Name: Protocole pour la synthèse en phase solide doligomères dARN contenant un 2- O -thiophénylméthyle Modification et caractérisation via le dichlorisme circulaire (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-07-28T15:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 37 s
Description: Découvrez la synthèse en phase solide d'oligomères d'ARN avec modification 2'-O-thiophénylméthyle et leur caractérisation par dichroïsme circulaire. Ce protocole détaillé permet aux chercheurs de produire et d'analyser des oligonucléotides modifiés.

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La préparation de ce manuscrit a été soutenue par des fonds de démarrage de l&#39;Université du Colorado Denver (JMRE). AF souhaite remercier un prix Research and Creative Activities (RaCAS, CU Denver). Le financement du Bureau des services de recherche, l&#39;Université du Colorado Denver pour couvrir les frais de publication est reconnu. Nous aimerions remercier les membres de laboratoire Mme Cassandra Herbert et M. Yannick K. Dzowo pour leurs contributions dans la partie vidéo.

1. Synthèse en phase solide d&#39;oligonucléotides d&#39;ARN <ol><li> Préparation de solutions contenant chaque phosphoramidite (tableau 1). <ol><li> Comptez le nombre de nucléotides et ajustez-vous dans l&#39;équation n + 1 (où n = nombre de nucléotides) correspondant à chaque base et remplissez le tableau avec les valeurs manquantes. Volume = 0,15 ml par nucléotide à une concentration de 0,1 M, dissous dans de l&#39;acétonitrile anhydre. </li><li> Pesez chaque phosphoramidite dans des bouteilles ambrées de 10 ml (Septum Top Amber 394 Amidite 13 mm ID x 20 mm OD) et placez-les immédiatement sous vide à l&#39;aide d&#39;un déshydratant contenant un agent de séchage. </li><li> Remplir le déshydratant avec de l&#39;argon sec, retirer le flacon et diluer immédiatement avec la quantité correspondante d&#39;acétonitrile (anhydre) avant de fixer sur l&#39;instrument. REMARQUE: Assurez-vous d&#39;utiliser des seringues étanches aux gaz et conservez une atmosphère anhydre en tout temps. </li><li> Retirer les septa de la bouteille et la placer sur le mAchine, via une fonction de changement de bouteille. REMARQUE: Ce processus nécessite un supplément de 0,15 ml (d&#39;où le volume excédentaire dans l&#39;équation n + 1 ci-dessus) de chaque solution pour amorcer la ligne avant la synthèse. </li></ol></li><li> Mise en place de la séquence et de la synthèse en phase solide à l&#39;aide du logiciel ( Figure 3 ). <ol><li> Cliquez sur l&#39;icône du logiciel ( p . Ex . , OligoNet 1.0.1) et sélectionnez Nom de l&#39;instrument&gt; OK . Créez une nouvelle synthèse par Fichier&gt; Nouvelle synthèse&gt; Commande . </li><li> Remplir: Date; RunID; Sélectionner l&#39;instrument; Nom de séquence; Séquence (extrémité 5&#39;-à-3 &#39;). Sous | cycle, affectez la méthode précédemment créée ( Figure 3 ). Choisissez la procédure finale, ( laisse l&#39;oligonucléotide liée à la résine CPG)&gt; manuel. </li><li> Sélectionnez DMT Off&gt; (traitement TCA dans la dernière étape pour obtenir un groupe 5&#39;-OH à la fin de la synthèse) ; Enregistrer Fichier&gt; Enregistrer sousEt fournir un nom pour l&#39;expérience. </li><li> Envoyer le fichier pour commencer la synthèse Ordre&gt; Envoyer l&#39;ordre au synthétiseur et à sélectionner la colonne 1-4 . Ouvrez la fenêtre du synthétiseur et sélectionnez moniteur trityl | choisissez la fonction | trity&gt; moniteur à chaque étape . </li><li> Répétez les étapes si nécessaire en fonction du nombre d&#39;oligonucléotides à synthétiser à la fois (notez que toutes les commandes doivent avoir la même méthode, c&#39;est -à- dire les mêmes temps de couplage et la séquence des événements). </li><li> Commencez la synthèse Synthétiseur&gt; Préparez-vous à démarrer . Placez les colonnes avec l&#39;extrémité 3 &#39;souhaitée sur les positions indiquées sur l&#39;instrument. Sur l&#39;instrument, cliquez sur Démarrer&gt; Non (pour la préparation d&#39;ABI). </li><li> Une fois la synthèse terminée, retirer la colonne de l&#39;instrument et la placer dans un ballon à fond rond puis sécher sous pression réduite pendant environ 0,5 h. REMARQUE: il est recommandé de vérifier qu&#39;une couleur orange profonde est observée dans RandOm accouplements (étapes 1.2.4 - 1.2.7) pour éviter d&#39;éventuelles erreurs de la fonction de moniteur de trityl. </li></ol></li><li> Déprotection et purification d&#39;oligonucléotides d&#39;ARN. <ol><li> Ouvrez la colonne en tordant le capuchon noir et transférez tout (ou la moitié selon le besoin ou le but) de la résine blanche dans un tube de centrifugation de 1,6 mL. Ajouter 0,5 ml d&#39;une méthylamine (40% dans l&#39;eau) / ammoniac (40% dans l&#39;eau) à 1: 1. </li><li> Fixez le capuchon du tube de centrifugation avec du parafilm et, à l&#39;aide d&#39;un bloc de chaleur, chauffez à 60 ° C pendant 1,5 h. REMARQUE: Un objet lourd peut être placé sur le dessus du tube pour s&#39;assurer que la concentration en ammoniac reste constante à l&#39;intérieur du tube de réaction. </li><li> Retirer du bloc de chaleur et refroidir lentement jusqu&#39;à la température ambiante. Centrifuger brièvement l&#39;échantillon pour centrifuger le contenu, puis transférer le surnageant dans un nouveau tube de centrifugation. </li><li> Geler les échantillons en submergeant des tubes dans de l&#39;azote liquide (ou un bain de glace sèche / éthanol) et concentrez-vous à la sécheresse pendant le spinnDans une centrifugeuse sous pression réduite. </li><li> Remettre en suspension les solides dans 0,4 ml d&#39;une solution de triéthylamine / N-méthylpyrrolidinone / triéthylamine-trihydrofluorure (rapport 2: 2: 3). Chauffer à 60 ° C pendant 1,5 h suivi d&#39;un refroidissement lent à température ambiante. </li><li> Ajouter 0,04 ml d&#39;une solution de NaOAc (3M, pH 5,5 - ajusté avec HCl) puis mélanger doucement avec une pointe de pipette. Ajouter de l&#39;éthanol (1 mL) et refroidir à environ. -70 ° C (bain de glace sèche / éthanol) pendant 15 min. </li><li> Centrifuger à 15 000 tr / min et 4 ° C pendant 10 min. Utilisez une pipette pour extraire l&#39;aliquote et sécher la pastille résultante sous pression réduite. </li><li> Remettre en suspension le solide obtenu dans le tampon de chargement (0,2 ml, formamide aq. 90%, EDTA 1 mM) et mélanger jusqu&#39;à ce que le mélange soit homogène. </li><li> Chargez la suspension sur un gel de polyacrylamide préalablement préparé (20% de dénaturation, dimensions du puit: 30 cm x 1 mm) 22 . </li><li> Appliquer un courant dans le gel jusqu&#39;à ce que le marqueur du bleu de bromophénol soit situé entre 1 / 2-2 / 3Dans le gel (dimensions du gel: ~ 21,5 cm x 30 cm). </li><li> Retirez le gel du support et transférez le contenu en gel du verre à l&#39;enveloppe plastique (recouvert sur les deux côtés) et placez-le sur une plaque de chromatographie sur couche mince recouverte de silice (contenant du colorant fluorescent à 254 nm) pour visualiser les bandes En utilisant une lampe UV (λ max = 254 nm). </li><li> Utilisez un marqueur pour délimiter la position où se trouve la bande supérieure et coupez-la à l&#39;aide d&#39;une nouvelle lame de rasoir. Placez le gel contenant l&#39;ARN (sans enveloppe plastique) dans un tube conique de 50 ml et écrasez-les en petits morceaux à l&#39;aide d&#39;une tige en verre. </li><li> Suspendre les résidus de gel dans un NaCl aq. (2 mM et 1 mM d&#39;EDTA) et agiter la suspension à 37 ° C pendant 12 h. Centrifuger le tube conique pendant 10 min. </li><li> Desalt à l&#39;aide d&#39;une cartouche C18 en phase inverse. <ol><li> Préparer la cartouche en utilisant une seringue de 10 ml en lavant avec: Acétonitrile (10 ml) H 2 O (deux fois, 10 ml) NH 5 mM4 Cl aq. Solution (3 mL) Solution contenant de l&#39;ARN, en prenant soin de ne pas verser aucun des résidus de gel. </li><li> Laver avec H 2 O (trois fois, 10 mL). </li><li> Éloignez-vous de la colonne en utilisant un 60% aq. Solution de méthanol (3 mL) </li></ol></li><li> Concentrer sous pression réduite et ré-dissoudre dans de l&#39;eau sans RNase (0,3 mL) </li><li> Préparez une solution diluée (10 μL) et déposez 1 μL sur l&#39;instrument UV-vis ( p . Ex . Nanodrop) pour mesurer le spectre UV-vis (200-450 nm). </li><li> Utilisez la loi de Beer Lambert pour déterminer la concentration de la solution obtenue: <img alt="L&#39;équation 1" src="/files/ftp_upload/56189/56189eq1.jpg" /> Où A = absorbance obtenue; Ε = coefficient d&#39;extinction molaire calculé; C = concentration, et l = 0,1 pour une longueur de trajet de 1 mm. </li><li> Calculer les coefficients d&#39;extinction molaire pour les oligonucléotides; Calculé ici avec une calculatrice en ligneQui utilise le logiciel DINAMelt (http://unafold.ra.albany.edu/?q=dinamelt) 23 </li></ol></li><li> Détermination et caractérisation de la concentration via MALDI-TOF. <ol><li> Chargez des échantillons sur une plaque MALDI en utilisant une pointe de pipette chargée avec une pointe C18 en désalt, et repérez chaque oligonucléotide. <ol><li> Laver la pointe avec 50% d&#39;acétonitrile (10 μL x 2). Equilibrer la pointe avec 0,1% d&#39;acide trifluoroacétique (TFA, 10 μL x 2). Chargez le tip avec un échantillon (généralement 100-150 pmol). </li><li> Lavez l&#39;extrémité avec 0,1% de TFA (10 μL x 2), puis avec de l&#39;eau (10 μL x 2). </li><li> Eluir l&#39;échantillon dans une solution contenant la matrice désirée; Nous avons utilisé une solution de: 10 μL de 25 mM-2,4,6-trihydroxyacétophénone monohydraté (THAP), 10 mM de citrate d&#39;ammonium et 300 mM de fluorure d&#39;ammonium dans 50% d&#39;acétonitrile. </li><li> Placez directement sur la plaque MALDI en déposant 0,9 μL (suivi d&#39;un séchage à l&#39;air) et répétez la procédure si nécessaire. NOTE: Tous les spectres ont été obtenus sur le réflecteur en mode positif. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. Analyse de structure d&#39;ARN via CD <ol><li> Préparation de solutions pour CD. <ol><li> Préparer 0,25 mL contenant l&#39;ARN modifié [3 uM], NaCl [10 mM], un tampon de phosphate de sodium [10 mM, pH 7,2], et MgCl 2 [5 mM]. L&#39;échantillon est prêt à être analysé tel quel, en particulier s&#39;il représente une transition unimoleculaire. </li><li> Si l&#39;objectif est d&#39;analyser les structures duplex ou les transitions bimoleculaires, ajouter un complément (1 équivalent molaire, le cas échéant) à ce moment-là, ou continuer avec l&#39;étape ci-dessous. </li><li> Placez l&#39;échantillon sur un bloc de chaleur, préchauffé à 90 ° C et éteignez la chaleur pour contrôler le refroidissement lent à température ambiante (typiquement 2 à 4 h). </li></ol></li><li> Acquisition Spectra <ol><li> Préparer une solution vierge (NaCl 10 mM, phosphate de sodium 10 mM pH 7,3, MgCl 2 5 mM), transfert tO micro-cuvette (longueur de trajet de 1 cm, 250 μL de volume minimum) et placez la position de support du changeur d&#39;échantillon dans l&#39;instrument. </li><li> Transférer l&#39;échantillon contenant de l&#39;ARN dans une autre micro-cuvette et positionner dans le changeur d&#39;échantillons. Si vous mesurez une transition de dénaturation thermique, ajoutez soigneusement un lit d&#39;huile sans perturber la couche aqueuse et fixez le capuchon de la cuvette à l&#39;aide d&#39;un morceau de ruban en téflon. </li><li> Ouvrez le réservoir d&#39;azote pour fournir un flux qui déplace le flotteur d&#39;air situé sur l&#39;instrument à env. 40. Allumez le refroidisseur. </li><li> Mettez l&#39;instrument sous tension et ouvrez l&#39;icône logiciel Spectra Manager , puis ouvrez la fenêtre d&#39;acquisition Spectra Measurement . </li><li> Purger l&#39;instrument avec de l&#39;azote pendant 5 minutes avant l&#39;acquisition. </li><li> Acquérir les spectres en utilisant les paramètres suivants Mesurer&gt; Paramètres et ajuster les paramètres comme suit: <ol><li> Sous Général , sélectionnez: Numériser 200-350 nm; Canaux CD et HT: donnéesHauteur à 0,1 nm; Vitesse de balayage à 100 nm / min; Largeur de bande à 1 nm; Nombre d&#39;accumulations à 5. </li><li> Sous l&#39;unité de cellule , choisissez 20 ° C. Sous contrôle , sélectionnez L&#39;obturateur est ouvert et fermé automatiquement. Sous l&#39; information , choisissez le nom, la concentration, l&#39;opérateur. </li><li> Sous les données , recherchez le dossier souhaité. Cliquez sur OK . </li></ol></li><li> Acquérir les spectres Mesurer&gt; Mesurer l&#39;échantillon , identifier les positions des cuvettes dans le changeur d&#39;échantillons 1-6 en conséquence, cliquer sur OK . </li></ol></li><li> Si on effectue une transition de dénaturation thermique: <ol><li> Fermer le logiciel d&#39;acquisition Fichier&gt; Quitter et ouvrir un nouveau programme Mesure de la température variable&gt; Mesurer&gt; Paramètres . </li><li> Appliquer les paramètres suivants pour enregistrer une transition thermique, qui peut être réglée comme vous le souhaitez: <ol><li> Sous température , sélectionnez la température de démarrage: 4 ° C; Intervalle: 0,2; TaRget: 90 ° C; Gradient: 1 ° C / min; Attendez 0 s. Sous Démarrer / Fin , sélectionnez Démarrer l&#39;état et l&#39;état final comme vous le souhaitez. </li><li> Sous Général , sélectionnez 3 canaux, CD / HT / Abs; Bande passante: 1 nm; Longueur d&#39;onde: 270 nm (ou selon vos besoins). Sous contrôle , sélectionnez aucun. Sous Informations , sélectionnez le nom, la concentration, l&#39;opérateur. </li><li> Sous les données , recherchez le dossier souhaité. Cliquez sur OK . </li></ol></li><li> Refroidir les échantillons à 4 ° C et attendre 5 min à cette température avant d&#39;obtenir une mesure du spectre. </li></ol></li><li> Traitement des données pour les spectres. <ol><li> En utilisant la fonction sur le logiciel, soustraire le spectre vide de l&#39;acquisition cible pour tenir compte des signaux de fond provenant du système tampon utilisé: Spectra Analysis&gt; File&gt; Open . </li><li> Une fois qu&#39;un fichier vierge et un fichier de spectres ont été ouverts, faites glisser la vue 2 sous Vue 1 (sur le côté gauche de l&#39;écran). </li><li> Cliquez sur PrTraitement&gt; soustraction&gt; OK ou échanger des données&gt; OK . </li><li> Extraire les données sous forme de fichier ASCII: Fichier&gt; Exporter et sélectionner ASCII . </li><li> Utilisez un logiciel pour tracer le spectre correspondant. Le rinçage des données est facultatif dans les cas où le rapport signal sur bruit est plus bas que prévu. Cette transformation peut être appliquée en appliquant l&#39;option de lisser les données. </li></ol></li><li> Traitement des données pour les transitions de dénaturation thermique. <ol><li> Extraire les données du fichier JASCO en tant que fichier ASCII. </li><li> Tracer les points d&#39;ellipticité en fonction de la température. Typiquement, le lissage des données est nécessaire en fonction de la longueur d&#39;onde qui est en cours d&#39;examen. Dans certains cas, l&#39;utilisation de la longueur d&#39;onde à 210 nm a montré des variations plus importantes entre les parcelles qui nécessitaient un lissage. Cependant, selon l&#39;échantillon et les concentrations, un certain nombre de calculs ont été effectués à l&#39;aide des données brutes. </li><li> Pour calculer le repaire thermiqueValeur de transitions d&#39;actualisation (T m ), obtenez une première dérivée de la courbe. Les maxima ou minima ont été une indication de ce paramètre. Comme dans l&#39;étape précédente, certains cas nécessitaient un lissage des données pour obtenir la valeur la plus précise. NOTE: Les expériences ont généralement été réalisées en trois exemplaires, ce qui a entraîné la moyenne correspondante et l&#39;écart type pour la mesure. </li></ol></li></ol>

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<li>Farrell, R. E. <a target="_blank" href="http://blogsdelagente.com/cefimijegyte/rna-methodologies-fourth-edition-laboratory-guide-for-isolation-and-characterization-ebook-download/">RNA Methodologies (4th Ed): A laboratory guide for isolation and characterization</a>. 2, Academic Press. San Diego, California. 45-80 (2010).</li>
</ol>

Les auteurs n&#39;ont rien à dévoiler.

L&#39;intention de ce manuscrit est de servir de guide aux chercheurs sur le terrain, débutant ou expert, pour réussir ou améliorer la synthèse d&#39;oligonucléotides d&#39;ADN ou d&#39;ARN. La méthodologie décrite se concentre sur l&#39;utilisation de la synthèse en phase solide en utilisant un synthétiseur d&#39;ADN / ARN automatisé via une chimie standard de phosphoramidite. Le rapport décrit une description étape par étape de la synthèse, de la purification et de la caractérisation des dodecamères d&#39;ARN. En outr...

La synthèse en phase solide pour obtenir des oligonucléotides d&#39;ADN / ARN est un outil puissant qui a servi plusieurs applications dans différents domaines depuis les années 1970, 1 , 2 , 3 en utilisant des blocs de construction de phosphoramidite 4 . Parmi les exemples de sa large influence figurent: son impact sur l&#39;étiquetage ( via les réactions de la chimie de clic) 5 , la sondage structurel 6 et les technologies antisens 7 , ainsi que son élucidation des mécanismes biologiques 8 , 9 , sources de matériel génétique 10 et l&#39;étude de Diverses modifications naturelles et / ou chimiques 11 , 12 , entre autres. La modification que nous utilisons ici représente la première étape dans nos efforts pour obtenir des oligonucléotides d&#39;ARN qui contiennentSondes photoactives pour permettre le contrôle temporel de la structure et de la fonction de cet important biopolymère. La synthèse de dodécamères d&#39;ARN avec des séquences: 5 &#39;- [ACU CG G A AU CAU] -3&#39; / 5 &#39;- [août AUU GCC UAG] -3&#39; (positions soulignées représentent l&#39;incorporation d&#39;un C2&#39;- O modification de -thiophenylmethyl ) Constitue l&#39;objet de cette étude. Les séquences ont été choisies pour permettre la quantification et la mesure des brins d&#39;ARN comme brins simples, ou comme structures duplex correspondantes (aucune autre structure secondaire n&#39;a été prédite thermodynamiquement stable). Le CD a été utilisé pour établir les paramètres structurels, c&#39;est -à- dire la formation de duplex et les transitions de dénaturation thermique. La synthèse La procédure globale pour l&#39;obtention de ces oligonucléotides est illustrée à la figure 1 et suit le processus par étapes: synthèse en phase solide automatisée → DeprOtection → Purification → Quantification → Caractérisation. La figure 2 affiche les unités monomériques qui sont nécessaires dans cette procédure. La synthèse en phase solide de l&#39;ARN est similaire à celle de l&#39;ADN en ce qu&#39;elle est basée sur la chimie de la phosphoramidite ( figure 2 , à gauche) et l&#39;utilisation de groupes protecteurs labiles-basiques pour les amines nucléophiles exocycliques sur G, A et C, par exemple , Acétyle, benzoyle, phénoxyacétyle, t- butyle ou N , N- diméthylformamide ( figure 2 , à droite). Un autre aspect à considérer dans l&#39;ARN, en raison de la présence du groupe C2&#39;-OH (dépourvu de biopolymères désoxyoligonucléotidiques), est l&#39;étape supplémentaire qui doit être incorporée pour la protection et la déprotection subséquente de cette position nucléophile. À cet égard, les groupes protecteurs à base de silicium sont devenus une stratégie attrayante en raison de leur potentiel en tant que fragments biorthogonaux (en particulierEt déprotégé en présence de fluorure), avec les groupes tert - butyl -diméthylsilyle (TBDMS) et triisopropylsilyloxyméthyle (TOM) comme choix populaires ( figure 2 , en bas à gauche). Dans ce travail, la synthèse automatisée a été réalisée sur un synthétiseur d&#39;ADN / ARN qui utilise une chimie standard de phosphoramidite. Les paramètres du fabricant sur l&#39;instrument incluent une étape de dilution automatisée lors de l&#39;utilisation des versions commerciales des phosphoramidites pour l&#39;ADN, ou l&#39;option de dilution aux volumes définis par l&#39;utilisateur. Cependant, nous avons décidé de peser le phosphoramidite d&#39;ARN et de diluer manuellement, étant donné que: 1) le prix des phosphoramidites canoniques de l&#39;ARN est plus élevé (jusqu&#39;à 50 fois plus cher dans certains cas); 2) les phosphoramidites modifiés sont souvent obtenus en petites quantités; Et 3) la quantité de matière gaspillée lors de l&#39;utilisation d&#39;une étape de dilution automatisée (établie par le fabricant) est importante. En outre, nous avons utilisé: 1) supports solides disponibles dans le commerce(Par exemple , CPG) contenant une nucléobase protégée pour fonctionner comme extrémité 3 &#39;; Et 2) phosphoramidites commerciaux (nucléobases canoniques) protégés avec un groupe TBDMS à la position C2&#39;- O . La liste détaillée des étapes de synthèse est fournie sur la figure 3 et le tableau 1 , ainsi que d&#39;autres descriptions et commentaires pour les étapes qui ont été ajustées pour la synthèse de l&#39;ARN. En outre, la figure 4 illustre les rendements par étapes qui sont observés pour chaque étape après avoir sélectionné l&#39;option &#39;Trityl Monitor&#39;, qui quantifie le cation trityl libéré de chaque étape de détritylation. Il convient de noter que typiquement, selon notre expérience, le facteur limitant était l&#39;obtention du phosphoramidite contenant la modification souhaitée. C&#39;est-à-dire le développement d&#39;une méthodologie synthétique qui permet d&#39;incorporer des modifications sur certains sites. Dans ce rapport, nous nous concentrons surIncorporation d&#39;un nucléotide modifié pour lequel nous avons établi la méthodologie synthétique correspondante, le groupe C2&#39;- O- thiophénylméthyle. Ce groupe est de petite taille et n&#39;affecte en rien la synthèse en phase solide. Comme l&#39;incorporation de ce groupe dans des oligonucléotides d&#39;ARN a été rapportée, ainsi que des paramètres structurels et thermodynamiques 4 , aucun aspect de la synthèse organique conduisant aux phosphoramidites modifiés ne sera décrit ici. Déprotection, purification et caractérisation La déprotection des amines exocycliques et des groupes ß-cyanoéthyle se produit dans la même étape que celle du clivage de la résine CPG. Nous avons appliqué les conditions couramment utilisées pour chauffer la résine obtenue en présence d&#39;une solution aqueuse d&#39;AMA, suivie d&#39;un clivage des groupes C2&#39;- O- silyle en présence d&#39;ions fluorure, puis purification par gelÉlectrophorèse. Bien que ces conditions soient devenues des conditions standard dans de nombreux cas, des modifications qui sont labiles aux conditions basiques ou aux ions fluorure peuvent nécessiter des conditions plus douces 13 , 14 , par exemple , le méthanol / carbonate de potassium (MeOH / K 2 CO 3 ) ou la butylamine. Ainsi, un ensemble différent de groupes protecteurs sur les phosphoramidites correspondants est nécessaire. En outre, nous avons choisi l&#39;électrophorèse comme alternative privilégiée pour purifier les oligomères déprotégés étant donné notre expérience antérieure avec cette méthode et le manque d&#39;autres instruments. Cependant, la HPLC peut en variante être utilisée comme méthode efficace 15 . La caractérisation des oligonucleotides purifiés a été réalisée par spectrométrie de masse, désorption / ionisation laser assistée par matrice - temps de vol (MALDI-TOF), en utilisant une procédure rapportée par notre groupe 16 . Caractérisation structurelle et ther<html> La stabilité des duplex obtenus a été réalisée par CD. Plus précisément, nous utilisons CD pour déterminer les transitions de dénaturation thermique d&#39;oligonucléotides modifiés et non modifiés d&#39;ARN en suivant la diminution de l&#39;ellipticité de la bande à env. 270 nm, ainsi que la disparition de la bande (avec ellipticité négative) avec un λ max à 210 nm. Une comparaison de spectres avant et après l&#39;hybridation est fournie pour illustrer leurs différences et fournir une validation de la méthodologie employée. L&#39;utilisation de CD est largement acceptée dans la détermination de motifs structuraux dans les acides nucléiques et les acides aminés 17 , et peut donc être utilisée comme outil pour déterminer différents paramètres structurels et thermodynamiques 18 ; Cependant, il n&#39;y a pas beaucoup d&#39;exemples où la technique est utilisée pour évaluer les transitions de dénaturation thermique. Certains cas comprennent la détermination des stabilités thermiques sur l&#39;ADN contenant des quadruplexs GAss = &quot;xref&quot;&gt; 19 , 20 ou dans les duplex et les épingles à cheveux de l&#39;ARN 21 . Ce rapport vise à fournir au lecteur ou au téléspectateur non expert un ensemble d&#39;outils qui permettent un démarrage en douceur de ce type de recherche. Il servira à améliorer et à comparer avec les méthodologies et les techniques d&#39;autres laboratoires de recherche impliqués dans cette branche de science intéressante. Le contenu de ce rapport ajoute aux protocoles existants de cette technologie à partir de diverses sources et enrichit et facilite l&#39;expérience avec une aide visuelle pour chaque étape.

<table><tbody><tr><td>AbsolveTM</td><td>PerkinElmer</td><td>6NE9711</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile 99,9 %, HPLC Fisher</td><td>Scientific</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Acétonitrile 99,9 %, anhydre pour le séquençage de l’ADN</td><td>Fisher BioReagents</td><td>75-05-8</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide, 99+ %</td><td>ACROS Organics</td><td>164850025</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure d’ammonium 98+ %</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-02-9</td><td></td></tr><tr><td>Citrate d’ammonium, dibasique 98 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>3012-65-5</td><td></td></tr><tr><td>Fluorure d’ammonium&nbsp ; 98.0 %, grade ACS</td><td>Alfa Aesar</td><td>12125-01-8</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde d’ammonium 28 - 30 % dans l’eau, ACS Plus</td><td>Fisher Chemical</td><td>1336-21-6</td><td></td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium</td><td>ACROS Organics</td><td>1444</td><td></td></tr><tr><td>Argon-ultra haute pureté</td><td>&nbsp ; Airgas</td><td>7440-37-1</td><td></td></tr><tr><td>Bis-acrylamide Ultra pur</td><td>VWR-Amresco</td><td>172</td><td></td></tr><tr><td>Acide borique</td><td>Fisher Scientific</td><td>A73-1</td><td></td></tr><tr><td>Pyrocarbonate de diéthyle, 97 %</td><td>ACROS Organics</td><td>A0368487</td><td></td></tr><tr><td>Éthanol, anhydre, de qualité histologique</td><td>Fisher Chemical</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediamine tétraacétique, sel disodique déshydraté 100,2 %</td><td>Fisher Chemical</td><td>6381-92-6</td><td></td></tr><tr><td>Formamide&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>75-12-7</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique, 36,5 - 38,0 %, certifié ACS</td><td>Plus Fisher Chemical</td><td>7647-01-0</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de magnésium hexahydraté, 99 %Fisher</td> <td>Scientific</td><td>7786-30-3</td><td></td></tr><tr><td>Méthanol, 99,9 %,&nbsp ; Qualité HPLC</td><td>Fisher Chemical</td><td>67-56-1</td><td></td></tr><tr><td>Méthylamine 40 % dans l’eau</td><td>Sigma Aldrich</td><td>74-89-5</td><td></td></tr><tr><td>1-Méthyl-2-pyrrolidinone, hydrohydre, 99,5 %</td> <td>Aldrich</td><td>872-50-4</td><td></td></tr><tr><td>Opti-TOFTM 96 Well Insert (123 x 81 mm)&nbsp ;</td><td>MDS SCIEX</td><td>1020157</td><td></td></tr><tr><td>RNase Away</td><td>Molecular BioProducts</td><td>7005-11</td><td></td></tr><tr><td>Acétate de sodium, anhydre 99,2 %, Certifié ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>127-09-3</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium, 100,5 %, Certifié ACS</td><td>Fisher Chemical</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate de sodium monobasique dihydraté 99,0 %</td><td>Sigma</td><td>13472-35-0</td><td></td></tr><tr><td>2',4' Triéthylamine, 99+ %</td><td>Alfa Aesar</td><td>121-44-8</td><td></td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Amresco</td><td>761</td><td></td></tr><tr><td>Trihydrofluorure de triéthylamine, 98</td> %<td>Aldrich</td><td>73602-61-6</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique, 99 %</td><td>Alfa Aesar</td><td>76-05-1</td><td></td></tr><tr><td>6'-Trihydroxyacétophénone monohydraté 98 %</td><td>Sigma Aldrich</td><td>480-66-0</td><td></td></tr><tr><td>Tris Base</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP154-3</td><td></td></tr><tr><td>Urée</td><td>Fisher Scientific</td><td>U15-3</td><td></td></tr><tr><td>Réactifs pour la synthèse de l’ARN : </td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mélange débloquant, 3 % d’acide trichloracétique dans le dichlorométhane</td><td>Glen Research</td><td>&nbsp ; 40-4140-57</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de coiffes A, THF/pyridine/anhydride acétique</td><td>Glen Research</td><td>40-4110-52</td><td></td></tr><tr><td>Mélange de capsules B, 10 % de 1-méthylimidazole dans le THF</td><td>Glen Research</td><td>40-4120-52</td><td></td></tr><tr><td>Activateur, 0,25 M 5-éthylthio-1H-tétrazole dans de l’acétonitrile anhydre</td><td>Glen Research</td><td>. 30-3140-52</td><td></td></tr><tr><td>Solution oxydante, 0,02 M d’iode dans du THF/Pyridine/Eau</td><td>Glen Research</td><td>40-4330-52</td><td></td></tr><tr><td>U-RNA-CPG</td><td>Glen Research</td><td>20-3330-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-RNA-CPG&nbsp ;</td><td>Glen Research</td><td>20-3324-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-G-CE Phosphoramidite&nbsp ;</td><td>Glen Research</td><td>10-3025-xx</td><td></td></tr><tr><td>U-CE Phosphoramidite</td><td>Glen Research</td><td>10-3030-xx</td><td></td></tr><tr><td>Ac-C-CE Phosphoramidite</td><td>Glen Research</td><td>10-3015-xx</td><td></td></tr><tr><td>Bz-A-CE Phosphoramidite&nbsp ;</td><td>Recherche Glen</td><td>10-3003-xx</td><td></td></tr></tbody></table>

protocole pour la synthèse en phase solide d&#39;oligomères d&#39;arn contenant un 2&#39;-<em&gt; o</em&gt; -thiophénylméthyle modification et caractérisation via le dichlorisme circulaire

Protocol for the Solid-phase Synthesis of Oligomers of RNA Containing a 2'-O-thiophenylmethyl Modification and Characterization via Circular Dichroism

La synthèse en phase solide a été utilisée pour obtenir des polymères canoniques et modifiés d&#39;acides nucléiques, en particulier d&#39;ADN ou d&#39;ARN, ce qui en fait une méthodologie populaire pour des applications dans divers domaines et à des fins de recherche différentes. La procédure décrite ici se concentre sur la synthèse, la purification et la caractérisation des dodecamères de l&#39;ARN 5 &#39;- [CUA CGG AAU CAU] -3&#39; contenant zéro, une ou deux modifications situées à la position C2&#39;- O . Les sondes sont basées sur des groupes 2-thiophénylméthyle, incorporés dans des nucléotides d&#39;ARN par synthèse organique standard et introduits dans les oligonucléotides correspondants via leurs phosphoramidites respectifs. Ce rapport utilise la chimie de la phosphoramidite via les quatre nucléobases canoniques (Uridine (U), Cytosine (C), Guanosine (G), Adenosine (A)), ainsi que les nucléotides fonctionnalisés au 2-thiophénylméthyle modifiés au 2&#39;- O- position; Cependant, la méthodologie est susceptible d&#39;un grand varPlusieurs modifications qui ont été développées au cours des années. Les oligonucléotides ont été synthétisés sur un support de verre à pores contrôlés (CPG) suivi d&#39;un clivage de la résine et de la déprotection dans des conditions standard, c&#39;est -à- dire un mélange d&#39;ammoniac et de méthylamine (AMA) suivi par du fluorure d&#39;hydrogène / triéthylamine / N-méthylpyrrolidinone. Les oligonucleotides correspondants ont été purifiés par électrophorèse sur polyacrylamide (dénaturant 20%) suivie d&#39; une élution, le dessalage, et l&#39; isolement par Chromatographie en phase inverse (Sep-pak, C 18 -column). La quantification et les paramètres structurels ont été évalués par analyse photométrique par dichroïsme circulaire (CD-UV) vis-à-vis de l&#39;ultraviolet (UV-vis) et respectivement. Ce rapport vise à servir de ressource et de guide pour les chercheurs débutants et experts intéressés à s&#39;engager dans ce domaine. On s&#39;attend à ce qu&#39;il serve de travail en cours au fur et à mesure que de nouvelles technologies et méthodologies sont développées. La description des méthodologies et des techniques au sein deS document correspond à un synthétiseur ADN / ARN (remis à neuf et acheté en 2013) qui utilise la chimie de la phosphoramidite.

La synthèse de dodecamères d&#39;ARN contenant zéro, une ou deux modifications de 2-thiophénylméthyle à la position C2&#39;- O est décrite avec sa purification et sa caractérisation correspondantes. En outre, une description détaillée de l&#39;analyse structurale réalisée via CD est incluse. Les quatre brins d&#39;ARN (y compris un brin avec une séquence complémentaire) ont été obtenus par synthèse en phase solide, qu...

Cet article fournit une procédure détaillée sur la synthèse en phase solide, la purification et la caractérisation des dodecamères d&#39;ARN modifiés à la position C2&#39;- O . Les analyses photométriques UV-vis et dichroïstiques circulaires sont utilisées pour quantifier et caractériser les aspects structurels, c&#39;est -à-dire les brins simples ou à double brin.

Protocole pour la synthèse en phase solide d&#39;oligomères d&#39;ARN contenant un 2&#39;-<em&gt; O</em&gt; -thiophénylméthyle Modification et caractérisation via le dichlorisme circulaire

Solid-phase synthesis has been used to obtain canonical and modified polymers of nucleic acids, specifically of DNA or RNA, which has made it a popular ...

L'objectif général de ce rapport est d'illustrer la procédure permettant d'obtenir des oligonucléotides d'ARN par synthèse en phase solide. Des dodécamères d'ARN seront synthétisés à titre de modèles, et leur purification ainsi que leur caractérisation seront également démontrées. Grâce à son volet visuel, cette publication élargira la portée des méthodologies et des équipements utilisés auprès des chercheurs dans divers domaines.La fourniture d'un support visuel, accompagné d'un bref protocole, permettra aux chercheurs d'appliquer ces techniques. Un avantage de cette méthode réside dans sa grande adaptabilité à une large gamme de modifications. Alors que les applications actuelles deviennent de plus en plus exigeantes, il est important de disposer d'un protocole standardisé.La chimie des phosphoramidites connaît un renouveau en raison de la robustesse de la méthode et de son potentiel pour obtenir des oligonucléotides destinés à des applications thérapeutiques. Bien que l'achat d'oligonucléotides soit une option attrayante, le prix et la disponibilité des modifications orientent l'intérêt vers la préparation de ces oligomères en interne, ce qui rend cette procédure d'une importance capitale. Pour commencer cette procédure, peser chaque phosphoramidite dans des flacons bruns de 10 millilitres préalablement séchés au four, puis boucher chaque flacon avec un septum préalablement perforé à l’aide d’une aiguille de calibre 20.Placer immédiatement les flacons sous vide en utilisant un dessiccateur contenant un agent desséchant. Après avoir rempli le dessiccateur d'argon sec, retirer chaque flacon et ajouter immédiatement de l'acétonitrile anhydre avant de le fixer sur un synthétiseur de peptides en phase solide. Ensuite, retirer les septums de chaque flacon et les placer sur le synthétiseur à l’aide de la fonction de changement de flacon.Pour configurer la synthèse en phase solide, sélectionnez l'icône du logiciel. Choisissez le nom du synthétiseur, puis cliquez sur OK. Créez ensuite une nouvelle synthèse en sélectionnant Fichier, puis Nouvel ordre de synthèse. Saisissez ensuite la date d'exécution, le client et l'identifiant de l'exécution dans la fenêtre d'invite. Sélectionnez l'instrument, le nom de la séquence et la séquence elle-même.Sous l'onglet Cycle, attribuez la méthode créée précédemment. Ensuite, choisissez la procédure de fin manuelle, qui laisse l'oligonucléotide lié à la résine CPG. Sélectionnez DMT Off.Enregistrez le fichier en sélectionnant Fichier puis Enregistrer sous. Ensuite, attribuez un nom à l'expérience et cliquez sur Enregistrer. Puis, envoyez le fichier pour démarrer la synthèse en sélectionnant Commande et Envoyer la commande au synthétiseur. Dans la fenêtre d'invite, sélectionnez une position de colonne et cliquez sur OK. Dans la fenêtre du synthétiseur, sélectionnez Moniteur Trityl.Cliquez sur « Choose Function », puis sur « Trityl Monitor » à chaque étape en tapant 1. Commencez la synthèse en sélectionnant « Synthesizer » et « Prepare to Start ». Placez les colonnes avec l'extrémité trois prime souhaitée sur les positions indiquées sur l'appareil.Ensuite, cliquez sur Démarrer puis sur Non sur l'appareil. Une fois la synthèse terminée, retirez la colonne de l'appareil et placez-la dans un ballon à fond rond. Séchez la colonne sous pression réduite pendant environ 0,5 heure.Transférez la résine blanche de la colonne vers un tube de centrifugation de 1,6 millilitre et ajoutez 0,5 millilitre d'une solution aqueuse de méthylamine et d'ammoniaque. Fermez hermétiquement le tube de centrifugation avec du parafilm et chauffez le contenu à 60 degrés Celsius pendant une heure et demie. Placez un objet lourd au-dessus des tubes afin de garantir que la concentration reste constante.Après refroidissement à température ambiante, centrifuger brièvement l'échantillon pour ramener le contenu au fond. Ensuite, transférer le surnageant dans un nouveau tube de centrifugation. Refroidir le tube à 70 degrés Celsius en le plaçant dans un bain d'éthanol et de glace sèche pendant cinq minutes, puis concentrer jusqu'à séchage à l'aide d'un concentrateur sous vide rapide.Resuspendez maintenant les résidus dans 0,4 millilitre d'une solution d'amines trihydrates d'acide fluorhydrique, puis fixez le bouchon avec du film de laboratoire. Chauffez la solution à 60 degrés Celsius pendant une heure et demie. Placez un objet lourd sur les tubes afin d'assurer une concentration constante.Après avoir refroidi la solution à température ambiante, ajouter 0,04 millilitres d'une solution d'acétate de sodium, puis mélanger délicatement à l'aide d'une pipette. Ajouter un millilitre d'éthanol et refroidir la solution à environ 70 degrés Celsius à l'aide d'un bain d'éthanol à la glace sèche pendant 15 minutes. Ensuite, centrifuger la solution à 15 000 tr/min à quatre degrés Celsius pendant dix minutes.Utilisez une pipette pour extraire le surnageant et séchez le culot obtenu sous pression réduite. Après le séchage, resuspendez le solide obtenu dans du tampon de charge et mélangez jusqu'à l'obtention d'une solution homogène. Ensuite, chargez la suspension sur un gel de polyacrylamide préalablement préparé.Faites passer un courant à travers le gel jusqu'à ce que le marqueur de bleu de bromothymol se situe entre la moitié et les deux tiers de la longueur du gel. Après avoir retiré le gel du support, transférez le contenu du gel du verre vers un film plastique et placez-le sur une plaque de chromatographie sur couche mince recouverte de silice, afin de visualiser les bandes à l’aide d’une lampe UV. Utilisez un marqueur pour délimiter l’emplacement de la bande supérieure, puis découpez-la à l’aide d’un rasoir.Placer le gel contenant l'ARN dans un tube conique de 50 millilitres et le broyer en petits morceaux à l’aide d’une tige en verre. Ensuite, suspendre les résidus de gel dans une solution aqueuse de chlorure de sodium et agiter la suspension à 37 degrés Celsius pendant 12 heures. Transférer la suspension dans un tube de 15 millilitres, puis centrifuger à 3400 tr/min pendant dix minutes.Pour désaler l'échantillon à l'aide d'une cartouche inverse C18, lavez d'abord la cartouche avec de l'acétonitrile, de l'eau, du chlorure d'ammonium aqueux et la solution d'ARN, en laissant les résidus de gel derrière. Après le lavage à l'eau, éluerez l'ARN de la colonne en utilisant trois millilitres de solution aqueuse de méthanol à 60 % dans trois tubes à essai différents. Refroidissez les tubes à 70 degrés Celsius dans un bain de glace sèche pendant cinq minutes, puis concentrez les contenus à sec à l'aide d'un concentrateur à vide rapide.Après avoir concentré l'éluant sous pression réduite, redissoudre le résidu dans 0,3 millilitre d'eau exempte de RNase. Après dilution de la solution, déposer un microlitre sur l'appareil UV-visible pour mesurer le spectre UV-visible entre 200 et 450 nanomètres. Pour l'analyse MALDI-TOF, laver d'abord une pointe de pipette C18 avec 50 % d'acétonitrile.Équilibrer la pointe de pipette avec de l'acide trifluoroacétique à 0,1 %. Ensuite, charger la pointe de pipette avec une solution contenant de 100 à 150 picomoles d'échantillon. Après avoir lavé la pointe de pipette avec de l'acide trifluoroacétique à 0,1 % et de l'eau, éluer l'échantillon dans une solution contenant la matrice souhaitée.Déposez 0,9 microlitre de la solution sur une plaque MALDI et laissez sécher l'échantillon. Pour l'analyse de la structure de l'ARN, transférez l'échantillon contenant l'ARN dans une microcuve et placez-la dans le changeur d'échantillons d'un appareil de dichroïsme circulaire. Ouvrez le réservoir d'azote afin d'assurer un débit permettant au flotteur d'air situé sur l'appareil d'atteindre environ 40.Ensuite, allumez le refroidisseur. Maintenant, allumez l'appareil. Ouvrez le logiciel en cliquant sur l'icône Spectrum Manager, puis ouvrez la fenêtre d'acquisition en cliquant sur Spectrum Measurement.Après avoir purgé l'appareil à l'azote, acquérir les spectres de dichroïsme circulaire en sélectionnant Mesurer et Paramètres. Sous l'onglet Général, choisir 200-350 nanomètres pour le balayage, CD et HT pour les canaux, 0,1 nanomètre pour le pas de données, 100 nanomètres par minute pour la vitesse de balayage, un nanomètre pour la largeur de bande et cinq pour le nombre d'accumulations. Sous l'onglet Unité de cuve, choisir 20 degrés Celsius.Sous l'onglet Contrôle, sélectionnez Obturation ouverte et fermée automatiquement. Sous l'onglet Informations, saisissez le nom de l'échantillon, l'opérateur, la concentration et le solvant. Sous l'onglet Données, accédez au dossier souhaité, puis cliquez sur OK. Acquérir les spectres en cliquant sur Mesurer, puis sur Mesure de l'échantillon.Enfin, identifiez les positions des cuvettes dans les porte-échantillons numérotés de un à six, puis cliquez sur OK. Les quatre brins d'ARN ont été obtenus par synthèse en phase solide et, après purification, ont fourni entre 300 et 700 nanomoles de chaque oligonucléotide. Les chromatogrammes MALDI-TOF des oligonucléotides sont présentés ici. Aucune différence majeure n'est observée dans les spectres UV-visible normalisés lors de la comparaison de la bande à 260 nanomètres entre les oligonucléotides canoniques et modifiés, qu'il s'agisse d'échantillons monocaténaires ou de structures en duplex.Cependant, de légers changements sont observés lors de la mesure de leurs spectres de dichroïsme circulaire. De plus, les mesures de Tm des trois structures en duplex ont révélé une valeur distincte, indiquant la déstabilisation induite par l'incorporation de la modification phénylméthyle ortho à deux positions sur l'une des brins. Il est important de rappeler que le rendement de la synthèse en phase solide dépend de la pureté des réactifs.L'humidité aura un impact négatif sur chaque étape, car la quantité d'eau présente doit être réactif à tout moment. La méthodologie décrite doit servir de ressource générale pour les scientifiques. La technique peut varier selon la modification souhaitée, les instruments disponibles ou les contraintes de temps.Le type de chimie utilisé ici représente une méthodologie très robuste, en usage depuis les années 1980, et qui est encore largement utilisée dans les milieux universitaires comme industriels. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez être en mesure d'effectuer la synthèse, la purification et la caractérisation de vos propres oligonucléotides modifiés ou canoniques d'ARN ou d'ADN. N'oubliez pas que le travail avec les réactifs nécessaires peut présenter des risques, et que des équipements de protection tels que des lunettes de sécurité, des gants et une blouse de laboratoire doivent être portés en tout temps.Tous les réactifs doivent être manipulés avec précaution et dans une hotte de ventilation si nécessaire.

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Nucléosidiques Triphosphates - de la synthèse à caractérisation biochimique

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Protocole pour la synthèse en phase solide doligomères dARN contenant un 2- O -thiophénylméthyle Modification et caractérisation via le dichlorisme circulaire (Vidéo) | JoVE Journal

Protocole pour la synthèse en phase solide d'oligomères d'ARN contenant un 2'-

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