Name: Enquête de Synaptic étiquetage / capture et de la Croix-capture à laide aiguë coupes dhippocampe des rongeurs (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2015-09-04T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 29 s
Description: Découvrez les mécanismes de marquage synaptique, capture et capture croisée dans les neurones pyramidaux CA1 de l'hippocampe de rongeurs en utilisant des coupes aiguës. Cette méthode électrophysiologique permet d'étudier la plasticité synaptique à long terme et la formation de la mémoire.

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Cet article vidéo est sponsorisé par Cerebos Pacific Limited. Ce travail est soutenu par la subvention de recherche collaborative du Conseil national de recherches médicales (NMRC-CBRG-0041/2013) et le financement de la recherche universitaire du ministère de l’Éducation (MOE AcRF- Tier 1 - T1-2012 Oct -02).

Toutes les procédures d&#39;animaux ont été approuvés par le Comité institutionnel de protection des animaux et l&#39;utilisation (IACUC) de l&#39;Université nationale de Singapour. 1. Préparation de céphalo-rachidien artificiel Fluid (ACSF) <ol><li> Préparer le ACSF constitué de (en mM) 124 NaCl, 3,7 KCl, 1,0 MgSO 4, 7H 2 O, 2,5 CaCl 2, 2H 2 O, 1,2 KH 2 PO 4, 24,6 NaHCO 3, et 10 D-glucose. Vérifiez que le pH de l&#39;ACSF est comprise entre 7,2 à 7,4 lorsque barboter jusqu&#39;à saturation avec 95% O 2 et 5% de CO 2 du mélange (carbogène). 21 L&#39;utilisation de cette ACSF à la fois pour la dissection, la préparation de la tranche et pour perfusion pendant les enregistrements électrophysiologiques. REMARQUE: Utiliser un appareil propre pour mesurer et maintenir le ACSF. En utilisant un appareil impur peut conduire à des solutions ou la formation de précipités nuageux. Utilisez de l&#39;eau déminéralisée pour tous les préparatifs. </li><li> Préparer un 2 L 10x ACSF Stock exclusion NaHCO 3 </sub&gt; D-glucose et dans une fiole jaugée. Ajouter des réactifs à l&#39;eau désionisée dans l&#39;ordre suivant: NaCl (144.96g), KCl (5.52g), MgSO 4, 7H 2 0 (4,92 g), du CaCl 2, 2H 2 0 (7,56 g), du KH 2 PO 4 (3,28 g) et le haut jusqu&#39;à un volume de 2 L. Remuer continuellement pendant au moins 30 minutes en utilisant un agitateur magnétique pour assurer que tous les réactifs sont dissous. Rangez le stock dans 4 o C et utiliser dans les 2 semaines. </li><li> Avant la dissection et les expériences, diluer le bouillon ACSF dans une fiole jaugée avec l&#39;addition de quantités requises de NaHCO 3 et D-glucose. Pour 1 L solution, diluer 100 ml de stock de 1 L après avoir ajouté 2,07 g de NaHCO 3 et 1.802 g de D-glucose. L&#39;ACSF devrait être une solution libre de tout précipité ou des particules non dissoutes. </li><li> Refroidir environ 200-300 ml de l&#39;ACSF sur la glace, pour être utilisé lors de la dissection. Assurez-vous que l&#39;ACSF utilisé pour la dissection est comprise entre 2-4 ° C. Utilisez l&#39;ACSF restant pour electrophysiological expériences. Bubble toutes les solutions de l&#39;ACSF à saturation avec du carbogène (5% de CO2, 95% de O 2) en continu. En attendant l&#39;ACSF refroidir, préparer la zone de dissection et la chambre de tranche. </li></ol> 2. Préparation de la Chambre Interface REMARQUE: Une chambre à règle interface cerveau, utilisé pour l&#39;incubation des tranches et leur maintien pendant les enregistrements électrophysiologiques (figure 2B), est composée de deux compartiments. La chambre inférieure contient de l&#39;eau distillée maintenue à 32 ° C par un régulateur de température et fait barboter en continu avec du carbogène. <ol><li> Mettez le régulateur de température et de prérégler à 32 ° C. Lavez la chambre supérieure de 10 à 15 min en exécutant l&#39;eau distillée à travers la tubulure d&#39;admission. Assurez-vous que la chambre supérieure est propre avant de placer le filet. Vérifiez que le niveau d&#39;eau dans la chambre inférieure est d&#39;environ 70% rempli d&#39;eau distillée. </li><li> Placer lenet dans la chambre supérieure pour fournir une surface de repos pour les tranches (figure 2C). Ajuster le tube d&#39;écoulement afin d&#39;assurer que le niveau de la solution est suffisamment mouille toute la surface du filet. Placer le couvercle au-dessus du filet de maintenir une atmosphère humidifiée carbogène intérieur de la chambre supérieure. </li><li> Réglez le taux à 1 ml / min de débit. Maintenir ce débit pendant toute la période tranche d&#39;incubation et l&#39;expérience. Commencez carbogenating l&#39;ACSF 1x fraîchement préparé et plonger le tube d&#39;entrée dans l&#39;ACSF. Laisser 20 min pour le ACSF à être saturé avec du carbogène et la chambre supérieure pour être rempli avec elle. </li></ol> 3. Préparation des aigus hippocampe tranches NOTE: Le protocole de dissection se compose de (1) Elimination du cerveau de l&#39;animal dans l&#39;ACSF et froid (2) Isolement et le tranchage de l&#39;hippocampe. Pour neurones de rester viables, isoler et placer le cerveau froid ACSF rapidement et complètent l&#39;ensembleprocessus, y compris le tranchage dans 3-5 min. <ol><li> Retrait du cerveau dans ACSF froid <ol><li> Disposer les outils de dissection de la manière représentée sur la figure 1A. Disposer les outils en fonction de l&#39;ordre d&#39;utilisation pour faciliter le processus de dissection. Avant de commencer, assurez-vous tous les outils de dissection sont prêts. </li><li> Monter une lame de rasoir, nettoyé avec de l&#39;acétate d&#39;éthyle, de l&#39;éthanol absolu et d&#39;eau distillée, sur le tissue chopper manuel (figure 1B), fixez-le fermement et veiller à ce que le bord de coupe est uniformément aligné. Essai découper un morceau de papier filtre pour faire en sorte que la lame est solidement fixé. Réglez le coulissement Vernier micromètre à sa position de départ. </li><li> Euthanasier l&#39;animal à l&#39;aide de dioxyde de carbone (CO 2) dans une chambre d&#39;induction et décapiter avec des ciseaux à pansements ou Guillotine. Utilisation d&#39;un ciseau Iris, enlever la peau et de la fourrure au-dessus du crâne. Faire une coupe à travers la partie postérieure de retirer le brainstem.Make une petite incision le long èmee côté droit du crâne et une incision plus sur la gauche. ATTENTION! Faire seulement une petite incision sur le côté qui est utilisé pour les expériences d&#39;éviter de l&#39;endommager. Lors de l&#39;insertion des ciseaux, assurez-vous que la force appliquée est vers le haut pour éviter d&#39;endommager le cerveau. </li><li> Retirez délicatement le crâne avec un os rongeur à partir de la gauche sur le côté droit du crâne pour révéler le cortex. Une fine couche de dure-mère peut aussi être vu. Retirez délicatement les plaques frontales avec le rongeur. Enlever la plupart de la dure avec les plaques frontales. ATTENTION! Veillez à ce que la dure-mère ne tranche pas à travers les tissus du cerveau. </li><li> Retirer la dure-mère restant, le cas échéant, en particulier dans la jonction entre le cortex et le cervelet avec l&#39;extrémité plate d&#39;une spatule. Pour les étapes 3.1.5 et 3.1.6, maintenir la pression vers le haut-à-dire, loin du cerveau pour éviter de l&#39;endommager. Aide de la spatule, délicatement ramasser le cerveau dans une boîte de Pétri remplie de froid et ACSF carbogenated (2-4 ° C), placed sur un bloc de refroidissement de l&#39;aluminium. </li></ol></li><li> Isolement de l&#39;hippocampe <ol><li> Avec un scalpel, faire une coupe droite pour supprimer le cervelet et une autre coupe pour enlever la partie antérieure du cerveau (environ un quart). Faites une entaille peu profonde le long de la ligne médiane. </li><li> Retirez délicatement le cortex avec un scaler faucille, à partir de la ligne médiane de révéler l&#39;hippocampe dorsal. Retirer la couche de cortex dessus de l&#39;hippocampe. Utilisez les doigts ou des pinces inclinées pour soutenir le cerveau. Faites une petite coupure à la commissure hippocampique. Retirez délicatement l&#39;hippocampe avec le scaler faucille à partir de l&#39;hippocampe dorsal en utilisant des mouvements de roulement. ATTENTION! Soyez doux pour éviter d&#39;étirement et de déchirer l&#39;hippocampe. </li><li> Retirez tout le cortex et les tissus conjonctifs autour de l&#39;hippocampe isolé avec le scaler faucille. </li></ol></li><li> Découper le tissu hippocampique et le transfert des tranches sur la chambre d&#39;interface <ol><li> Placez un morceau de ACSF-papier filtre imbibé (grade 1, 30 mm) sur la scène de tranchage de la trancheuse manuel. Scoop et placer le tissu hippocampique sur le papier filtre. Déplacer le papier filtre afin d&#39;aligner l&#39;hippocampe lors d&#39;une orientation correcte par rapport à la lame de la trancheuse de manière que l&#39;hippocampe est découpé en formant un angle d&#39;environ 70 o à la fimbria. </li><li> Éponger l&#39;excès de solution entourant le tissu hippocampique avec un papier filtre plissé (grade 1, 85 mm) en laissant l&#39;hippocampe légèrement humide. Commencez trancher l&#39;hippocampe transversalement. Slice et jeter les tissus de l&#39;extrémité de l&#39;hippocampe où la morphologie de la tranche est pas clair. </li><li> Couper le tissu restant dans 400 tranches um d&#39;épaisseur. Pick-up tranches d&#39;hippocampe doucement de la lame avec une brosse à poils souples en utilisant les mouvements de glisser en douceur et placer les tranches dans un petit gobelet rempli d&#39;ACSF carbogenated froid. Effectuer les étapes 3.3.1-3.3.3 aussi rapidement que possible, car le tissu hippocampique est exposé à l&#39;air. NOTE: En général les deux tiers de l&#39;hippocampe est tranché, et 4-6 tranches avec une morphologie clair peuvent être préparés. </li><li> Transférer les tranches doucement sur le net dans la chambre de tranche en utilisant une pipette en plastique propres de Pasteur avec une pointe large (fait en coupant 2-3 cm de la pointe). Ajustez soigneusement la position des tranches sur le net en utilisant une petite seringue avec une pointe recourbée. Placer les tranches d&#39;une manière qui facilite la localisation de l&#39;électrode et l&#39;enregistrement. Assurez-vous que les tranches sont suffisamment entourés par ACSF mais ne sont pas submergés ou flottant (Figure 2C-D). Couvrir la chambre et incuber les tranches pendant 2-3 heures. NOTE: La couche de cellules pyramidales dans les tranches sains devrait montrer une certaine transparence. </li></ol></li></ol> 4. Enregistrement de réponses CA3-CA1 synaptiques NOTE: L&#39;électrophysiologie set-up utilisé pour le champ enregistrement potentiel est illustré à la figure 2A. A Faracage de jour est fortement recommandée si l&#39;interférence électrique est hors du contrôle après la terre correcte des paramètres électriques. De nombreux types de chambres submergées et d&#39;interface sont disponibles dans le commerce. Cependant, les chambres de l&#39;interface sont préférés comme tranches présentent plus robustes réponses synaptiques en eux. <ol><li> Positionnement d&#39;électrodes <ol><li> Allumez l&#39;appareil électrique (stimulateurs et amplificateurs) qui seront utilisés. Montez et assurez les stimulants et d&#39;enregistrement des électrodes dans les porteurs de micromanipulateurs de plexiglas. NOTE: Nous utilisons monopolaire, électrodes en acier inoxydable laquées de résistance 5 MQ pour les deux fins de stimulation et d&#39;enregistrement. </li><li> Avant l&#39;utilisation, insérer ces électrodes à l&#39;intérieur des capillaires de verre tiré et la fixer avec de la colle époxy exposer seulement petite partie de la pointe de l&#39;électrode (figure 2E). Cela donne de la force aux électrodes contraire minces et permet de les fixer solidement dans le ELEdétenteurs ctrode. </li><li> Guidée sous le microscope, placer l&#39;électrode (s) de stimulant dans le stratum radiatum de la région CA1 de stimuler les fibres collatérales de Schaffer et l&#39;électrode d&#39;enregistrement dans la région dendritique apicale de CA1 à enregistrer (fEPSP) les réponses de terrain-EPSP. NOTE: En approchant de la surface du liquide au-dessus de la tranche avec les électrodes donne un son qui permet de localiser rapidement la surface de la tranche (fourni, l&#39;amplificateur est connectée à un haut-parleur). </li><li> Dans des expériences de marquage et de capture synaptiques, selon les besoins de l&#39;expérience, la position deux ou trois électrodes de stimulation (S1, S2 ou S3) de chaque côté de l&#39;électrode d&#39;enregistrement afin de stimuler deux ou plusieurs entrées indépendantes mais qui se chevauchent. Placer les électrodes stimulantes et d&#39;enregistrement d&#39;environ 200 um à part. </li><li> Si nécessaire, recherchez une autre électrode d&#39;enregistrement dans la couche cornée de pyramidale pour l&#39;enregistrement pic de population (figure 3A) .Lorsque la fois leélectrodes ont touché la tranche, en utilisant le logiciel d&#39;acquisition, donner une stimulation de test pour assurer un bon signal fEPSP. NOTE: Nous utilisons biphasique, impulsions de courant constant (durée d&#39;impulsion 0,1 ms / demi-ondes) pour la stimulation de test. </li><li> Une fois un signal approprié fEPSP est obtenue, baissez doucement les électrodes environ 200 um de profondeur en utilisant les boutons de mouvement fin des manipulateurs. Autoriser 20 min pour les tranches de récupérer. Testez l&#39;indépendance de la voie avec un double choc protocole de facilitation 27,28. </li></ol></li><li> Relation d&#39;entrée-sortie <ol><li> Déterminer la relation d&#39;entrée-sortie (vs stimulation afférente fEPSP pente) pour chaque entrée, en mesurant la valeur de pente à une gamme d&#39;intensités de courant. Effectuez cette entre 20 uA à 100 uA. Ensuite, réglez l&#39;intensité de stimulation pour chaque entrée pour obtenir 40% de la pente maximale fEPSP. Maintenir cette constante tout au long de l&#39;expérience. </li><li> Après 15-20 minutes, commencer à enregistrer la ligne de base. Surveiller la fEPSP pente de près pendant cette période et réinitialiser l&#39;intensité du stimulus si la pente varie de plus de 10% de la valeur de consigne et de commencer une nouvelle ligne de base. Enregistrez au moins 30 minutes ou 1 heure de référence stable avant de poursuivre. REMARQUE: Pour le test ou la stimulation de base, nous utilisons quatre balayages de 0,2 Hz biphasique, impulsions de courant constant (0,1 ms par polarité) donnés toutes les 5 min. Une pente moyenne de ces quatre réponses est alors considérée comme une répétition. Les signaux sont amplifiés et filtrés par un amplificateur différentiel, numérisé au moyen d&#39;un convertisseur analogique-numérique et un suivi en ligne avec le logiciel fait sur mesure. </li></ol></li><li> L&#39;induction de LTP / LTD en utilisant des protocoles de stimulation REMARQUE: Les deux LTP et LTD ont été classés comme début et fin-LTP / LTD basée sur les exigences de la synthèse des protéines; cette dernière nécessitant une traduction et / ou la transcription de son entretien fin [pour revue, voir 4]. Une variété de paradigmes de stimulation électrique peut specifically amener les différentes formes de LTP et LTD. <ol><li> WTET: 100 Hz, 21 impulsions de courant biphasique constants (0,2 ms par phase). </li><li> STET: Trois éclats de 100 impulsions pour une seconde (100 Hz) toutes les 10 min (Pulse Width 0,2 ms par phase). </li><li> 900 salves sur une durée de 15 min. 1 rafale se compose de 3 impulsions (0,2 ms de largeur) avec un intervalle entre de 50 ms (20 Hz). L&#39;intervalle de rafale est entre 1 sec (nombre total d&#39;impulsions 2700). </li></ol></li></ol> 5. Nettoyage Slice Chambre et système de perfusion <ol><li> Après l&#39;enregistrement est terminé, recueillir les tranches d&#39;hippocampe pour plus d&#39;analyse biochimique ou encore jeter de manière appropriée. Coupez l&#39;alimentation de carbogène et régulateur de température. Laver le barboteur carbogène dans l&#39;eau distillée. </li><li> Nettoyez le filet soigneusement avec une brosse et de l&#39;eau distillée. Laver la plate-forme pendant 15-20 min avec de l&#39;eau distillée à un débit plus élevé. Une fois dans les 3-4 jours, changer l&#39;eau distillée dans lecompartiment inférieur de la chambre et la chambre propre également régulièrement avec une solution de peroxyde d&#39;hydrogène à 3% pour éviter la croissance fongique. </li></ol>

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Tranche de l&#39;hippocampe aiguë est un excellent modèle pour l&#39;étude de la LTP et d&#39;autres processus de plasticité fonctionnels tels que STC et de contre-capture. Elle conserve une grande partie du réseau structurel laminaire des circuits de l&#39;hippocampe, permet emplacements des électrodes précis et offre à côté, une plate-forme ouverte pour la manipulation neuropharmacologique rapide sans barrière hémato-encéphalique. Cet article décrit la méthodologie pour la préparation des tranches d&#39;hippocampe aigus viables à partir de jeunes rats adultes et de les utiliser pour enquêter STC et croix-tagging. Une recherche antérieure a souligné que le sexe et l&#39;âge des animaux sont des facteurs importants à considérer pour une utilisation dans les études d&#39;électrophysiologie. 27,28 conséquent animaux adultes, jeunes avec des fonctions de récepteurs adultes pleinement exprimées (rats Wistar mâles âgés de 5-7 semaines) sont utilisés. 23 asymétries dans les connexions entre l&#39;hippocampe gauche et droite ont été notés chez les rongeurs 29 etde grandes différences dans l&#39;expression des récepteurs NMDA ont été rapportés ainsi 34. Nous avons utilisé l&#39;hippocampe droit afin d&#39;être compatible avec nos études précédentes LTP. 23,32 Cependant, que ce soit des hippocampes peut être utilisé aussi longtemps que la cohérence est maintenue. Comme dans tout protocole, il est très important d&#39;effectuer l&#39;isolement et trancher rapidement les procédures mais en prenant soin que le tissu est pas étiré, endommagé, rendu sec ou hypoxique. Les variations de pH, la température et la composition ionique des solutions peuvent avoir effet profond sur la viabilité des tranches et les résultats. D&#39;où de telles variations doivent être évités. Il a été observé que la libération de glutamate de calcium dépendant du récepteur se produisant au cours des étapes de préparation de façon irréversible peut affecter la synthèse des protéines dans les tissus nerveux 35,36, 37. Utilisation de trancheuses manuelles de tissu peut aider à minimiser ce en permettant au processus soit terminé très rapidement par rapport à vibraslicers. Cependant, de nombreux laboratoires utilisent aussi efficacement vibraslicers avec les précautions nécessaires pour préserver la viabilité tranche. Un autre facteur important à considérer est la longue période d&#39;incubation avant de commencer les expériences. Cela a été noté pour être vraiment crucial pour parvenir à la stabilité des taux métaboliques de l&#39;Etat et d&#39;activation de la kinase dans les tranches après la perturbation provoquée lors de la préparation 23. Une telle stabilité est nécessaire pour la cohérence des enregistrements de longue durée. Nous soulignons de nouveau sur cette observation et suggérons les heures d&#39;environ 3 heures d&#39;incubation longues. Une variété de paramètres de stimulation sont connus pour induire la LTP, mais les mécanismes moléculaires induits dans chaque cas peut ne pas être le même (pour revue, voir 38). Cela peut influer sur la durabilité et d&#39;autres caractéristiques de la LTP, qui, à leur tour, peuvent affecter les résultats des expériences de marquage et de capture synaptiques. Par conséquent, il est important de valider les paradigmes de stimulation et caractéristiquesde la LTP obtenue dans des conditions de laboratoire performant et maintenir la cohérence. En général, nous ne considérons pas les expériences avec de très grandes volées de fibres présynaptiques et fEPSPs maximale inférieure à 0,5 mV et les expériences impliquant des changements substantiels dans la reprise de volée de fibre pendant les enregistrements sont également rejetées. En outre, tout en réalisant des expériences de deux ou trois voie-voie, il est important de veiller à l&#39;indépendance de la voie. Ceci peut être réalisé avec une double choc protocole de facilitation 28. Un inconvénient des systèmes d&#39;enregistrement de l&#39;interface est la formation de gouttelettes de condensation sur les électrodes pendant les heures d&#39;enregistrements de longue durée en raison des différences de température et d&#39;humidité entre la chambre et les environs. Ces gouttelettes doivent être soigneusement effacé de temps à autre. Sinon, les gouttelettes peuvent couler sur les tranches et provoquer des perturbations ou même la perte de signaux. Nous abordons habituellement ce by buvard habilement les gouttelettes guidées sous le microscope en utilisant un mince papier filtre mèche, sans toucher les électrodes. Cependant, la meilleure solution serait d&#39;utiliser un système de chauffage centralisé, tels que le système de télépéage mis au point par des chercheurs de l&#39;Université d&#39;Edimbourg. Sur une note finale, une variété de méthodologies existent dans les laboratoires du monde entier qui sont utilisés pour la préparation des tranches d&#39;hippocampe pour différentes fins expérimentales. Chaque procédure de l&#39;offre certains avantages sur l&#39;autre. Il faut optimiser attentivement les moindres détails du protocole pour répondre à l&#39;objectif de l&#39;expérience. Nous espérons que cet article contribue à améliorer certains aspects de la méthodologie pour étudier les processus fin associatif tels que STC et de contre-capture.

L’encodage et le stockage de l’information dans le cerveau restent le défi le plus important et le plus ardemment poursuivi en neurosciences. Au fil des ans, la potentialisation à long terme (LTP) et la dépression à long terme (LTD) sont devenues les principaux corrélats cellulaires de la mémoire1,2. Ces changements dépendants de l’activité, qui présentent une spécificité d’entrée et une associativité, entraînent la stabilisation des traces mnésiques dans les réseaux neuronaux 1,3,4. Le maintien des deux formes de plasticité synaptique nécessite la synthèse de produits liés à la plasticité (PRP)5-10. La spécificité des synapses, qui implique l’interaction de protéines nouvellement synthétisées uniquement avec des synapses activées spécifiques exprimant LTP ou LTD, est essentielle à la mémoire. Cette spécificité s’explique par le concept de « marquage et de capture synaptiques » (STC), où les PRP interagissent avec les synapses « marquées » récemment actives11,12. Le processus STC offre un cadre pour les propriétés associatives des mémoires au niveau cellulaire. Il nous fournit une base conceptuelle sur la façon dont les formes de plasticité à court terme sont transformées en formes de plasticité à long terme de manière associative et dépendante du temps13.
Au cours du processus de STC, une forte tétanisation dans une entrée qui conduit à une LTP tardive dépendante de la synthèse des protéines, entraîne le renforcement d’une LTP précoce indépendante de la synthèse des protéines induite dans une autre entrée indépendante sur la même population de neurones en une persistante13. La mise en place d’une étiquette synaptique locale par une activité neuronale transitoire et la synthèse des PRP diffusibles par l’activité neuronale forte sont les deux événements clés au cours de STC13,14. La capture des PRP par les synapses « marquées » récemment potentialisées est fondamentale pour le maintien de la potentialisation à long terme. De nombreuses études ont été réalisées pour confirmer l’existence du phénomène STC15-17 et identifier les 'tags'18 et les 'PRPs'19 candidats. Protéine kinase II dépendante du calcium/calmoduline (CaMKII) et kinase régulée par le signal extracellulaire1/2 (ERK1/2) ; CaMKIV, la protéine kinase M (PKM) et le facteur neurotrophique dérivé du cerveau (BDNF) sont quelques-unes des molécules candidates pour 'tag' et 'PRP' respectivement19-21. Le modèle de marquage synaptique a été élargi pour inclure les interactions associatives positives entre la LTP et la LTD - le « marquage croisé synaptique"22. Dans le traçage croisé synaptique, une LTP/LTD tardive dans une entrée synaptique transforme la LTD/LTP précoce opposée indépendante de la synthèse protéique en une entrée indépendante en sa forme durable ou vice versa22. 
La préparation de la coupe d’hippocampe est le modèle le plus largement utilisé dans les études de plasticité synaptique à long terme23,24. Une grande partie de la compréhension des concepts de marquage synaptique et de marquage croisé provient des études effectuées dans la région CA1 de l’hippocampe et, en raison de la complexité technique, de nombreux laboratoires sont encore incapables d’étudier ces processus. Les conditions expérimentales pour la préparation de coupes d’hippocampe de rat et l’enregistrement de LTP/LTD tardives stables pendant des heures prolongées sont extrêmement importantes pour étudier le marquage/croisement synaptique23,25,26. Cet article décrit les procédures expérimentales détaillées pour l’étude des processus de plasticité à long terme tels que les STC et le marquage croisé dans les neurones pyramidaux CA1 à l’aide d’enregistrements stables et à long terme du potentiel de champ de coupes aiguës de rats hippocampiques.

<table><tbody><tr><td>I. Outils de</td><td></td><td></td><td></td>dissection</tr><tr><td>1. Ciseaux à bandage</td><td>KLS Martin, Allemagne</td><td>21-195-23-07</td><td></td></tr><tr><td></td><td>B-Braun/Aesculap, Allemagne</td><td>LX553R</td><td></td></tr><tr><td>2. Ciseaux à iris</td><td>B-Braun/Aesculap, Allemagne</td><td>BC140R,BC100R</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr> <tr><td>3. Ingénieur en os</td><td>World Precision Instruments (WPI), Allemagne</td><td>14089-G</td><td></td></tr><tr><td>4. Scalpel</td><td>World Precision Instruments (WPI), Allemagne ;</td><td>500236-G</td><td></td></tr><tr><td></td><td>B-Braun/Aesculap, Allemagne</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>BB73</td><td></td></tr><tr><td>5. Lame de scalpel#11</td><td>B-Braun/Aesculap, Allemagne</td><td>BB511</td><td></td></tr><tr><td>6. Détartreur faucille</td><td>KLS Martin, Allemagne</td><td>38-685-00</td><td></td></tr><tr><td>7. Pince coudée</td><td>B-Braun/Aesculap, Allemagne</td><td>BD321R</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>8. Chambre d’anesthésie/induction</td><td>MIP Anesthesia Technologies (maintenant, Patterson Scientific), Oregon</td><td>AS-01-0530-LG</td><td></td></tr><tr><td>II. Produits chimiques</td><td></td><td></td><td></td>composants ACSF</tr><tr><td>1. Chlorure de sodium (NaCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5886</td><td></td></tr><tr><td>2. Chlorure de potassium (KCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>3. Sulfate de magnésium heptahydraté (MgSO4.7H20)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1880</td><td></td></tr><tr><td>4. Chlorure de calcium dihydraté (CaCl2.2H2O)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3881</td><td></td></tr><tr><td>5. Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9791</td><td></td></tr><tr><td>6. Bicarbonate de sodium (NaHCO3)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>7. D-Glucose anhydre (C6H12O6)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7021</td><td></td></tr><tr><td>III. Instruments d’électrophysiologie</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1. Microscope</td><td>Olympus, Japon</td><td>Modèle SZ61</td><td></td></tr><tr><td>2. Régulateur de température Scientific Systems</td><td>Design Inc. Canada</td><td>PTC03</td><td></td></tr><tr><td>3. Amplificateur différentiel AC</td><td>AM Systems, États-Unis</td><td>Modèle 1700</td><td></td></tr><tr><td>4. Stimulateur d’impulsions isolé</td><td>AM Systems, États-Unis</td><td>Modèle 2100</td><td></td></tr><tr><td>5. Oscilloscope</td><td>Rhode & Schwarz</td><td>HM0722</td><td></td></tr><tr><td>6. Convertisseur numérique-analogique</td><td>Cambridge Electronic Design Ltd. Cambridge, Royaume-Uni</td><td>CED-Power 1401-3</td><td></td></tr><tr><td>7. Interface Brain Slice Chamber</td><td>Scientific Systems Design Inc. Canada</td><td>BSC01</td><td></td></tr><tr><td>8. Pompe à tubulure</td><td>Ismatec, Idex Health & Science, Allemagne</td><td>REGLO-Analog</td><td></td></tr><tr><td>9. Débitmètre à carbogen</td><td>Cole-Parmer</td><td>03220-44</td><td></td></tr><tr><td>10. Illuminateur de lumière à fibre</td><td>Dolan-Jenner Industries</td><td>Fibre Lite MI-150</td><td></td></tr><tr><td>11. Micromanipulateurs</td><td>Marzhauser Wetzlar, Allemagne</td><td>00-42-101-0000 (MM-33)</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td>00-42-102-0000 (MM-32)</td><td></td></tr></tbody></table>

enquête de synaptic étiquetage / capture et de la croix-capture à l&#39;aide aiguë coupes d&#39;hippocampe des rongeurs

Investigation of Synaptic Tagging/Capture and Cross-capture using Acute Hippocampal Slices from Rodents

Le marquage et la capture synaptiques (STC) et le marquage croisé sont deux mécanismes importants au niveau cellulaire qui expliquent comment la spécificité et l’associativité des synapses sont obtenues dans les neurones dans un cadre temporel spécifique. Ces processus liés à la plasticité à long terme sont les principaux modèles candidats pour étudier la base de la formation et de la persistance de la mémoire au niveau cellulaire. Le STC et le marquage croisé impliquent deux processus en série : (1) la mise en place de l’étiquette synaptique comme déclenchée par un modèle spécifique de stimulation, et (2) la capture synaptique, par laquelle l’étiquette synaptique interagit avec les protéines liées à la plasticité (PRP) nouvellement synthétisées. Une grande partie de la compréhension des concepts de STC et de marquage croisé provient des études effectuées dans la région CA1 de l’hippocampe et, en raison de la complexité technique, de nombreux laboratoires sont encore incapables d’étudier ces processus. Les conditions expérimentales pour la préparation de coupes d’hippocampe et l’enregistrement de LTP/LTD tardives stables sont extrêmement importantes pour étudier le marquage/marquage croisé synaptique. Cet article vidéo décrit les procédures expérimentales pour étudier les processus de plasticité à long terme tels que les STC et le marquage croisé dans les neurones pyramidaux CA1 à l’aide d’enregistrements stables et à long terme du potentiel de champ de coupes aiguës de l’hippocampe de rats.

La méthodologie décrite a été utilisée pour étudier les formes durables de LTP / LTD et ses interactions associatives telles que le marquage synaptique et cross-capture à partir des tranches d&#39;hippocampe aigus de rats adultes. 23 Cette technique a prouvé son efficacité pour des expériences avec des rats (Wistar) et une variété de souches de souris 30,31. La méthodologie a été utilisée avec succès pour les enregistrements de LTP stables jusqu&#39;à 12.08 h. 32 Le «tag» fixé par le faible tétanisation d&#39;une entrée (S1) capte l&#39;induite par la forte tétanisation d&#39;un autre indépendant, mais se chevauchent entrée «PRP» (S2; figure 3B, cercles pleins) ainsi transformer le contraire en décomposition sous forme de LTP (début -LTP) en S1 en une longue durée (figure 3B, cercles ouverts) (A titre de comparaison de la petite-LTP induite par WTET voir 20,33). Les PRP capturés par les faiblesjeu de tétanisation tag ne doit pas nécessairement venir des induite STET-fin-LTP, mais peut aussi être fournie par l&#39;ESPA induite tardive LTD. Ce type d&#39;interaction associative positive entre LTP et LTD est dénommé «cross-tagging / capture &#39;. Le début LTP WTET-induite dans S1 ​​se renforce à la fin-LTP (figure 3C, cercles ouverts) en capturant les PRP fournis par l&#39;ESPA induite tardive LTD en S2 (figure 3C, cercles pleins). Statistiquement potentialisation ou une dépression importante a été maintenu dans S1 ​​et S2 dans les deux cas par rapport à sa propre ligne de base (test de Wilcoxon; P &lt;0,05). Pour l&#39;interaction de l&#39;étiquette-PRP de se produire, l&#39;ordre temporel des deux événements (faible-avant-forte / strong-avant-faible) est pas crucial tant que la fenêtre de temps entre les deux événements reste dans la fourchette de 30-60 minutes. Il serait sage d&#39;inclure un troisième, indépendante mais qui se chevauchent synaptique dansmettre et l&#39;utiliser comme un contrôle de base pour surveiller la stabilité des enregistrements. Les protocoles de stimulation électrique utilisés pour induire formes précoce et tardive de LTP / LTD doivent être validés dans des expériences à une seule entrée pour la cohérence et la fiabilité avant de les utiliser dans des expériences STC. Nous tenons également à souligner l&#39;importance de la méthodologie de préparation de tranches décrite dans le protocole depuis le succès de ces expériences dépend fortement de la qualité des tranches. <img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/53008/53008fig1.jpg" /> Figure 1. (a) des outils utilisés dans la dissection de l&#39;hippocampe: (a) Bandage Ciseaux (b) Iris ciseaux (c) os rongeur (d) de la spatule mince, (e) Numéro de Scalpel 11 (f) scaler Sickle (g) souple pinceau -bristle (h) de pipette en plastique Pasteur (i) un papier filtre (85mm) (j) de papier filtre (30mm) (k) de gobelets en verre (l) blocs de refroidissement en aluminium pour adapter boîte de Pétri et béchersplat (m) Petri. (B) de tissue chopper Manuel. (a) la plate-forme (b) coupe le bras avec porte-lame (c) Vernier micromètre, la résolution de 10 microns. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig1large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 2" src="/files/ftp_upload/53008/53008fig2.jpg" /> Figure 2. électrophysiologie mise en place pour les enregistrements de champ potentiel constitué par (a) des stimulateurs (b) un amplificateur différentiel (c) un convertisseur analogique-numérique (d) Oscilloscope (e) ordinateur avec un logiciel d&#39;acquisition (f) aux vibrations de table résistante (g) de microscope avec&gt; un grossissement de 4x (h) Interface chambre cerveau tranche (i) un système de perfusion pour l&#39;ACSF et carbogène alimentation (j) contrôleur de température (k) une source d&#39;éclairage (L) manipulateurs avec des porte-électrodes. (B) Interface cerveau-slicechambre. (C) et (D) des tranches d&#39;hippocampe dans la chambre de l&#39;interface. d&#39;électrodes en acier (E) inoxydable scellé dans un capillaire de verre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig2large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a> <img alt="Figure 3" src="/files/ftp_upload/53008/53008fig3.jpg" /> Figure 3. (A) Représentation schématique d&#39;une tranche et l&#39;électrode emplacement hippocampique transversal pour l&#39;enregistrement du champ potentiel: Dans cette représentation, les deux électrodes de stimulation (S1 et S2) sont positionnés dans le stratum radiatum de la région CA1 de stimuler deux indépendants mais se chevauchant entrées synaptiques sur les neurones pyramidaux CA1. Deux électrodes d&#39;enregistrement extracellulaires, d&#39;enregistrer un champ EPSP (potentiel excitateur post-synaptique) du compartiment dendritique apicale et un autre pour Somatic pic de population de la cellule pyramidalecorps, sont situés dans le stratum radiatum et strate pyramidale respectivement. CA1- corne d&#39;Ammon région 1, CA3- corne d&#39;Ammon région 3, dentées DG gyrus, fibres collatérales SC- Schaffer, S1-électrode de stimulation 1, l&#39;électrode de stimulation S2 2. (B) avant Faible forte paradigme pour étudier STC: tétanisation Faible (WTET) est appliquée au S1 (cercles ouverts) pour induire début LTP suivie par une forte tétanisation (STET) de S2 (cercles pleins) à 30 min pour induire la fin de LTP. Le début de LTP dans S1 ​​se renforce à la fin-LTP montrant marquage et de capturer l&#39;interaction (n = 6) (C) faible devant forte paradigme pour étudier croix-tagging:. Early-LTP est induite par WTET dans S1 ​​(cercles ouverts) suivie par l&#39;induction de la fin-LTD dans S2 (cercles pleins) en utilisant ESPA après 30 min. En S1, le début LTP est transformée à la fin-LTP durée 6 h montrant croix-tagging et de capture (n = 6). Seule flèche représente tétanisation faibles appliquée pour induire début LTP. Triplet de flèches représentetétanisation forte pour induire la fin de LTP. La flèche en pointillés représente le point où ESPA a été appliqué à l&#39;entrée synaptique représentant pour induire fin LTD-temps. Les barres d&#39;erreur représentent la SEM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/53008/53008fig3large.jpg" target="_blank">S&#39;il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.</a>

Cet article vidéo décrit des procédures expérimentales pour étudier la plasticité à long terme et ses processus associatifs tels que le marquage synaptique, la capture et le marquage croisé dans les neurones pyramidaux CA1 à l’aide de coupes aiguës d’hippocampe de rongeurs.

Enquête de Synaptic étiquetage / capture et de la Croix-capture à l&#39;aide aiguë coupes d&#39;hippocampe des rongeurs

Synaptic tagging and capture (STC) and cross-tagging are two important mechanisms at cellular level that explain how synapse-specificity and associativity ...

Le but global de cette procédure est d'étudier la plasticité à long terme et ses processus associatifs tels que le marquage synaptique, la capture et le marquage croisé dans les neurones paramédiaux du CA1 à l'aide de tranches hippocampiques Q provenant de rongeurs. Cela est réalisé en premier lieu en disséquant le cerveau et en isolant rapidement l'hippocampe dans un liquide céphalo-rachidien artificiel froid et oxygéné. La deuxième étape consiste à préparer des tranches hippocampiques aiguës à l'aide d'un découpeur manuel de tissus et à les incuber dans une chambre d'interface.Deux électrodes de stimulation et deux électrodes d'enregistrement sont ensuite placées dans la région CA1 afin d'enregistrer les réponses en PPSE de champ et en pic de population provenant de deux entrées synaptiques. La dernière étape consiste à induire une forme transitoire de plasticité dans une entrée synaptique et une forme persistante de plasticité dans une autre entrée, dans une fenêtre temporelle spécifique. Enfin, les réponses en PPSE de champ provenant des deux entrées sont enregistrées pendant des durées prolongées afin d'étudier les mécanismes de marquage synaptique, de capture et de capture croisée.L'étiquetage et la capture synaptiques fournissent une base conceptuelle expliquant comment la mémoire à court terme se transforme en mémoire à long terme au cours d'une période spécifique. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes expérimentales sont difficiles à apprendre, impliquant la stimulation et l'enregistrement à partir de multiples entrées synaptiques. La procédure sera démontrée par Mahesh Shira, machete et maima Sharma, étudiants diplômés de mon laboratoire.Pour commencer cette procédure, préparez un LCR A et faites-y barboter un mélange de 95 % d'oxygène et de 5 % de dioxyde de carbone. Remplissez le fond de la chambre d'interface avec de l'eau distillée jusqu'à environ 70 % de sa capacité. Ensuite, allumez le contrôleur de température réglé à 32 degrés Celsius.Ensuite, lavez la chambre supérieure pendant 10 à 15 minutes en faisant circuler de l'eau distillée à travers le tube d'entrée à un débit élevé, avant de passer à un LCS A à un débit d'un millilitre par minute. Placez ensuite un filet dans la chambre supérieure afin de fournir une surface de repos pour les tranches. Amorcez le carbogène dans la chambre inférieure en immergeant le tube d'entrée dans le LCS A qui est continuellement carbogéné.Prévoir 20 minutes pour que le LCR A soit saturé de carbogène et remplisse la chambre supérieure. Dans cette étape, fixer une lame de rasoir sur le hachoir à tissus et s'assurer que le tranchant est parfaitement aligné. Faire un test en hachant un petit morceau de papier filtre afin de vérifier que la lame est bien fixée.Ensuite, régler le micromètre vernier coulissant à sa position initiale. Prendre maintenant la tête d'un rat euthanasié et, à l'aide de ciseaux à iridectomie, pratiquer une incision à travers le crâne postérieur pour retirer le tronc cérébral. Puis effectuer une petite incision le long du côté droit du crâne et une incision plus longue du côté gauche.Retirer soigneusement le crâne avec un burin osseux en partant du côté gauche et en se déplaçant vers le côté droit du crâne. Pour exposer le cortex et la fine couche de dure-mère qui le recouvre, enlever délicatement la dure-mère à l’aide d’une spatule fine, puis retirer les plaques frontales avec le burin osseux. Ensuite, éliminer le reste de la dure-mère, en particulier au niveau de la jonction entre le cortex et le cervelet, à l’aide de l’extrémité plate de la spatule, en veillant à ne pas endommager le cerveau en maintenant la pression vers le haut.À l’aide de la spatule, prélever délicatement le cerveau et le déposer dans une boîte de Pétri placée sur un bloc réfrigérant en aluminium contenant du liquide A CSF froid et carbogazéifié, afin d’isoler l’hippocampe à l’aide d’un scalpel n°11. Effectuer une incision droite pour retirer le cervelet, puis une autre incision pour enlever un quart de la portion antérieure du cerveau. Ensuite, pratiquer une incision sagittale superficielle le long de la ligne médiane, en partant de celle-ci.Retirer soigneusement le cortex avec le curet en forme de faucille afin de découvrir l'hippocampe dorsal. Ensuite, enlever la couche de cortex située au-dessus de l'hippocampe. Pratiquer une petite incision dans le commissure hippocampique.Retirer délicatement l'hippocampe avec le scalpel en forme de faucille, en partant de l'extrémité dorsale en utilisant des mouvements de roulis. Ensuite, retirer tout cortex et tissus conjonctifs entourant l'hippocampe isolé à l’aide de l’extrémité courbe du scalpel en forme de faucille. Pour découper le tissu hippocampique, placer un morceau de papier filtre Watman de 30 millimètres imbibé de LCS sur le plateau de sectionnement du découpeur manuel.Transférez le tissu hippocampique sur le papier filtre. À l’aide de l’extrémité plate du scalpel en forme de faucille, déplacez le papier filtre afin d’aligner l’hippocampe dans une orientation appropriée par rapport à la lame du coupeur, de sorte que l’hippocampe soit sectionné selon un angle d’environ 70 degrés par rapport au fia. Ensuite, absorbez la solution excédentaire entourant le tissu hippocampique.Avec un papier filtre plié, sectionnez l'hippocampe transversalement et écartez les tissus situés à l'extrémité extrême de l'hippocampe, où la morphologie des tranches n'est pas claire. Ensuite, découpez le tissu restant en tranches de 400 micromètres d'épaisseur en ajustant le micromètre vernier après chaque série de coupes. Après chaque coupe, transférez délicatement la tranche de la lame à l'aide d'un pinceau à poils doux vers un petit bécher rempli de liquide A CSF froid et carbogasé.Ensuite, transférez délicatement les tranches sur le filet dans la chambre à tranches à l’aide d’une pipette Pasteur en plastique propre. À l’aide d’une pipette à embout large, ajustez soigneusement la position des tranches de manière à faciliter le positionnement de l’électrode et la vérification de l’enregistrement, en veillant à ce que les tranches soient suffisamment entourées par une couche de ASCF, sans toutefois être complètement immergées. Ensuite, couvrez la chambre et incubez les tranches pendant deux à trois heures dans le cadre d’expériences de marquage et de capture synaptiques.Sous le microscope, positionner les deux électrodes de stimulation dans la couche radiatum du CA1 afin de stimuler les fibres collatérales de Schaffer, et placer une électrode d’enregistrement dans la région dendritique apicale du CA1, à mi-chemin entre les électrodes de stimulation. Pour enregistrer les réponses F-E-P-S-P, placer une autre électrode d’enregistrement dans la couche stratum pyramidale pour l’enregistrement du pic de population.Lorsque toutes les électrodes touchent la tranche, appliquez une stimulation d'essai afin de vérifier qu'un signal de PPS évoquée convenable peut être obtenu dans les deux entrées. Une fois un signal F-E-P-S-P correct obtenu, abaissez soigneusement les électrodes d'environ 200 micromètres supplémentaires à l’aide des molettes de réglage fin des manipulateurs. Attendez ensuite 20 minutes pour permettre à la tranche de se rétablir.Ensuite, déterminez la relation entrée-sortie en mesurant la pente du PPS évoqué en champ en fonction d'une gamme d'intensités de courant allant de 20 microampères à 100 microampères. Puis, pour chaque entrée, fixez l'intensité de stimulation provoquant 40 % de la pente maximale du PPS évoqué en champ comme stimulus constant tout au long de l'expérience. Après 15 à 20 minutes, commencez l'enregistrement d'une ligne de base stable d'au moins 30 à 60 minutes avant l'induction de la PPL-PTD dans une entrée, puis induisez une PPL précoce à l'aide d'un protocole de tétrain faible composé d'une seule stimulation à haute fréquence.Alors que l'autre entrée continue d'enregistrer la ligne de base pendant 30 minutes après l'induction de la PLT précoce, induisez une PLT tardive dans l'entrée S deux, en utilisant un protocole de tétrain fort impliquant une stimulation à haute fréquence répétée avec un intervalle inter-tétrain de 10 minutes. Ensuite, enregistrez les réponses du PEPS évoqué pendant des durées prolongées afin de révéler la transformation de la PLT précoce dans l'entrée S un en PLT tardive par le marquage synaptique et la capture. De manière similaire, dans une expérience de capture croisée, induisez d'abord une PLT précoce dans une entrée, suivie 30 minutes plus tard par l'induction d'une DPT tardive dans une autre entrée, en utilisant un protocole de stimulation à basse fréquence intense composé de 900 salves sur une durée de 15 minutes.Ensuite, enregistrez les réponses du PEPS de champ pendant des durées prolongées afin de révéler la transformation du LTP précoce dans l'entrée S1 en LTP tardif par le phénomène de capture croisée. Dans cette représentation, deux électrodes de stimulation sont positionnées dans la couche radiatum du secteur CA1 pour stimuler deux entrées synaptiques indépendantes mais partiellement superposées. Vers les neurones paramédians du CA1, deux électrodes d'enregistrement extracellulaires.Un pour enregistrer le F-E-P-S-P à partir du compartiment dendritique apical. Et un autre pour enregistrer le pic de population somatique à partir des corps cellulaires paramétraux situés respectivement dans le stratum radiatum et le stratum para. Cette figure montre la semaine précédant le paradigme fort permettant d'étudier le marquage synaptique et la capture.Une tétranie faible est appliquée à S un pour induire une LTP précoce, suivie d'une tétranie forte de S deux après 30 minutes afin d'induire une LTP tardive, et cette figure montre la condition précédant le paradigme fort pour étudier le marquage croisé. La LTP précoce est induite par une tétranie faible dans S un, suivie de l'induction d'une LTD tardive dans S deux à l'aide d'un protocole de stimulation à basse fréquence intense. Après 30 minutes dans S un, la LTP précoce se transforme en LTP tardive persistant six heures, démontrant le phénomène de marquage et de capture croisés.Une fois maîtrisée, cette technique de dissection et de préparation des tranches peut être réalisée très rapidement en trois à cinq minutes. Ainsi, la viabilité des tranches peut être préservée pour des enregistrements à long terme. À l’aide de cette méthode, on peut également tester les effets de différents agents pharmacologiques sur les processus de marquage synaptique et de capture.Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la manière de réaliser des expériences à long terme sur la plasticité fonctionnelle ainsi que des processus de marquage synaptique et de capture.

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