après 30 minutes afin d'induire une LTP tardive, et cette figure montre la condition précédant le paradigme fort pour étudier le marquage croisé. La LTP précoce est induite par une tétranie faible dans S un, suivie de l'induction d'une LTD tardive dans S deux à l'aide d'un protocole de stimulation à basse fréquence intense. Après 30 minutes dans S un, la LTP précoce se transforme en LTP tardive persistant six heures, démontrant le phénomène de marquage et de capture croisés.

Une fois maîtrisée, cette technique de dissection et de préparation des tranches peut être réalisée très rapidement en trois à cinq minutes. Ainsi, la viabilité des tranches peut être préservée pour des enregistrements à long terme. À l’aide de cette méthode, on peut également tester les effets de différents agents pharmacologiques sur les processus de marquage synaptique et de capture.

Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de réaliser des expériences à long terme sur la plasticité fonctionnelle ainsi que des processus de marquage synaptique et de capture.