Reconnaissance de séquence-spécifique et sélective d’ARN Double-brin sur ARN monocaténaire par chimiquement modifiées acides nucléiques peptidiques

L'objectif général de cet article méthodologique est de présenter les protocoles détaillés utilisés par notre laboratoire pour étudier la reconnaissance moléculaire des ARN double brin par des acides nucléiques peptidiques chimiquement modifiés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie chimique de l'ARN, telles que la détection et le ciblage de structures d'ARN. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que les principes de conception peuvent s'appliquer au ciblage de n'importe quelle structure en duplex d'ARN.

La procédure sera démontrée par Desiree Toh, une chargée de recherche de mon laboratoire. Pour commencer cette procédure, ajoutez quatre microlitres d'une solution de glycérol à 35 % à des échantillons d'ARN-PNA préparés au préalable et mélangez délicatement. À l'aide d'une micropipette et de pointes de chargement pour gel, déposez soigneusement 20 microlitres de chaque échantillon sur un gel de polyacrylamide préparé au préalable en veillant à ne pas introduire de bulles d'air.

Faites migrer le gel à une tension constante de 250 volts pendant cinq heures. Au bout de cinq heures, éteignez l'alimentation électrique et retirez la plaque de verre du support à gel. Retirez ensuite le ruban scellant le gel et démontez la plaque de verre.

Retirez délicatement le gel de la plaque de verre et placez-le dans un récipient contenant 350 millilitres d'eau déionisée. Ajoutez soigneusement 35 microlitres de bromure d'éthidium dans le récipient et placez-le sur l'agitateurmoteur à vitesse lente pendant 30 minutes. Après avoir éliminé la solution de bromure d'éthidium, rincez le gel avec 1,5 à deux litres d'eau distillée.

Ensuite, analyser le gel à l’aide d’un imageur équipé d’un laser vert de 532 nanomètres et d’un filtre d’émission réglé à 610 nanomètres. Quantifier les intensités des bandes du gel à l’aide d’un logiciel gratuit. Transférer la quantité appropriée d’ARN double brin marqué par la 2-aminopurine dans un tube propre de 1,5 millilitre.

Ensuite, concentrer les solutions d'ARN à l'aide d'un concentrateur sous vide. Puis, transférer les volumes appropriés de l'ADNpe correspondant pour différentes concentrations à partir du stock principal préparé précédemment vers des tubes séparés de 1,5 millilitre. Concentrer les solutions d'ADNpe à l'aide du concentrateur sous vide.

Ajouter 975 microlitres de tampon d'incubation dans le tube contenant l'ARN sec et mélanger soigneusement pour s'assurer que tout l'ARN est dissous. Après une courte centrifugation de la solution d'ARN, procéder au recuit en plaçant le tube dans un bloc chauffant préchauffé pendant 10 minutes. Une fois terminé, éteindre le bloc chauffant et laisser l'échantillon refroidir à température ambiante.

Ajouter 75 microlitres d'ARN à chacun des tubes contenant le PNA séché et mélanger soigneusement. Après avoir laissé les échantillons à température ambiante pendant au moins une heure, les incuber à quatre degrés Celsius toute la nuit. Transférer maintenant les quantités appropriées d'ARN simple brin marqué à l'aminopurine 2 dans des tubes séparés de 1,5 millilitre.

Transférez les volumes appropriés d'ADP ciblé pour différentes concentrations à partir du stock principal vers les tubes respectifs contenant l'ARN simple brin. Après séchage des échantillons, ajoutez 75 microlitres de tampon d'incubation à chacun des tubes et mélangez soigneusement. Soumettez chaque échantillon à un appariement en plaçant chaque tube dans un bloc chauffant préchauffé pendant 10 minutes.

Après avoir laissé les échantillons refroidir à température ambiante, incubez-les à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, transférez 70 microlitres de chaque échantillon dans une cuvette carrée d'un centimètre. Placez la cuvette dans un fluorimètre et mesurez l'émission sur une plage de longueurs d'onde allant de 330 à 550 nanomètres.

Une fois la mesure terminée, retirez le tampon de la cuvette. Rincez la cuvette avec de l'eau distillée et séchez-la à l'aide de gaz azote. Après avoir répété la mesure pour tous les échantillons, tracez l'intensité de fluorescence en fonction de la longueur d'onde.

Transférez les quantités appropriées d'ARN simple brin dans des tubes séparés de 1,5 millilitre. Ensuite, transférez les volumes appropriés de PNA ciblé depuis le stock principal vers les tubes respectifs contenant l'ARN simple brin. Après séchage des échantillons, ajoutez 130 microlitres de tampon d'incubation à chacun des tubes et mélangez soigneusement.

Soumettez chaque échantillon à un recuit en plaçant chaque tube dans un bloc chauffant préchauffé pendant 10 minutes. Après avoir laissé les échantillons refroidir à température ambiante, incubez-les à quatre degrés Celsius toute la nuit. Transférez ensuite 130 microlitres de chaque échantillon dans une cuvette à huit microcellules, une cellule contenant du tampon d'incubation.

À l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis, mesurez l'absorbance de chaque échantillon à 260 nanomètres. Effectuez les mesures en augmentant la température de 15 à 95 degrés Celsius, puis en la diminuant de 95 à 15 degrés Celsius, avec une vitesse de rampe de 0,5 degré Celsius par minute. Les oligomères d'ADN peptidique ont été obtenus après deux purifications par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse.

L'identité des PNA peut être confirmée par analyse MALDI/TOF. Les données d'électrophorèse sur gel en conditions non dénaturantes suggèrent que le PNA modifié Q et L ne peut reconnaître la région d'ARN double brin qu'en présence d'une paire C-G. Cette reconnaissance spécifique et renforcée s'effectue par la formation de deux triplex PNA-ARN impliquant T-A-U-L-G-C et Q-C-G.

Une étude de titration par fluorescence de la 2-aminopurine a montré qu'une PNA modifiée par des résidus Q et L se lie à un ARN double brin ciblé, mais pas à un ARN simple brin. Les PNA contenant des résidus Q ne présentent pas de transition de fusion thermique, suggérant une absence de liaison à l'ARN simple brin en raison du conflit stérique dans la paire Q-G de type Watson-Crick. Par rapport à la PNA non modifiée P1, les PNA P4 et P5 contenant des résidus L présentent une température de fusion plus faible pour les duplex ARN-PNA correspondants, en raison du conflit stérique dans la paire L-G de type Watson-Crick.

Les données de fusion thermique détectées par absorbance UV sont cohérentes avec les données de titrage de fluorescence de la 2-aminopurine, qui montrent également qu'un PNA contenant des résidus Q et L ne se lie pas fortement à de l'ARN simple brin. L'incorporation d'une base Q est plus délétère que celle d'une base L, car la base Q provoque un encombrement stérique plus important lors de la formation d'une paire Q-G de type Watson-Crick. Une fois maîtrisées, les différentes expériences peuvent être réalisées en une semaine si elles sont effectuées correctement.

Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes telles que la détection et la ciblage des structures d'ARN dans les cellules peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme savoir si nous pouvons détecter les structures d'ARN et réguler leurs fonctions en utilisant des PNA (acides peptidiques nucléiques) à liaison double brin. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie de l'ARN et des maladies pour explorer le développement de thérapeutiques ciblant la structure des ARN.