Bioingénierie des microenvironnements humanisés de la moelle osseuse dans la souris et leur visualisation par imagerie en direct

L’objectif global de cette méthode est d’implanter des échafaudages de porteurs de cellules humaines dans des souris pour créer des niches de moelle osseuse humanisées, puis d’imager en direct le comportement des cellules humaines à l’intérieur des implants. Cette méthode aidera à répondre à des questions clés dans le domaine de l’hématopoïétique humain car elle permet de reproduire et d’imager en direct à la résolution d’une seule cellule différents composants de la moelle osseuse. La polyvalence de ce système est l’un de ses principaux avantages, car il permet l’implantation de différents composants de niche un par un ou en combinaison.

Cette méthodologie pourrait potentiellement être appliquée à d’autres domaines de recherche, comme les métastases tumorales ou les études de dépistage de médicaments. En utilisant la technique stérile appropriée, commencez par couper une éponge de gélatine stérilisée en 24 morceaux de taille similaire. Reconstituer les échafaudages de gélatine par immersion dans de l’éthanol puis dans du PBS.

Ensuite, tamponnez doucement chaque échafaudage sur un tissu stérile pour éliminer l’excès de liquide, puis transférez les échafaudages dans des puits individuels d’une plaque à 24 puits à très faible attachement. À l’aide d’une seringue à insuline, injectez soigneusement une fois 10 à une fois 10 à une fois 10 à la sixième cellules stromales dans 50 microlitres de milieu de culture dans chaque échafaudage et placez la plaque dans un incubateur de culture cellulaire. Lors de l’injection des cellules dans l’échafaudage, assurez-vous qu’il n’y a pas de fuite de l’échafaudage.

Au bout d’une heure, remplissez chaque puits avec trois millilitres de milieu de culture cellulaire frais et remettez les échafaudages dans l’incubateur. Après 24 heures, injecter une fois 10 à la cinquième cellule hématopoïétique dans les échafaudages, suivie d’une incubation et d’un ajout de milieu supplémentaire, et d’une incubation de 24 heures comme nous venons de le démontrer. Pour la génération de deux échafaudages porteurs de protéine morphogénétique osseuse humaine recombinante, placez les échafaudages reconstitués dans des puits individuels d’une plaque à fond en U de 96 puits et ajoutez cinq microlitres de protéine morphogénétique osseuse humaine recombinante deux à chaque échafaudage.

Couvrez ensuite les échafaudages avec 20 microlitres de thrombine et 20 microlitres de fibrinogène. Pour l’implantation chirurgicale des échafaudages bio-modifiés, rasez d’abord la zone chirurgicale sur le dos de la souris expérimentale et utilisez un coton-tige trempé dans de la chlorhexidine diluée pour nettoyer la surface de la peau exposée trois fois dans chaque direction. Ensuite, utilisez une pince stérile et un scalpel pour faire une incision de 0,5 à 0,7 centimètre de l’avant à l’arrière de la peau, et insérez la pince sous le tissu sous-cutané pour faire une poche.

Insérez l’échafaudage profondément dans la poche et fermez l’incision avec de la colle chirurgicale. Laissez les échafaudages implantés se développer pendant huit à 24 semaines avant l’explantation. Après l’administration intraveineuse de substances fluorescentes et l’euthanasie des animaux, stérilisez la peau comme nous venons de le démontrer et faites une incision cutanée longitudinale sur le dos de l’animal, près du site d’implantation d’origine.

Séparez soigneusement la peau de la poche sous-cutanée où l’échafaudage a été implanté, puis utilisez une pince à épiler pour saisir doucement l’échafaudage et coupez soigneusement la membrane résiduelle et les tissus entourant l’échafaudage pour récupérer la structure. Utilisez de la colle adhésive à action rapide pour fixer l’échafaudage à une boîte de Pétri de 35 x 10 millilitres. Pour les protéines morphogénétiques osseuses à deux échafaudages, avant de remplir la plaque de PBS, utilisez une micro-perceuse chirurgicale sous un microscope microchirurgical pour amincir la surface osseuse, permettant la visualisation des fluorophores et la capture à haute résolution des images.

Soyez particulièrement prudent pendant le processus de forage car l’épaisseur de l’os varie généralement d’un échafaudage à l’autre et il est important de ne pas casser la surface. Remplissez le plat avec du PBS à température ambiante. Pour l’imagerie par microscopie à 2 photons des échafaudages issus de la bio-ingénierie, placez l’échafaudage sur la platine du microscope confocal et sélectionnez la lentille d’immersion dans l’eau 20 fois 1,0 NA.

Ensuite, dans le mode d’acquisition du logiciel d’imagerie, sélectionnez la case afficher les outils manuels. Dans le menu laser, allumez le laser à 2 photons et laissez le laser se réchauffer et se stabiliser. Lorsque le laser est prêt, dans le menu de configuration de l’imagerie, activez le mode de canal et changez de piste à chaque image.

Dans le menu du trajet de la lumière, sélectionnez séparateur de faisceau principal MBS 760 plus, non débalayé. Activez les quatre détecteurs non désançonnés et définissez la configuration comme illustré dans le schéma. Dans le menu des canaux, réglez la longueur d’onde du laser sur 890 nanomètres et la puissance sur 50 %Réglez le gain maître sur 500 à 600, le décalage numérique sur zéro et le gain numérique sur 15 pour chaque canal.

En mode acquisition, réglez les paramètres appropriés pour obtenir des images à haute résolution sans endommager les tissus et blanchir les fluorophores. Réglez ensuite le zoom sur un pour le balayage initial de l’image. Lorsque tous les paramètres ont été réglés, abaissez la lentille jusqu’à ce qu’elle touche la solution saline et réglez manuellement la mise au point de la lentille à l’aide d’une lampe comme source lumineuse.

Activez maintenant le menu Z-stack et sélectionnez l’avant-dernière fonction. Réglez l’intervalle requis entre deux tranches subséquentielles et sélectionnez en direct pour obtenir une image de balayage en direct de l’échantillon, en ajustant le gain numérique et le décalage numérique si nécessaire pour une exposition optimale. Pour visualiser plusieurs canaux en même temps, sélectionnez la fonction de fractionnement.

Dans le menu de la scène, en mode direct, scannez l’image et marquez les régions d’intérêt, telles que l’emplacement des cavités osseuses. Une fois le balayage de l’échantillon terminé, passez à la première région d’intérêt et utilisez les fonctions set first et set last en mode en direct pour définir le haut et le bas de la pile Z 3D entourant la zone d’intérêt. Réglez ensuite le centre, C, et cliquez sur le bouton Démarrer l’expérience pour démarrer l’acquisition de l’image de la pile Z de la région d’intérêt.

Une fois l’acquisition terminée, enregistrez les images dans le dossier prévu à cet effet et numérisez la prochaine région d’intérêt. Dans ces images représentatives, on peut observer la morphologie grossière de différents échafaudages récupérés chez des souris NSG immunodéficientes huit semaines après l’implantation. Le co-ensemencement avec des cellules endothéliales humaines augmente la vascularisation de l’échafaudage, tandis que l’ajout de la protéine morphogénétique osseuse humaine recombinante deux induit la formation osseuse.

Ces échafaudages imagés par microscopie à 2 photons en direct révèlent la présence de vaisseaux sanguins dans les échafaudages et la greffe à long terme des cellules hématopoïétiques humaines dans le parenchyme de l’échafaudage. Des échafaudages ensemencés de cellules stromales endothéliales et mésenchymateuses humaines illustrent la participation des cellules endothéliales humaines à la formation des vaisseaux à l’intérieur de l’échafaudage, ce qui entraîne une vascularisation chymérique murine-humaine. La formation du tissu osseux peut être visualisée par la microscopie à 2 photons, ainsi que la formation de cavités dans le système vasculaire humanisé du tissu endoste, qui ressemble beaucoup au tissu endosté de la moelle osseuse.

De plus, dans les deux échafaudages porteurs de la protéine morphogénétique osseuse humaine recombinante, la morphologie du tissu à l’intérieur de l’échafaudage ressemble à celle de la moelle osseuse mature avec du tissu adipeux, ce qui suggère que les cellules stromales mésenchymateuses humaines contribuent également à la formation du tissu adipeux. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de tous les bio-ingénieurs et des principaux échafaudages murins. N’oubliez jamais de maintenir un environnement ascétique et de redoubler de prudence lors de la manipulation des échafaudages.

Gardez à l’esprit les limitations associées à cette méthode, telles que les chimères homme-souris des tissus. N’oubliez pas qu’après l’imagerie, les échantillons peuvent être utilisés pour d’autres études, car les échafaudages peuvent être digérés et, par conséquent, des cellules vivantes peuvent en être extraites.