Bioingénierie des microenvironnements humanisés de la moelle osseuse dans la souris et leur visualisation par imagerie en direct

L'objectif général de cette méthode est d'implanter des échafaudages porteuses de cellules humaines chez des souris afin de créer des niches de moelle osseuse humanisées, puis d'observer en temps réel le comportement des cellules humaines à l'intérieur des implants. Cette méthode permettra de répondre à des questions clés dans le domaine de l'hématopoïèse humaine, car elle permet de reproduire et d'imager en direct, à la résolution monocellulaire, différents composants de la moelle osseuse. La polyvalence de ce système constitue l'un de ses principaux avantages, car elle autorise l'implantation de différents composants de la niche, séparément ou en combinaison.

Cette méthodologie pourrait potentiellement être appliquée à d'autres domaines de recherche, comme l'étude des métastases tumorales ou le criblage de médicaments. En utilisant une technique stérile appropriée, commencez par découper une éponge de gélatine stérilisée en 24 morceaux de taille similaire. Réhydratez les supports de gélatine par immersion dans de l'éthanol, puis dans du PBS.

Ensuite, tamponnez délicatement chaque échafaudage sur un tissu stérile pour éliminer le liquide en excès, puis transférez les échafaudages dans des puits individuels d'une plaque 24 puits à adhérence ultra faible. À l’aide d’une seringue à insuline, injectez soigneusement de un fois 10 à la puissance cinq à un fois 10 à la puissance six cellules stromales dans 50 microlitres de milieu de culture dans chaque échafaudage, puis placez la plaque dans une étuve à culture cellulaire. Lors de l’injection des cellules dans l’échafaudage, veillez à ce qu’il n’y ait aucune fuite de liquide à l’extérieur de l’échafaudage.

Après une heure, remplir chaque puits avec trois millilitres de milieu frais de culture cellulaire, puis remettre les échafaudages dans l'incubateur. Après 24 heures, injecter une fois 10 à la puissance 5 cellules hématopoïétiques dans les échafaudages, suivre d'une incubation et d'une addition supplémentaire de milieu, puis d'une incubation de 24 heures comme vient d'être démontré. Pour la préparation d'échafaudages porteurs de la protéine morphogénétique osseuse humaine recombinante deux, placer les échafaudages reconstitués dans des puits individuels d'une plaque 96 puits en U, puis ajouter cinq microlitres de protéine morphogénétique osseuse humaine recombinante deux à chaque échafaudage.

Ensuite, recouvrez les échafaudages avec 20 microlitres de thrombine et 20 microlitres de fibrinogène. Pour l'implantation chirurgicale des échafaudages bio-ingénierisés, rasez d'abord la zone chirurgicale située sur le dos de la souris expérimentale, puis utilisez un coton-tige imbibé de chlorhexidine diluée pour nettoyer la surface cutanée exposée trois fois dans chaque sens. Ensuite, utilisez des pinces stériles et un scalpel pour pratiquer une incision de 0,5 à 0,7 centimètre d'avant en arrière dans la peau, puis insérez les pinces sous le tissu sous-cutané afin de créer une poche.

Insérez l'échafaudage profondément dans la poche et refermez l'incision avec de la colle chirurgicale. Laissez les échafaudages implantés se développer pendant huit à 24 semaines avant l'explantation. Après l'administration intraveineuse de substances fluorescentes et l'euthanasie des animaux, stérilisez la peau comme vient de l'être démontré et pratiquez une incision cutanée longitudinale sur le dos de l'animal, près du site d'implantation initial.

Séparez soigneusement la peau de la poche sous-cutanée où le support a été implanté, puis utilisez une pince pour saisir délicatement le support et couper prudemment la membrane résiduelle et les tissus environnants afin de récupérer la structure. Utilisez une colle adhésive à prise rapide pour fixer le support sur une boîte de Pétri de 35 par 10 millilitres. Pour les supports contenant la protéine morphogénétique osseuse deux, avant de remplir la boîte avec du PBS, utilisez un microforet chirurgical sous un microscope microchirurgical afin d'amincir la surface osseuse, permettant ainsi de visualiser les fluorophores et d'obtenir une acquisition d'images à haute résolution.

Soignez particulièrement le perçage, car l'épaisseur de l'os varie généralement d'un échafaudage à l'autre, et il est important de ne pas endommager la surface. Remplissez la boîte avec du PBS à température ambiante. Pour l'imagerie par microscopie à deux photons des échafaudages bio-ingénierisés, placez l'échafaudage sur la platine du microscope confocal et sélectionnez l'objectif à immersion dans l'eau de 20 fois avec une ouverture numérique de 1,0.

Ensuite, dans le mode d'acquisition du logiciel d'imagerie, sélectionnez la case Afficher les outils manuels. Dans le menu laser, activez le laser à deux photons et laissez-le chauffer et se stabiliser. Lorsque le laser est prêt, dans le menu de configuration de l'imagerie, activez le mode canal et activez le suivi de chaque image.

Dans le menu du trajet de lumière, sélectionnez « non balayé » et le séparateur de faisceau principal MBS 760 plus. Activez les quatre détecteurs non balayés et configurez-les comme illustré dans le schéma. Dans le menu des canaux, réglez la longueur d'onde du laser à 890 nanomètres et la puissance à 50 %. Réglez le gain maître entre 500 et 600, le décalage numérique à zéro, et le gain numérique à 15 pour chaque canal.

En mode d'acquisition, réglez les paramètres appropriés pour obtenir des images haute résolution sans endommager le tissu ni décolorer les fluorophores. Réglez ensuite le zoom à un pour le balayage initial de l'image. Une fois tous les paramètres définis, abaissez l'objectif jusqu'à ce qu'il touche la solution saline, puis réglez manuellement la mise au point de l'objectif en utilisant une lampe comme source de lumière.

Activez maintenant le menu Z-stack et sélectionnez la fonction début-fin. Réglez l'intervalle requis entre deux tranches consécutives et sélectionnez « live » pour acquérir une numérisation en direct de l'échantillon, en ajustant le gain numérique et le décalage numérique selon les besoins pour une exposition optimale. Pour visualiser plusieurs canaux simultanément, sélectionnez la fonction de séparation.

Dans le menu des étapes, en mode direct, balayez l'image et marquez les régions d'intérêt, comme l'emplacement des cavités osseuses. Une fois le balayage de l'échantillon terminé, déplacez-vous vers la première région d'intérêt, puis utilisez les fonctions définir premier et définir dernier en mode direct pour régler le haut et le bas de la pile 3D en Z entourant la zone d'intérêt. Ensuite, positionnez le centre, C, puis cliquez sur le bouton démarrer l'expérience pour commencer l'acquisition d'images en pile Z de la région d'intérêt.

Lorsque l'acquisition est terminée, enregistrez les images dans le dossier désigné et analysez la prochaine région d'intérêt. Sur ces images représentatives, on peut observer la morphologie générale de différentes matrices récupérées chez des souris NSG immunodéficientes huit semaines après implantation. La co-semaille avec des cellules endothéliales humaines augmente la vascularisation de la matrice, tandis que l'ajout de la protéine morphogénétique osseuse humaine recombinante deux induit la formation osseuse.

Ces échafaudages observés par microscopie à deux photons en temps réel révèlent la présence de vaisseaux sanguins dans les échafaudages ainsi que l'engrèvement à long terme des cellules hématopoïétiques humaines dans le parenchyme de l'échafaudage. Les échafaudages ensemencés avec des cellules endothéliales humaines et des cellules stromales mésenchymateuses illustrent la participation des cellules endothéliales humaines à la formation de vaisseaux à l'intérieur de l'échafaudage, conduisant à une vascularisation chimérique murin-humaine. La formation de tissu osseux peut être visualisée par microscopie à deux photons, de même que la formation de cavités dans la vascularisation humanisée au niveau du tissu endostéal, qui présente une forte ressemblance avec le tissu endostéal de la moelle osseuse humaine.

De plus, dans des échafaudages porteurs de la protéine morphogénétique osseuse humaine recombinante deux, la morphologie du tissu à l'intérieur de l'échafaudage ressemble à celle de la moelle osseuse mature avec du tissu adipeux, ce qui suggère que les cellules souches mésenchymateuses humaines contribuent également à la formation du tissu adipeux. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de tous les échafaudages bio-ingénierisés et des principaux échafaudages murins. N'oubliez jamais de maintenir un environnement aseptique et prenez des précautions supplémentaires lors de la manipulation des échafaudages.

Tenez compte des limites associées à cette méthode, telles que les chimères humain-souris des tissus. Souvenez-vous qu'après l'imagerie, les échantillons peuvent être utilisés pour des études supplémentaires, car les supports peuvent être digérés et, par conséquent, des cellules vivantes peuvent être récupérées à partir de ceux-ci.