Name: Extraction de l’échantillon et une quantification par chromatographie en phase simultanée de doxorubicine et mitomycine C après combinaison de médicaments en nanoparticules à des souris de tumeur-roulement (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-05T13:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 57 s
Description: Apprenez à extraire et quantifier simultanément la doxorubicine, la mitomycine C et la doxorubicinol dans des matrices biologiques par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse. Cette méthode robuste facilite l'étude de la nanopharmacocinétique des combinaisons médicamenteuses.

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Les auteurs remercient la subvention d’équipement de sciences naturelles et du Conseil de recherche en génie (CRSNG) du Canada pour HPLC, la subvention de fonctionnement de l’Institut canadien de recherche en santé (IRSC) et le Canadian Breast Cancer Research (RSARF) Alliance à X.Y. Wu et la bourse de l’Université de Toronto à R.X. Zhang et T. Zhang.

toutes les expérimentations animales ont été approuvées par Animal Care Comité du réseau universitaire de santé à l’Institut ontarien du Cancer et réalisées selon le Canadian Council on Animal Care Guidelines.
 1. préparation de l’échantillon biologique <ol><li>recueillir le sang entier, les principaux organes et du sein tumeur à des moments prédéterminés après administration par voie intraveineuse (i.v.) de médicaments contenant des formulations (par exemple, DMPLN, DOX liposomale) <ol><li>injecter un i.v. de souris avec tumeur du sein avec une formulation préparée contenant un medicament.</li>
		<li>Anesthésier la souris aux moments désignés (par exemple, 15 min) en donnant l’isoflurane inhalables de 2 % dans une enceinte étanche.</li>
		<li>Posez la souris anesthésiée sur son dos et mettre son nez à travers un embout qui alimente constamment 2 % isoflurane. 
		Remarque : Pour garantir la souris subit une anesthésie profonde, légèrement pincer les membres avant de la souris et recherchez de n’importe quel mouvement contractions.</li>
		<li>Nettoyer les régions de poitrine et l’abdomen à l’aide d’éthanol à 70 % et puis effectuez un terminal intérieur de ponction cardiaque sur les souris anesthésiés profondes à l’aide d’une seringue héparinée 1 mL et une aiguille de 23 G.</li>
		<li>Collecter le sang dans une étiquette sodium héparine pulvérisé le tube en plastique et agiter doucement le tube afin de s’assurer que le sang recueilli entre en contact avec l’héparine de revêtement de la paroi du tube. Recueillir un minimum de 50 µL de sang total. Gardez toujours les échantillons sur glace</li>
		<li>Tape tous les quatre membres de la souris à sécuriser et à ouvrir la cavité abdominale et la cage thoracique de la souris à l’aide d’une paire de ciseaux et pinces. Décaler les intestins vers le côté et poussez le foie vers le haut pour exposer suffisamment la veine porte. Couper la veine pour le drainage sanguin.</li>
		<li>Perfuse le corps de toute souris avec 50 mL de glacé salin de 0,9 % à travers le cœur à l’aide d’une seringue de 10 mL avec une aiguille 25 G. 
		NOTE : Plier l’aiguille à 90° pour guidant la seringue dans la veine porte.</li>
		Ordre <li>organes d’accise dans ce qui suit : cœur, poumons, foie, rate, les reins. Puis, séparer la tumeur du sein les tissus conjonctifs environnants à l’aide d’une paire de ciseaux de l’incision à la coussinets adipeux mammaire droite de la souris. Recueillir tous les organes individuellement dans des tubes en polypropylène de 1,5 mL et congelez-les rapidement dans l’azote liquide. 
		&#8203; Remarque : séparer la vésicule biliaire du foie.</li>
		<li>Conserver le sang total à 4 ° C et tissus excisés dans le congélateur à-80 ° C jusqu'à l’analyse CLHP.</li>
	</ol></li> <li>Extrait DOX, MMC et DOXol de matrices biologiques.
	<ol><li>Peser tous les tissus disséqués congelés rapidement et de les transférer dans un tube conique arrondie du fond de 13 mL. Pour éviter le métabolisme des médicaments possibles ou dégradation, conserver les échantillons sur Ice.</li>
		<li>Ajouter 1 à 5 mL de tampon de lyse cellulaire glacée dans le tube. 
		Remarque : Le volume de mémoire tampon à utiliser dépend de la masse de tissu selon le ratio de tissu-tampon de 1 g : 5 mL (p/v) ; pour les petits organes, comme le cœur et la rate, le ratio est de 1 g : 2 mL.</li>
		<li>Utiliser un mouvement haut-bas coup pour homogénéiser les échantillons de tissus sur la glace à une vitesse de 18 000 tr/min en utilisant un homogénéisateur main myoélectrique. 
		Remarque : Homogénéisation terminée nécessite environ 3 à 5 itérations d’un processus d’homogénéisation courte de moins de 15 s, suivi par le tissu de refroidissement sur la glace entre chaque courte homogénéisation.</li>
		<li>Laver la sonde de générateur de dent de scie de 10 mm de l’homogénéisateur avec distillée désionisée (DDI) H 2 O, éthanol à 70 %, puis DDI H 2 O entre chaque échantillon de tissu pour éviter la contamination croisée.</li>
		<li>Transférer 50 µL d’homogénat tissulaire ou de sang dans un tube en polypropylène de micro-centrifugeuse de 1,5 mL et spike avec 5 µL d’un intérieur standard (I.S.) 4-méthylumbelliférone (4-MU) (2000 ng/mL) dans le tube. 
		Remarque : la solution de 4-MU a été préparée dans le méthanol ici.</li>
		<li>Ajouter 250 µL d’un solvant d’extraction glacée dans le tube contenant le sang entier ou homogénat tissulaire. 
		Remarque : Le solvant d’extraction est constitué de 60 % d’acétonitrile (ACN) et l’acétate d’ammonium 40 % (5 mM) avec pH ajusté à pH = 3,5 à l’aide d’acide formique de 0,05 %. Utiliser un échantillon de 1:5 (v/v) : solvant d’extraction ratio volume.</li>
		<li>Vigoureusement vortex le mélange pendant 2 min, centrifuger à 3 000 x g force à 4 o C pendant 10 min et ajouter 200 µL de surnageant dans un autre tube de micro-centrifugeuse frais préalablement réfrigéré.</li>
		<li>S’évaporer surnageant à 60 ° C sous un lent courant d’azote gazeux avec protection contre la lumière.</li>
		<li>Reconstituer le résidu séché avec 100 µL de méthanol glacé, vigoureusement les Vortexer pendant 30 s et centrifuger à 3000 x g à 4 ° C pendant encore 5 min.</li>
		<li>Transvaser le surnageant dans un encart de flacon HPLC et placer les flacons d’échantillon dans un bac d’échantillonneur automatique pour injection.</li>
	</ol></li></ol> 2. Instrumentation HPLC et paramètres d’opération <ol><li>préparer HPLC phase mobile avec une reproductibilité compatible <ol><li>500 ml de qualité HPLC H 2 O à l’aide d’une éprouvette graduée.</li>
		<li>500 ml de qualité HPLC acétonitrile (ACN) à l’aide d’une éprouvette graduée distincte.</li>
		<li>Soigneusement ajouter 0,5 mL d’acide trifluoroacétique (TFA) (CAUTION) dans chacun des 500 mL H 2 O et ACN pour obtenir la phase mobile H 2 O et ACN contenant 0,1 % TFA, respectivement. 
		NOTE : TFA est corrosif et toxique et doit être manipulé sous une hotte de laboratoire. Tous les mélanges de solvants sont préparés à la température ambiante.</li>
		<li>Phases mobiles filtre à travers un filtre à membrane en nylon avec un 0,45 µm taille de pore et le transférer dans des bouteilles de réservoir propres HPLC.</li>
	</ol></li> <li>Instrumentation montage HPLC pour la détection simultanée de 4-MU DOX, MMC et DOXol et I.S..
	<ol><li>Mettre en marche la pompe à gradient, dé-gasser, échantillonneur automatique, détecteur à photodiode et multi détecteur de fluorescence λ.</li>
		<li>D’entrée les conditions initiales de composition de la phase mobile à 16,5 % H 2 O (0,1 % TFA) et 83,5 % ACN (0,1 % TFA) (v/v).</li>
		<li>Régler le détecteur UV sur deux canaux, l’un à 310 nm pour 4-MU (I.S.) et l’autre à 360 nm pour MMC.</li>
		<li>Régler le détecteur de fluorescence sur deux canaux, l’un à λ ex / λ em = 365/445 nm pour 4-MU et l’autre à λ ex / λ em = 480 nm/560 nm pour DOX et DOXol, respectivement.</li>
		<li>Régler un isocratique débit de 1,0 mL/min.</li>
		<li>Équilibrer une colonne de 18 préinstallé phase inverse C (4,6 mm x 250 mm, 5 µm) à température ambiante pendant 10 min pour la création de la ligne de base.</li>
	</ol></li> <li>Séparer les médicaments (DOX, MMC, DOXol et 4-MU) à l’aide d’État gradient de phase mobile.
	<ol><li>Injecter 15 µL d’échantillons extraits et re-concentrés à l’aide de l’échantillonneur automatique.</li>
		<li>Changer progressivement la condition initiale de la phase mobile (reportez-vous à l’étape de protocole 2.2.2) à 100 % ACN (0,1 % TFA) pendant 18 min à l’aide de la pompe à gradient automatisée. 
		Remarque : Pendant le processus de séparation, quatre canaux (deux absorbants UV et deux fluorescentes) apparaître simultanément avec chaque canal affichant un médicament composé (reportez-vous à l’étape du protocole 2.2.3 et 2.2.4).</li>
		<li>Conserver 100 % de ACN (0,1 % TFA) pendant 1 min et puis retour à la condition initiale phase mobile dans 1 min.</li>
		<li>Re-conditionner la colonne avec la phase mobile initiale à débit de 1,5 mL/min, 4 min pour l’injection de l’échantillon suivante.</li>
	</ol></li></ol> 3. Validation de l’HPLC <ol><li>élaborer des normes de travail de DOX, MMC et DOXol et 4-MU (I.S.).
	<ol><li>Peser séparément de 1 mg de poudre de drogue DOX et MMC (prudence) et 4-MU sur une nouvelle petite pesée papier (2 de 3 x 3 pouces). 
		Notez que tous les médicaments anticancéreux sont considérés comme un danger pour la santé qui peut causer mutagénicité de cellules germinales et de toxicité aiguë par inhalation ou ingestion. Ils doivent être manipulés avec soin avec des gants et des masques.</li>
		<li>Transférer la pesée DOX, MMC et 4-MU dans un nouveau tube de la micro-centrifugeuse polypropylène individuels 1,5 mL.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de methJerome et vortexer brièvement pour obtenir la concentration de 1 mg/mL de MMC et DOX.</li>
		<li>Ajouter 1 mL de méthanol dans un flacon contenant préalablement pesé à 1 mg de DOXol (prudence) et vortex brièvement pour obtenir la concentration de 1 mg/mL de DOXol. 
		Remarque : DOXol est un métabolite toxique cardio et doit être manipulé avec soin.</li>
		<li>Pipette 20 µL des solutions mères préparées de DOX, MMC, DOXol et 4-MU dans un nouveau séparer le tube micro-centrifuge en polypropylène de 1,5 mL et ajouter 980 µL du méthanol pour obtenir une norme de travail de 20 µg/mL de chaque drogue.</li>
		<li>Diluer 20 µg/mL de DOX, MMC et DOXol à l’aide de méthanol pour obtenir les normes de travail de 50 ng - 20 µg/ml pour DOX, MMC et DOXol et 2000 ng/mL pour I.S. 4-MU.</li>
		<li>Joint le capuchon du tube de solutions de travail avec un morceau étroit de pelliculeuse de paraffine pour éviter l’évaporation du méthanol, enrouler le tube entier avec du papier aluminium pour éviter l’exposition à la lumière directe et les conserver à -20 ° C.</li>
	</ol></li> <li>Déterminer la linéarité, la précision et l’exactitude de DOX, MMC et DOXol dans des matrices biologiques (c.-à-d., de sang et tumeur homogénat).
	<ol><li>Simultanément spike 5 µL de normes de travail de DOX et DOXol (50 ng/mL - 20 µg/mL), MMC (1 000 ng/mL - 16 µg/mL) et 4-MU (2 µg/mL) dans 50 µL de sang vide ou homogénat tissulaire dans les tubes en polypropylène de micro-centrifugeuse à obtenir la courbe de concentration standard allant de 5-2000 ng/mL pour les composés médicamenteux et 200 ng/mL pour 4-MU (I.S.).</li>
		<li>Effectuer le test d’extraction drogue décrit dans le protocole 1.2.</li>
		<li>Utiliser des concentrations faibles, médianes et hautes de DOX et DOXol (50, 500 et 2 000 ng/mL) et MMC (100, 1000, 2 000 ng/mL) pour la précision intra - et inter - jour. 
		NOTE : Préparer des concentrations standards frais le jour de l’analyse.</li>
	</ol></li> <li>Analyse des échantillons <ol><li>injecter 15 µL de l’échantillon à l’aide de l’échantillonneur automatique.</li>
		<li>Changer progressivement de la phase mobile plus de 0 à 18 min, augmentant la composition d’ACN au cours de l’intervalle.</li>
		<li>Après 18 min, maintenir l’état de phase mobile pendant 1 min.</li>
		<li>Reviennent à l’état initial au cours de la prochaine 2 min, puis ré-équilibrer pendant 4 min avant l’injection suivante.</li>
		<li>Après chaque échantillon exécuter, on remarquera que les pics de composés médicamenteux avec leurs temps de rétention sont indiqués comme suit : MMC, DOXol, 4-MU (I.S.) et DOX.</li>
		<li>Intégrer la surface sous la courbe (AUC) de composés médicamenteux à l’aide de logiciels HPLC du pic.</li>
		<li>Calculer le rapport AUC entre chaque médicament composé et I.S. (équation 1) et les courbes standards établis selon les mêmes procédures d’extraction permet de déterminer les concentrations de médicament de DOX, MMC et DOXol dans la formulation de DMPLN. 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56159/56159eq1.jpg" /></li> <li>calculer le pourcentage de récupération de médicaments (équation 2) en comparant les concentrations de médicament reconstituées à l’aide de méthanol des extraits d’échantillons biologiques enrichis à celle de la norme (&#34; pur &#34;) solution dans le méthanol des drogues. 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56159/56159eq2.jpg" /></li></ol></li></ol>

Les auteurs n’ont pas des intérêts financiers divergents et les conflits d’intérêts.

Par rapport aux autres méthodes chromatographiques qui permettent la détection d’une espèce seul médicament à la fois, le présent protocole HPLC est capable de doser simultanément trois composés médicamenteux (DOX, MMC et DOXol) dans la même matrice biologique sans avoir à changer la phase mobile. Cette méthode de préparation et d’analyse a été appliquée avec succès pour déterminer la pharmacocinétique et la bio-distribution de deux systèmes de délivrance de médicaments à base de nanoparticules (c.-à-d. liposoma...

Pourtant, il est souvent associé à des effets indésirables graves et une efficacité limitée en raison de la résistance aux médicaments et autres facteurs1,2,3, la chimiothérapie est une modalité de traitement primaire pour nombreux cancers. Pour améliorer les résultats de la chimiothérapie, régimes de combinaison de drogue ont été appliquées à la clinique fondée sur des considérations telles que les toxicités non chevauchantes, différents mécanismes d’action des médicaments et drogues non-Croix résistance4,5 , 6. dans les essais cliniques, un meilleur taux de réponse tumorale a été souvent observé en utilisant simultanément administré des combinaisons de médicaments par rapport à un régime de médicaments séquentielle livraison7,8. Cependant, à cause de moins qu’optimale bio-distribution des formes de médicaments gratuits, injection simultanée de plusieurs médicaments peut causer toxicité des tissus normaux qui l’emporte sur l’effet thérapeutique9,10,11. Livraison de médicaments nanocarrier a démontré que modifier la pharmacocinétique et la bio-distribution de médicaments encapsulés, améliorant l’accumulation ciblée tumeur12,13,14. Comme dans nos articles récents, nanoparticules chargés conjointement avec des associations médicamenteuses synergiques ont démontré la capacité d’atténuer les problèmes rencontrés par des combinaisons de médicaments gratuits, en raison de leur prestation conjointe contrôlée temporelle et spatiale de plusieurs médicaments de tissu tumoral, ce qui permet des effets synergiques de médicaments contre le cancer cellules4,15,16. Ainsi, l’efficacité thérapeutique supérieure et une faible toxicité ont été démontrés dans les deux études pré-cliniques et cliniques4,17,18.
Nos études antérieures au in vitro constaté que la combinaison de deux médicaments anticancéreux, doxorubicine (DOX) et la mitomycine C (MMC), produit un effet synergétique contre plusieurs lignées de cellules de cancer du sein et, en outre, co chargement DOX et MMC dans des nanoparticules hybrides polymère lipidique (DMPLN) a surmonté diverses résistantes à plusieurs médicaments associés efflux pompes (p. ex., P-glycoprotéine et protéine résistante du cancer du sein)19,20,21. In vivo, DMPLN permis co-exécutants spatio-temporelle de DOX et MMC aux sites tumoraux et biodisponibilité accrue de médicaments dans les cellules cancéreuses, comme indiqué par la modération de la formation du métabolite DOX doxorubicinol (DOXol)22. En conséquence, le DMPLN amélioré l’apoptose des cellules tumorales, inhibition de la croissance tumorale et la survie prolongée hôte par rapport à la pour libre combinaison DOX / MMC ou un liposomale DOX formulation22,23,24, 25.
Analysant le montant réel de médicaments fourni conjointement par nanocarrier est critique pour la conception de formulations NANOPARTICULAIRES efficace. Plusieurs méthodes ont été développées pour analyser le taux plasmatique de doses uniques de DOX ou MMC à l’aide de la chromatographie liquide haute performance (HPLC) seule ou en combinaison avec la spectrométrie de masse (MS)26,27,28 , 29 , 30 , 31 , 32 , 33 , 34. Toutefois, ces méthodes sont souvent fastidieux et peu pratique pour la thérapie de combinaison comme un grand nombre d’échantillons biologiques doivent être préparés séparément pour l’analyse de plusieurs médicaments (parfois, y compris leurs métabolites). En plus de la liaison aux protéines plasmatiques fort de MMC et DOX, les globules rouges ont également une grande capacité à se lier et se concentrent de nombreux médicaments anticancéreux35,36. Ainsi, analyse du plasma pour DOX ou MMC peut masquer des concentrations sanguines réelles de la drogue. Le présent travail (Figure 1) décrit un simple et robuste, méthode d’analyse de drogues multiples à l’aide de CLHP en phase inverse à extraire simultanément et à quantifier DOX, MMC et le doxorubicinol de métabolite DOX (DOXol) de sang et de tissus différents ( par exemple, des tumeurs). Il a été avec succès appliqué pour déterminer la pharmacocinétique et la bio-distribution de MMC et DOX, ainsi que la formation de DOXol après administration de médicaments par l’intermédiaire des solutions libres ou formes de nanoparticules (c.-à-d., DMPLN et DOX liposomale) dans un orthotopically implanté le modèle murin du sein-tumeur de la souris après par voie intraveineuse (i.v.) injection22.

<table><tbody><tr><td>Doxorubicine&nbsp ;</td><td>Polymed Theraeutics</td><td>111023</td><td>Médicament anticancéreux</td></tr><tr><td>Mitomycine C</td><td>Polymed Theraeutics</td><td>060814</td><td>Médicament anticancéreux</td></tr><tr><td>Doxorubicinol (DOXol)</td><td>Toronto Research Chemicals</td><td>D558020</td><td>Métabolite du sel sodique de DOX</td></tr><tr><td>4-Methylumbelliferone&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M1508</td><td>Étalon interne</td></tr><tr><td>Acide myristique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>544-63-8&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Matériaux pour nanoparticules hybrides poly-lipidiques</td></tr><tr><td>Polyoxyéthylène (100) Spectre de stéarate</td><td></td><td>M1402</td><td>Matériaux pour nanoparticules hybrides poly-lipidiques</td></tr><tr><td>Stéarate de polyoxyéthylène (40)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3440</td><td>Matériaux pour nanoparticules hybrides polylipidiques</td></tr><tr><td>Pluronic F68 (PF68)</td><td>BASF Corp.</td><td>9003-11-6</td><td>Matériaux pour nanoparticules hybrides polylipidiques</td></tr><tr><td>Ultrasonication (UP100H)</td><td>Hielscher, Technologie des ultrasons</td><td>NA</td><td>Préparation des nanoparticules</td></tr><tr><td>Bain d’eau (ISOTEMP 3016HS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>NA</td><td>Préparation des nanoparticules</td></tr><tr><td>Doxorubicine liposomale&nbsp ; (Caelyx)</td><td>Janssen</td><td>Acheté à la pharmacie de l’hôpital Princess Margaret</td><td>Formulation de nanoparticules cliniquement approuvée&nbsp ;</td></tr><tr><td>Méthanol classé HPLC</td><td>Caledon Chemicals</td><td>6701-7-40</td><td>Composition de la phase mobile HPLC</td></tr><tr><td>H2O</td><td>Caledon Chemicals</td><td>8801-7-40</td><td>Composition de la phase mobile HPLC</td></tr><tr><td>Acétonitrile classé HPLC&nbsp ;</td><td>Caledon Chemicals</td><td>1401-7-40</td><td>HPLC composition de la phase mobile</td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>302031</td><td>HPLC composition de la phase mobile</td></tr><tr><td>0,45 &mu ; m Papier filtre à membrane en nylon</td><td>Whatman</td><td>WHA7404004</td><td>HPLC préparation de phase mobile</td></tr><tr><td>1cc Seringues en plastique</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>2606-309659</td><td>Injection de traitement</td></tr><tr><td>5cc Seringues en plastique</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>2608-309646</td><td>Collections de tissus</td></tr><tr><td>30G 1/2 Aiguilles</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305106</td><td>Injection de traitement</td></tr><tr><td>25G 5/8 Aiguilles</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>305122</td><td>Collections de tissus</td></tr><tr><td>Stérile 0,9 % saline</td><td>Université de Toronto House Brand</td><td>1011</td><td>Perfusion tissulaire</td></tr><tr><td>13 ml Tube conique à fond arrondi&nbsp ;</td><td>SARSTEDT</td><td>62.515.006</td><td>Prolyprolène, homogénéisation tissulaire</td></tr><tr><td>Milieu essentiel minimum alpha (MEM)&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>12571063</td><td>Milieu cellulaire</td></tr><tr><td>1 x tampon phosphate Saline</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td>Homogénéisation tissulaire</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100-100 ML</td><td>Homogénéisation tissulaire</td></tr><tr><td>Acide formique</td><td>Caledon Chemicals</td><td>1/5/3840</td><td>Ajuster le pH pour le solvant d’extraction</td></tr><tr><td>Tubes en plastique pulvérisés à l’héparine de sodium</td><td>Becton, Dickinson and Company</td><td>367878</td><td></td></tr><tr><td>Balance analytique</td> de prélèvement sanguin<td>Sartorius&nbsp ;</td><td>CPA225D</td><td></td></tr><tr><td>pH-mètres NA’sp ;</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-637-671</td><td>accumet BASIC</td></tr><tr><td>Vortex Mixter</td><td>Fisher Scientific</td><td>02-215-365</td><td>Vortex d’échantillons à la vitesse souhaitée</td></tr><tr><td>1,5 ml&nbsp ; Tube de microcentrifugation</td><td>Fisherbrand</td><td>2043-05408129</td> Homogénéisateur de <td>prolyprolène</td></tr><tr><td>modèle 1000</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-451-672</td><td>Homogénéisation des tissus</td></tr><tr><td>Centrifugeuse 5702R</td><td>Eppendorf</td><td>5702R</td><td>Préparation de l’extraction</td></tr><tr><td>Système d’évaporateur chauffé</td><td>Glas-Col</td><td>NA</td><td>Reconstitution d’échantillons</td></tr><tr><td>HPLC Filetage Flacons</td><td>DIKMA</td><td>5320</td><td>Injection d’échantillons HPLC</td></tr><tr><td>Bouchons à vis HPLC avec septa en silicone blanc PTFE</td><td>DIKMA</td><td>5325</td><td>Injection d’échantillons HPLC</td></tr><tr><td>Insert en polypropylène HPLC&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Agilent Technologies</td><td>5182-0549</td><td>Volume maximum 250 &mu ; l, injection d’échantillon HPLC</td></tr><tr><td>Xbridge C18 Column</td><td>Waters Corporation</td><td>186003117</td><td>Analyse de drogues</td></tr><tr><td>Pompe à gradient&nbsp ;</td><td>Waters Corporation</td><td>W600</td><td>Analyse</td></tr><tr><td>de drogues Échantillonneur automatique</td><td>Waters Corporation</td><td>W2707</td><td>Analyse de drogues</td></tr><tr><td>Détecteur de photodiodes à barrettes</td><td>Waters Corporation</td><td>W2998</td><td>Analyse de médicaments</td></tr><tr><td>Multi &lambda ; détecteur de fluorescence&nbsp ;</td><td>Waters Corporation</td><td>W2475</td><td>Analyse de médicaments</td></tr><tr><td>EMPOWER 2</td><td>Waters Corporation</td><td>NA</td><td>Logiciel d’analyse de données</td></tr><tr><td>Scientifique</td><td>Micromath</td><td>NA</td><td>Analyse pharmacocinétique</td></tr><tr><td>Souris femelles Balb/c</td><td>Jackson Laboratory</td><td>001026</td><td>In vivo</td></tr><tr><td>EMT6/WT Cellules cancéreuses du sein</td><td>Fourni par le Dr Ian Tannock ; Institut du cancer de l’Ontario</td><td>NA</td><td>In vivo</td></tr></tbody></table>

extraction de l’échantillon et une quantification par chromatographie en phase simultanée de doxorubicine et mitomycine c après combinaison de médicaments en nanoparticules à des souris de tumeur-roulement

Sample Extraction and Simultaneous Chromatographic Quantitation of Doxorubicin and Mitomycin C Following Drug Combination Delivery in Nanoparticles to Tumor-bearing Mice

Chimiothérapie d’association est fréquemment utilisée en clinique pour le traitement du cancer ; Cependant, les effets indésirables associés aux tissus normaux peuvent limiter ses bienfaits thérapeutiques. Combinaison de médicaments à base de nanoparticules a été démontré pour atténuer les problèmes rencontrés par le traitement d’association de médicaments gratuits. Nos études antérieures ont montré que la combinaison de deux médicaments anticancéreux, doxorubicine (DOX) et la mitomycine C (MMC), produit un effet de synergie contre les deux murin et cancer du sein humain cellules in vitro. Les nanoparticules de hybride co-chargés polymère-lipidiques DOX et MMC (DMPLN) contourné différentes pompes de transporteur d’efflux qui confèrent une résistance multidrogue et efficacité accrue démontrée dans les modèles de tumeurs du sein. Par rapport aux formes de solution conventionnelle, telle une efficacité supérieure de DMPLN a été attribuée à la pharmacocinétique synchronisée de DOX et MMC et biodisponibilité accrue de drogues intracellulaire dans les cellules tumorales activées par le nanocarrier PLN.
Afin d’évaluer la pharmacocinétique et la bio-distribution de co-administration DOX et MMC en solution gratuite et en forme de nanoparticules, une méthode d’analyse de plusieurs médicaments simples et efficaces à haute performance phase inverse, chromatographie en phase liquide (HPLC) a été mis au point. Contrairement aux méthodes rapportés précédemment analysés individuellement les DOX ou MMC dans le plasma, cette nouvelle méthode HPLC est capable de doser simultanément DOX, MMC et un métabolite majeur de DOX cardio toxiques, doxorubicinol (DOXol), dans diverses matrices biologiques ( par exemple, sang, tumeur du sein et du coeur). Un double fluorescent et ultraviolet absorbant sonde 4-méthylumbelliférone (4-MU) a été utilisé comme étalon interne (RI) pour la détection d’une étape d’analyse des drogues multiples avec des longueurs d’onde de détection différentes. Cette méthode a été appliquée avec succès pour déterminer les concentrations de DOX et MMC livré par les approches de nanoparticules et de solution dans le sang entier et divers tissus dans un modèle murin de tumeur orthotopique du sein. La méthode analytique présentée est un outil utile pour l’analyse préclinique de livraison à base de nanoparticules de combinaisons de médicaments.

Deux médicaments anticancéreux, DOX et MMC, ainsi que le métabolite DOX, DOXol, ont été détecté en même temps sans aucune interférence biologique sous la condition d’HPLC dégradée appliquée même en utilisant 4-MU comme l’I.S. pour la fluorescence et détecteurs UV. DOX, MMC, DOXol et 4-MU étaient bien séparés les uns des autres avec des temps de rétention de 5,7 min pour MMC, 10,4 min pour DOXol, 10,9 min pour 4-MU et 11,1 min pour DOX (Figure 2). Chaque médic...

Ce protocole décrit un processus analytique efficace et pratique de l’extraction de l’échantillon et le dosage simultané de plusieurs drogues, doxorubicine (DOX), la mitomycine C (MMC) et un métabolite DOX cardio toxiques, doxorubicinol (DOXol), dans le biologique échantillons d’un modèle de tumeur mammaire précliniques traitement avec des formulations de nanoparticules de combinaison synergique de médicaments.

Extraction de l’échantillon et une quantification par chromatographie en phase simultanée de doxorubicine et mitomycine C après combinaison de médicaments en nanoparticules à des souris de tumeur-roulement

Combination chemotherapy is frequently used in the clinic for cancer treatment; however, associated adverse effects to normal tissue may limit its ...

L’objectif global de ce protocole analytique est d’extraire et de quantifier simultanément les deux médicaments anticancéreux Doxorubicine et Mitomycine C, co-délivrés par des nanoparticules hybrides polymère-lipide, et le métabolite de la doxorubicine, le doxorubicinol, dans des matrices biologiques à l’aide d’une méthode simple et robuste de chromatographie liquide à haute performance en phase inverse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la nanomédecine, telles que la conception d’un système de nanoportage efficace basé sur la nanopharmacocinétique des combinaisons de médicaments. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de quantifier simultanément trois composés médicamenteux dans la même matrice biologique, sans qu’il soit nécessaire de modifier la phase mobile de la HPLC.Ainsi, cette méthode peut donner un aperçu des comportements biologiques de la doxorubicine, de la mitomycine C et du doxorubicinol dans les tumeurs mammaires primaires. Il peut également être appliqué à d’autres types de cancer traités avec des médicaments similaires. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car les étapes efficaces

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Insonation de microbulles est une stratégie prometteuse pour l'ablation de tumeurs à réduire les délais de moyenne puissances acoustiques, ainsi que pour l'administration ciblée de médicaments. Le but de la présente étude est de développer des stratégies à faible rapport cyclique échographie pulsation et de maximiser l'ablation nanovecteurs microvasculaires non-thermique et la livraison de charge utile au-cutanée C6 gliomes.

L&#39;échographie de contraste ciblées traitement des gliomes chez la souris via la livraison de drogue nanoparticules-Bearing et l&#39;ablation microvasculaire

Nous décrivons une méthode d'imagerie de la réponse à un traitement...

Vivez l&#39;imagerie des réponses de drogues dans le microenvironnement des tumeurs dans les modèles murins de cancer du sein

Cet article détaille les procédures d'analyse d'imagerie optique de la nanoparticule tumeur ciblée, Herdox. En particulier, l'utilisation de détail du dispositif d'imagerie multimode pour détecter le ciblage tumoral et l'évaluation de la pénétration tumeur est décrit ici.

Analyse de la protéine virale ciblée nanoparticules administrées à HER2 + Tumeurs

Un exemple d'un médicament à base de nano acide malique est présentée vers la conception rationnelle de médicament personnalisé qui est applicable à un cancer. Il décrit la synthèse d'un médicament pour traiter le cancer nano sein HER2-positif humain dans une souris nude.

Biopolymères à base d&#39;acide malique Nano pour le ciblage des marqueurs tumoraux multiples: une opportunité pour la médecine personnalisée?

Nous décrivons ici la méthode d’imagerie basée sur la microscopie confocale à fluorescence fibreuse (FCFM), qui fournit un mode innovant pour comprendre les phénomènes physiologiques aux niveaux cellulaire et subcellulaire chez les sujets animaux.

Induits par la chimiothérapie vasculaire Toxicité - en temps réel<em&gt; In vivo</em&gt; Imagerie de déficience navire

L’accumulation intra-tumorale hétérogène de liposomes a été liée à un microenvironnement tumoral anormal. Ici, des méthodes sont présentées pour mesurer la microcirculation tumorale par imagerie de perfusion et une pression de fluide interstitiel élevée (IFP) à l’aide d’un système robotique guidé par l’image. Les mesures sont comparées à l’accumulation intratumorale de liposomes, déterminée à l’aide de l’imagerie volumétrique par micro-tomodensitométrie.

Mesures spatiales de Perfusion, la pression du liquide interstitiel et Liposomes Accumulation dans Solid Tumors

Un protocole pour la préparation et la caractérisation de la doxorubicine lipophile pro-médicament chargé 1,2-distéaroyl sn - glycéro-3-phosphoethanolamine- N - [amino (polyéthylène glycol) -2000] (DSPE-PEG) micelles est décrite.

Préparation et caractérisation des lipophile doxorubicine micelles Pro-drogue

Nanoparticules émergent des systèmes de délivrance de médicaments prometteurs pour un large éventail d'indications. Ici, nous décrivons une méthode simple mais puissant pour la fabrication de nanoparticules de soie en utilisant un reverse engineering soie Bombyx mori. Ces nanoparticules de soie peuvent être facilement chargés avec une charge thérapeutique et ensuite examinées pour des applications de délivrance de médicaments.

Fabrication and Drug Delivery Applications de soie Nanoparticules

La mauvaise compréhension des performances in vivo des nanomédicaments entrave leur traduction clinique. Les procédures d’évaluation du comportement in vivo des nanomédicaments anticancéreux aux niveaux systémique, tissulaire, unicellulaire et subcellulaire chez des souris immunocompétentes porteuses de tumeurs sont décrites ici. Cette approche pourrait aider les chercheurs à identifier des nanomédicaments anticancéreux prometteurs pour l’application clinique.

Une procédure exhaustive pour évaluer la<em&gt; In Vivo</em&gt; Performance du Cancer nanomédicaments

Dans ce protocole, les nanoparticules d’or modifiées AS1411-g-PEI-g-PEG chargées de doxorubicine sont synthétisées via des réactions d’amide en trois étapes. Ensuite, la doxorubicine est chargée et administrée pour cibler les cellules cancéreuses pour le traitement du cancer.

Synthèse de nanoparticules d’or modifiées Aptamer-PEI-g-PEG chargées de doxorubicine pour l’administration ciblée de médicaments

Ici, nous décrivons le protocole d’administration in vivo de nanoparticules d’oxyde de fer magnétiques portant des oligomères d’ARN au cancer du sein métastatique dans des modèles animaux, fournissant une approche cliniquement viable pour le silençage thérapeutique des acides nucléiques oncogènes.

Surveillance de l’accumulation de nanomédicaments dans les métastases du cancer du sein murin

Apprenez à extraire et quantifier simultanément la doxorubicine, la mitomycine C et la doxorubicinol dans des matrices biologiques par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse. Cette méthode robuste facilite l'étude de la nanopharmacocinétique des combinaisons médicamenteuses.

Extraction de l’échantillon et une quantification par chromatographie en phase simultanée de doxorubicine et mitomycine C après combinaison de médicaments en nanoparticules à des souris de tumeur-roulement (Vidéo) | JoVE Journal

Extraction de l’échantillon et une quantification par chromatographie en phase simultanée de doxorubicine et mitomycine C après combinaison de médicaments en nanoparticules à des souris de tumeur-roulement

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