Protocole pour la synthèse en phase solide d'oligomères d'ARN contenant un 2'- O -thiophénylméthyle Modification et caractérisation via le dichlorisme circulaire

L’objectif général de ce rapport est d’illustrer la procédure d’obtention d’oligonucléotides d’ARN par synthèse en phase solide. Des dodécamères d’ARN seront synthétisés sous forme de modèles et leur purification et caractérisation seront également démontrées. Par son volet visuel, cette publication permettra d’élargir le champ des méthodologies et des installations utilisées par les chercheurs dans divers domaines.

Fournir une aide visuelle, ainsi qu’un peu de protocole permettra aux chercheurs d’utiliser ces techniques. L’un des avantages de cette technique est qu’elle se prête à un large éventail de modifications. Alors que les applications d’aujourd’hui deviennent de plus en plus exigeantes, il est important de disposer d’un protocole standard.

La chimie des phosphoramidites connaît un regain d’intérêt en raison de la robustesse de la méthode et de son potentiel d’obtention d’oligonucléotides pour des applications thérapeutiques. Bien que l’achat d’oligonucléotides soit attrayant, le prix et la disponibilité des modifications déplacent l’intérêt vers la préparation de ces oligomères en interne, ce qui rend cette procédure de la plus haute importance. Pour commencer cette procédure, pesez chaque phosphoramidite dans des bouteilles ambrées de 10 millilitres séchées au four et bouchez chaque bouteille avec un septum préalablement perforé avec une aiguille de calibre 20.

Placez immédiatement les bouteilles sous vide à l’aide d’un dessiccateur contenant un agent de séchage. Après avoir rempli le dessiccateur avec de l’argon sec, retirez chaque flacon et ajoutez immédiatement de l’acétonitrile anhydre avant de le fixer sur un synthétiseur de peptides en phase solide. Ensuite, retirez les septa de chaque bouteille et placez-les sur le synthétiseur via une fonction de changement de bouteille.

Pour configurer la synthèse en phase solide, sélectionnez l’icône du logiciel. Sélectionnez le nom du synthétiseur et cliquez sur OK. Ensuite, créez une nouvelle synthèse en sélectionnant Fichier et Nouvel ordre de synthèse. Ensuite, utilisez la fenêtre d’invite pour entrer la date d’exécution, le client et l’ID d’exécution.Sélectionnez l’instrument, le nom de la séquence et la séquence.

Sous l’onglet Cycle, attribuez la méthode précédemment créée. Ensuite, choisissez le manuel End Procedure, qui laisse l’oligonucléotide lié à la résine CPG. Sélectionnez DMT Off.

Enregistrez le fichier en sélectionnant Fichier et Enregistrer sous.Ensuite, donnez un nom à l’expérience et cliquez sur Enregistrer. Ensuite, envoyez le fichier pour commencer la synthèse en sélectionnant Commander et Envoyer l’ordre au synthétiseur. Dans la fenêtre d’invite, sélectionnez une position de colonne et cliquez sur OK. Dans la fenêtre Synthétiseur, sélectionnez Moniteur Trityl.

Cliquez sur Choisir une fonction et sur Trityl Monitor à chaque étape en tapant 1. Commencez la synthèse en sélectionnant Synthétiseur et Préparer à démarrer. Placez les colonnes avec l’extrémité à trois premiers choix souhaitée sur les positions indiquées sur l’instrument.

Ensuite, cliquez sur Démarrer et Non sur l’instrument. Une fois la synthèse terminée, retirez la colonne de l’instrument et placez-la dans une fiole à fond rond. Séchez la colonne sous pression réduite pendant environ 0,5 heure.

Transférez la résine blanche de la colonne dans un tube à centrifuger de 1,6 millilitre et ajoutez 0,5 millilitre d’une solution aqueuse de méthylamine et d’ammoniac. Fixez le capuchon du tube de centrifugation avec du parafilm et chauffez le contenu à 60 degrés Celsius pendant une heure et demie. Placez un objet lourd sur le dessus des tubes pour vous assurer que la concentration est maintenue constante.

Après refroidissement à température ambiante, centrifugez brièvement l’échantillon pour faire tourner le contenu. Ensuite, transférez le surnageant dans un nouveau tube à centrifuger. Refroidissez le tube à 70 degrés Celsius en le plaçant dans un bain d’éthanol à la glace sèche pendant cinq minutes, puis concentrez-vous jusqu’à ce qu’il soit sec à l’aide d’un concentrateur d’aspirateur rapide.

Maintenant, remettez les solides en suspension dans 0,4 millilitre d’une solution de trihydrafluorure d’amine, puis fixez le capuchon avec un film de laboratoire. Chauffez la solution à 60 degrés Celsius pendant une heure et demie. Placez un objet lourd sur le dessus des tubes pour assurer une concentration constante.

Après avoir refroidi la solution à température ambiante, ajoutez 0,04 millilitre d’une solution d’acétate de sodium suivie d’un mélange doux avec une pointe de pipette. Ajoutez un millilitre d’éthanol et refroidissez la solution à environ 70 degrés Celsius avec un bain d’éthanol à la glace sèche pendant 15 minutes. Ensuite, centrifugez la solution à 15 000 tr/min à quatre degrés Celsius pendant dix minutes.

À l’aide d’une pipette, extraire le surnageant et sécher la pastille obtenue sous pression réduite. Après séchage, remettre en suspension le solide et le tampon de chargement obtenus, et mélanger jusqu’à ce que la solution soit homogène. Ensuite, chargez la suspension sur un gel de polyacrylamide préalablement préparé.

Appliquez un courant à travers le gel jusqu’à ce que le marqueur bleu de brométhymol soit situé entre la moitié et les deux tiers du gel. Après avoir retiré le gel du support, transférez le contenu du gel du verre dans la pellicule plastique et placez-le sur une plaque de chromatographie à couche mince recouverte de silice, pour visualiser les bandes à l’aide d’une lampe UV. Utilisez un marqueur pour délimiter la position où se trouve la bande supérieure et coupez-la à l’aide d’une lame de rasoir.

Placez le gel contenant l’ARN dans un tube conique de 50 millilitres et écrasez-le en petits morceaux à l’aide d’une tige de verre. Maintenant, suspendez les résidus de gel dans une solution aqueuse de chlorure de sodium et agitez la suspension à 37 degrés Celsius pendant 12 heures. Transférez la suspension dans un tube de 15 millilitres, puis centrifugez-la à 3400 tr/min pendant dix minutes.

Pour dessaler l’échantillon à l’aide d’une cartouche C18 en phase inverse, lavez d’abord la cartouche avec de l’acétonitrile, de l’eau, du chlorure d’ammonium aqueux et la solution d’ARN, en laissant les résidus de gel derrière vous. Après le lavage à l’eau, éluez l’ARN de la colonne à l’aide de trois millilitres de solution aqueuse de méthanol à 60 % dans trois tubes à essai différents. Refroidissez les tubes à 70 degrés Celsius dans un bain de glace sèche pendant cinq minutes, puis concentrez le contenu à sec à l’aide d’un concentrateur d’aspirateur rapide.

Après avoir concentré l’éluant sous pression réduite, redissolvez le résidu dans 0,3 millilitre d’eau sans RNase. Après avoir dilué la solution, déposez un microlitre sur l’instrument UV vis pour mesurer le spectre UV vis entre 200 et 450 nanomètres. Pour l’analyse MALDI-TOF, lavez d’abord une pointe de pipette C18 avec 50 % d’acétonitrile.

Équilibrez la pointe de la pipette avec 0,1 % d’acide trifluoroacétique. Ensuite, chargez la pointe de la pipette avec une solution contenant 100 à 150 picomoles d’échantillon. Après avoir lavé la pointe de la pipette avec 0,1 % de TFA et de l’eau, éluez l’échantillon dans une solution contenant la matrice souhaitée.

Déposez 0,9 microlitre de la solution sur une plaque MALDI et laissez sécher l’échantillon. Pour l’analyse de la structure de l’ARN, transférez l’échantillon contenant de l’ARN dans une microcuvette et placez-le dans le passeur d’échantillons d’un instrument de dichroïsme circulaire. Ouvrez le réservoir d’azote pour fournir un débit qui déplace le flotteur d’air situé sur l’instrument à environ 40.

Ensuite, allumez le refroidisseur. Maintenant, allumez l’instrument. Ouvrez le logiciel en cliquant sur l’icône Gestionnaire de spectre, puis ouvrez la fenêtre d’acquisition en cliquant sur Mesure du spectre.

Après avoir purgé l’instrument avec de l’azote, obtenez les spectres de dichroïsme circulaire en sélectionnant Mesure et paramètres. Sous l’onglet Général, sélectionnez 200-350 nanomètres pour le balayage, CD et HT pour les canaux, 0,1 nanomètre pour le pas de données, 100 nanomètres par minute pour la vitesse de balayage, un nanomètre pour la bande passante et cinq pour le nombre d’accumulations. Sous l’onglet Unité de cellule, choisissez 20 degrés Celsius.

Sous l’onglet Contrôle, sélectionnez L’obturateur s’ouvre et se ferme automatiquement. Sous l’onglet Informations, saisissez le nom de l’échantillon, l’opérateur, la concentration et le solvant. Sous l’onglet Données, accédez au dossier souhaité et cliquez sur OK. Acquérez les spectres en cliquant sur Mesurer, puis sur Mesure de l’échantillon.

Enfin, identifiez les positions des cuvettes dans le passeur d’échantillons de un à six, et cliquez sur OK. Les quatre brins d’ARN ont été obtenus par synthèse en phase solide et, après purification, ont produit entre 300 et 700 nanomoles de chaque oligonucléotide. Les chromatogrammes MALDI-TOF des oligonucléotides sont présentés ici. Aucune différence majeure dans les spectres de visibilité UV normalisés n’est observée en comparant la bande à 260 nanomètres et les oligonucléotides canoniques et modifiés, qu’il s’agisse de comparer des échantillons monocaténaires ou des structures duplex.

Cependant, des changements mineurs sont observés lors de la mesure de leurs spectres de dichroïsme circulaire. De plus, les mesures Tm des trois structures duplex ont montré une valeur distincte qui était indicative de la déstabilisation induite par l’incorporation des deux premières modifications de l’othyo phénylméthyle sur l’un des brins. Il est important de se rappeler que le rendement de la synthèse en phase solide dépend de la pureté du réactif.

L’humidité aura un impact négatif sur chaque étape, car la quantité d’eau présente doit être réactive à tout moment. La méthodologie présentée est destinée à servir de ressource générale pour les scientifiques. La technique peut varier en fonction de la modification souhaitée, de l’instrumentation disponible ou des contraintes de temps.

Le type de chimie utilisé ici représente une méthodologie très robuste qui est utilisée depuis les années 1980 et qui est encore largement utilisée dans les milieux universitaires et industriels. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez être en mesure d’effectuer la synthèse, la purification et la caractérisation de vos propres oligonucléotides modifiés ou canoniques d’ARN ou d’ADN. N’oubliez pas que travailler avec les réactifs nécessaires peut être dangereux et que des équipements de protection tels que des lunettes de sécurité, des gants et des blouses de laboratoire doivent être portés en permanence.

Tous les réactifs doivent être manipulés avec précaution et à l’intérieur d’une hotte le cas échéant.