Name: Reconnaissance de séquence-spécifique et sélective d’ARN Double-brin sur ARN monocaténaire par chimiquement modifiées acides nucléiques peptidiques (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-09-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 4 s
Description: Apprenez la reconnaissance séquence-spécifique d'ARN double-brin par des acides nucléiques peptidiques modifiés. Ces protocoles détaillés utilisent la spectrophotométrie de fluorescence et UV-Vis pour étudier les interactions ARN-PNA.

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Ce travail a été soutenu par le Singapour Ministère de l’éducation (MOE) niveau 1 (RGT3/13 et 15/RG42 G.C.) et MOE niveau 2 (MOE2013-T2-2-024 et MOE2015-T2-1-028 à G.C.).

Une demande de brevet (PAT/179/14/15/PCT) basée sur les travaux rapporté ici a été déposée.

RNA liaison duplex PNA oligomères (p. ex., 10-mers) sont des molécules de taille moyenne et ainsi peut montrer Maj mobilité électrophorétique lors de la liaison à l’ARN d’une taille comparable ou légèrement plus grande (par exemple, 50-mer ou plus petit). Si un ARN est sensiblement plus importante que l’autorité nationale palestinienne, titrage des ANP dans l’ARN peut ne pas fonctionner en raison d’un décalage de mobilité de gel limité. Ainsi, l’ARN grand peut être tronquée pour les essais non-dénaturisation de PAGE. Titrage d’un grand ARN dans un PNA marqués au fluorophore permet le suivi de la formation de triple par un gel d’agarose non dénaturants avec l’échantillon chargé au milieu du gel40.
Pour une expérience de titrage de non-dénaturisation de PAGE avec une concentration totale constante de l’ARN, nous utilisons généralement une concentration d’ARN non étiquetée 1 µm pour efficace post coloration des bandes triplex libre RNA et de bromure d’éthidium. Une concentration aussi faible que 0,2 µM d’ARN peut également être suffisante selon la RNA construction31. La concentration de l’ARN sans étiquette (0,2 µM) détermine que les valeurs ded Kpouvant être mesurée avec précision doivent être environ 0,2 µM ou supérieure. Autres colorants coloration peuvent servir à améliorer l’efficacité de la coloration. Par ailleurs, nos données non publiées suggèrent que Cy3 dye-labeled RNAs peut être utilisé dans les expériences de PAGE non dénaturants pour mesurer les événements de liaison étroite.
Dû au fait que 2-aminopurine n’est que modérément fluorescent, 2-aminopurine titrage de fluorescence est également limitée à la mesure de la liaison avec les valeurs de Kd proche ou supérieure à 0,2 µM31. L’ARN ou l’autorité palestinienne peut-être être marqué par un agent relativement brillant pour quantifier une liaison assez serré en solution par titrage de la fluorescence, si la liaison entraîne des changements dans la fluorescence signaux53,54, 55.
La stratégie de ciblage des structures d’ARN par liaison de dsRNA PNAs a été testée pour un nombre limité d’ARN. Il est probable que les propriétés de liaison peuvent varier pour ARN doubles brins avec des compositions différentes séquences et de paires de bases. On peut toujours choisir le brin riches en purines d’un duplex pour la conception de TFPNAs. Il est essentiel de comprendre comment consécutives Q· C-G triples pouvant affecter la stabilité d’un triplex. Études plus approfondies de séquence dépendant sont clairement nécessaires pour comprendre les propriétés de liaison de la séquence dépendante du TFPNAs.
L’affinité de liaison de TFPNAs peut être encore améliorée en augmentant la longueur et/ou modifier davantage les bases et dorsales56,57 du TFPNAs. Toutefois, une région duplex continue ne peut pas sont souvent constitués de plus de 10 paires de bases consécutives sans interruption par des structures non-Watson-Crick. On peut conjuguer TFPNAs avec petites molécules pour la reconnaissance des structures non-Watson-Crick adjacentes aux régions de dsRNA. En principe, un conjugué de molécule de TFPNA-grêle devrait avoir amélioré affinité et spécificité par rapport à un TFPNA ou une seule petite molécule. Toutefois, les propriétés chimiques et physiques de l’éditeur de liens pour la conjugaison58,59,60,61,62,63,64 doit être optimisé.
Le fait que TFPNAs pouvez lier sélectivement à ARN doubles brins sur ssRNAs et dsDNAs suggère qu’il est possible de développer des TFPNAs comme sondes chimiques très utiles et des ligands thérapeutiques potentiels par le biais de la réglementation des RNA dynamique des structures et des interactions avec protéines et métabolites. Assimilation de TFPNAs peut être facilitée grâce à la conjugaison avec des moitiés de pénétration cellulaire tels que de petites molécules, les peptides et les nanoparticules ou complexation avec des structures supramoléculaires comme les liposomes5,6 ,12,17,25,31,41,65,66. Fonctionnalisation de TFPNAs avec des tags bioimaging comme fluorophores et radio-isotopes peut faciliter la détection, l’imagerie et le ciblage des structures d’ARN fonctionnelles dans les organismes vivants.

RNAs apparaissent comme biomarqueurs importants et cibles thérapeutiques, due aux avances récentes dans les découvertes des rôles de l’ARN dans la régulation et la catalyse de divers processus biologiques1,2,3. Traditionnellement, les brins antisens ont été utilisés pour lier à ssRNAs par le biais de Watson-Crick formation duplex3,4,5,6,7,8, 9 , 10 , 11 , 12 , 13 , 14 , 15 , 16 , 17 , 18 , 19 , 20 , 21 , 22 , 23 , 24 , 25 , 26 , 27. récemment, triplex formant des acides nucléiques peptidiques (TFPNAs) ont été conçus pour lier à ARN doubles brins via Hoogsteen hydrogènes (Figure 1)3,28,29. ARNdb régions sont présentes dans la plupart du RNAs traditionnel antisens ciblées, y compris le pré-ARNm ARNm, avant ou pri-miARN3et nombreux autres non-codage RNAs1,26,27. Ciblage des ARN doubles brins par formation de triple hélice à l’aide de TFPNAs peut être avantageux, en raison de sa spécificité de la structure et est d’un grand potentiel pour servir à restaurer les fonctions normales de l’ARN, qui sont la dysrégulation dans les maladies, par exemple.
Le récent travail de Rozners et al.et nous3,28,29,30,31,32,33, 34,35,36,37,38,39,40,41, signalé les efforts sur l’amélioration la liaison sélective de mis à jour le TFPNAs vers ARN doubles brins avec une affinité accrue. Nous avons développé des méthodes de la synthèse des monomères PNA conçus rationnellement (Figure 2) y compris les thio-pseudoisocytosine (L) monomère30 et cytosine de 5-méthyl guanidine modifiés (Q) monomère31. Par le biais de diverses méthodes de caractérisation biochimiques et biophysiques, nous avons démontré que PNAs relativement courtes (6-10 résidus) incorporant des résidus L et Q Voir la reconnaissance améliorée des paires Watson-Crick G-C et C-G, respectivement, en ARN doubles brins. En outre, comparées aux PNAs non modifiés, PNAs, contenant des résidus L et Q montrent liaison plus sélective vers dsRNA ARN à simple brin et ADN double brin. La fonctionnalité de guanidine42 dans la base de Q permet de PNAs d’entrer de cellules HeLa31.
Dans notre laboratoire, nous avons synthétiser PNAs par la Boc-chimie manuelle (Boc ou t- Boc est synonyme de tert-butyloxycarbony (voir Figure 2) synthèse de peptide de phase solide méthode4. La synthèse du monomère PNA avec Boc comme l’aminé groupe protecteur est pratique car le groupe Boc est stériquement moins encombrant par rapport à fluorenylmethyloxycarbonyl (Fmoc) amine protégeant le groupe, qui peut être bénéfique au cours de monomère PNA de couplage le support solide. Le groupe Boc est labiles et peut être facilement enlevé sur le support solide de 20 à 50 % d’acide trifluoroacétique (TFA) dans du dichlorométhane (DCM) lors de la synthèse de l’ANP. Un synthétiseur de peptide automatisé peut être utilisé pour synthétiser des oligomères PNA ; Cependant, 3 à 5 fois excès de monomère de la PNA est nécessaire pour un synthétiseur de peptide automatisé. Synthèse manuelle nécessite beaucoup moins monomère de la PNA (excès de 2 à 3 fois), avec chaque couplage facilement contrôlée par le Kaiser test43. En outre, les nombreux synthétiseurs automatisés ne sont pas compatibles avec la synthèse de stratégie de Boc en raison de l’utilisation de TFA corrosif durant l’étape de suppression du Boc.
Les oligomères PNA peuvent être purifiés par chromatographie liquide haute performance en phase inverse (CLHP-PI) à le suivie de caractérisation de la masse moléculaire par MALDI-TOF (Figures 3 et 4)30, 31. nous employons PAGE non dénaturants pour suivre la formation de triple, dû au fait que duplex libre de RNA construit et le PNA lié triplex souvent voir la migration différents taux (Figure 5)30,31 . Aucun étiquetage n’est nécessaire si efficace après coloration est possible pour les deux du RNA duplex et PNA· Bandes de triplex2 RNA. Une quantité relativement petite de l’échantillon est nécessaire pour les non-dénaturisation PAGE expériences. Toutefois, les tampons de chargement (incubation) et les tampons en cours d’exécution (pH 8,3) peuvent être pas les mêmes, entraînant des mesures étant limités pour le triplex cinétiquement stable, car un pH relativement élevé de 8,3 peut-être considérablement déstabiliser un triplex.
2-Aminopurine est un isomère de l’adénine (6-aminopurine) ; l’intensité de fluorescence 2-aminopurine (avec un pic d’émission à environ 370 nm) est sensible aux changements de l’environnement structurel local et est adapté pour le suivi de la formation d’un triple avec le résidu de la 2-aminopurine constituée près de l’ANP contraignant () site La figure 6) 31. Contrairement à nombreux autres colorants qui montrent l’émission de fluorescence dans le domaine du visible, RNA 2-aminopurine-étiquetés peut être exposé à chambre lumineuse sans photo blanchiment. Contrairement à l’expérience de PAGE dans lequel un tampon en cours d’exécution du pH 8,3 est souvent nécessaire, 2-aminopurine basé fluorescence titrage permet la mesure de la liaison dans une solution à un pH spécifié et donc peut permettre la mesure et la détection de relativement faible et cinétiquement contraignant à l’équilibre instable.
UV-absorbance-détecté des expériences de fusion thermiques permettent la mesure de la stabilité thermique des duplex (Figure 7)31 et triPlex30,32,44,45. Selon la longueur et la séquence de composition, la fonte des triplex peut ou peut ne pas montrer une transition claire. Les paramètres thermodynamiques peuvent être obtenus si les courbes de chauffage et de climatisation se chevauchent. Les paramètres thermodynamiques précises peuvent être obtenues en isotherme titration calorimétrique (ITC)32; Cependant, des quantités relativement importantes d’échantillons sont généralement requises pour le CCI.

<table><tbody><tr><td>Tamis moléculaires, 4A, granulés de 1 à 2 mm de diamètre.</td><td>Alfa Aesar</td><td>87956</td><td></td></tr><tr><td>4-Méthylbenzhydrylamine chlorhydrate (MBHA&Yuml ; HCl)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>532444</td><td></td></tr><tr><td>N,N-diisopropylethylamine (DIPEA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11801</td><td></td></tr><tr><td>(Benzotriazol-1-yl-oxy)tripyrrolidinophosphonium hexafluorophosphate (PyBOP)</td><td>Alfa Aesar</td><td>B25251</td><td></td></tr><tr><td>Anhyride acétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>320102</td><td></td></tr><tr><td>Kaiser Test Kit&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60017</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluoroacétique (TFA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>L06374</td><td></td></tr><tr><td>Monomères PNA non modifiés</td><td>ASM Research Chemicals</td><td>GmbH 5004007, 5004008, 5004009, 5004010</td><td></td></tr><tr><td>Boc-Lys(Z)-OH / Fmoc-Lys(Boc)-OH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B8389 / 47624</td><td></td></tr><tr><td>Thioanisole</td><td>Alfa Aesar</td><td>A14846</td><td></td></tr><tr><td>1,2-Ethanedithiol</td><td>Alfa Aesar</td><td>L12865</td><td></td></tr><tr><td>Acide trifluorométhanesulfonique</td><td>Alfa Aesar</td><td>A10173</td><td></td></tr><tr><td>LiChrosper&reg ; 100 RP-18 endcapped (5 &micro ; m) LiChroCART&reg ; 250-4</td><td>Merck Millipore</td><td>150838</td><td></td></tr><tr><td>Oligos d’ARN²</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Personnalisé&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Acide &alpha ;-cyano-4-hydroxycinnamique (CHCA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>39468</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA)</td><td>Alfa Aesar</td><td>J15694</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&nbsp ;</td><td>Lonza</td><td>17-737E</td><td></td></tr><tr><td>Acrylamide</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A8887</td><td></td></tr><tr><td>N.N'-methylenebisacrylamide</td><td>Sigma-Aldrich&nbsp ;</td><td></td><td></td>146072</tr><tr><td>Persulfate d’ammonium (APS)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0700</td><td></td></tr><tr><td>Tétraméthyléthylènediamine (TEMED)</td><td>Bio-rad</td><td>161-0800</td><td></td></tr><tr><td>10X Tris-Borate-EDTA (TBE) Tampon, pH 8,3</td><td>1ère base</td><td>BUF-3010-10X1L</td><td></td></tr><tr><td>Glycérol&nbsp ;</td><td>Promega&nbsp ;</td><td>H5433</td><td></td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium (10 mg/mL)</td><td>Bio-rad&nbsp ;</td><td>161-0433</td><td></td></tr><tr><td>Cellule de haute précision (Quartz Suprasil, 200-2500 nm)</td><td>Hellma Analytics&nbsp ;</td><td>105.250-QS</td><td></td></tr></tbody></table>

reconnaissance de séquence-spécifique et sélective d’arn double-brin sur arn monocaténaire par chimiquement modifiées acides nucléiques peptidiques

Sequence-specific and Selective Recognition of Double-stranded RNAs over Single-stranded RNAs by Chemically Modified Peptide Nucleic Acids

RNAs apparaissent comme biomarqueurs importants et cibles thérapeutiques. Ainsi, il y a beaucoup de potentiel dans le développement de sondes chimiques et thérapeutiques ligands pour la reconnaissance de la séquence d’ARN et de la structure. Chimiquement modifiées Peptide Nucleic Acid (PNA) oligomères ont été récemment mis au point qui peut reconnaître duplex RNA d’une façon séquence-spécifique. PNAs sont chimiquement stables avec un squelette peptidique comme neutre. PNAs peuvent être synthétisés relativement facilement par la méthode de synthèse de peptide de phase solide Boc-chimie manuelle. PNAs sont purifiés par HPLC en phase inversée, suivie par la caractérisation de la masse moléculaire laser assistée par matrice désorption/ionisation-temps de vol (MALDI-TOF). Technique de (PAGE) l’électrophorèse sur gel de polyacrylamide non dénaturants facilite l’imagerie de la formation de triple, car soigneusement conçu gratuit RNA duplex construit et PNA lié triplex souvent voir la migration différents tarifs. PAGE non dénaturants avec coloration de post de bromure d’éthidium est souvent une technique simple et informative pour caractériser les affinités de liaison et les spécificités des oligomères PNA. En règle générale, les piques de RNA ou duplex avec une seule paire de bases des mutations multiples peut être utilisé pour caractériser les propriétés de liaison de PNA, comme liant les affinités et les spécificités. 2-Aminopurine est un isomère de l’adénine (6-aminopurine) ; l’intensité de fluorescence 2-aminopurine est sensible aux changements de l’environnement structurel local et est adaptée pour le suivi de la formation de triple avec les résidus de 2-aminopurine constituée près du site de liaison PNA. 2-Aminopurine titrage de fluorescence permet également de confirmer la sélectivité de liaison de mis à jour le PNAs vers ciblées ARN double brin (dsRNA) pendant ARN monocaténaire (ssRNAs). UV-absorbance-détecté des expériences de fusion thermiques permettent la mesure de la stabilité thermique des duplex PNA-RNA et PNA· Triplex de RNA de2 . Ici, nous décrivons la synthèse et purification d’oligomères PNA incorporant résidus modifiée et décrivent des méthodes biochimiques et biophysiques pour la caractérisation de la reconnaissance des duplex de RNA par les mis à jour le PNAs.

HPLC en phase inversée permet la purification des oligomères PNA. Nous pouvons obtenir des oligomères PNA purs avec deux séries de purification HPLC (Figure 3). L’identité des revue PNAs peut être confirmée par analyse de MALDI-TOF (Figure 4).
PAGE non dénaturants est une technique simple et informative pour caractériser les affinités de liaison et les spécificités des oligomères PNA. Nous utilisons généralement plusieurs barettes RNA ou duplex avec les mutations seul nucléotide pour caractériser les propriétés de liaison (Figure 5). Les données de PAGE non dénaturants illustrées à la Figure 5 indiquent clairement que le Q - et L-modification PNA peut reconnaître une région de dsRNA avec une paire de C-G (Figure 5B, panneau inférieur) mais pas l’un sans une paire de C-G (Figure 5B, top Groupe d’experts). Cette reconnaissance spécifique et renforcée est par le biais de la T· A-U, L· G-C et Q· C-G PNA· Formation de RNA2 triple base (Figure 1A, C, D). PNAs diverses mutations uniques ou multiples peuvent également être utilisés pour démontrer les propriétés de liaison améliorée d’un PNA mis à jour le. Nous avons montré que l’ajout de Mg2 + 2 mM dans le tampon d’incubation n’affecte pas la liaison significativement31.
Nous avons démontré par titrage de fluorescence 2-aminopurine qui un PNA Q - et L-modification se lie à une région de dsRNA ciblées (Figure 6A, 6C, 6D) mais pas ssRNA (Figure 6B, 6E, 6F). PNA P3 se lie à l’ARNdb 2-aminopurine-étiqueté avec une valeur ded Kde 0,8 ± 0,1 µM. L’intensité de fluorescence à 370 nm pour l’ARN simple brin 2-aminopurine-étiqueté demeure relativement constante avec concentration de P3 variée, indiquant l’absence de liaison des PNA P3 à l’ARN simple brin.
PNAs contenant du spectacle les résidus (P2 et P3) Q aucun thermique fonte transitions (Figure 7), ce qui laisse supposer aucune liaison à l’ARN simple brin. Cela est dû à l’affrontement stérique présent dans Watson-Crick comme Q-G la paire. Par rapport aux non modifiées PNA P1, PNAs P4 et P5 contenant modifié résidus L mais aucun résidu de Q, voir la diminution des températures de fusion pour les duplex de RNA-PNA correspondants en raison de l’affrontement stérique présent dans Watson-Crick comme L-G la paire. Les données de fusion thermiques absorbance UV-détectés sont compatibles avec les données de titrage 2-aminopurine fluorescence, qui montre aussi qu’un PNA contenant des résidus de Q et L ne lie pas à ARN à simple brin sensiblement (Figure 6B, 6E, 6F). Intégrant une base de Q est plus déstabilisante qu’une base de L, comme une base Q a un affrontement stérique plus important dans la formation d’une paire de type Watson-Crick Q-G (Figure 1F) par rapport à une paire de type Watson-Crick L-G (Figure 1E ).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig1v2.jpg"> 
Figure 1 : Les structures chimiques des structures stables paires de bases base triple et instables. (A-D) PNA· major-groove ARN2 base triples de T· A-U (A), C+· G-C (B), L· G-C (C) et Q· C-G (D). (E, F) Watson-Crick instable comme paires de bases du PNA-RNA L-G (E) et Q-G (F). La lettre R représente l’épine dorsale du sucre-phosphate de l’ARN. Liaisons hydrogènes sont indiqués par des pointillés noirs. La figure est reproduite de référence31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig2v2.jpg"> 
Figure 2 : Structure chimique des monomères PNA. Quatre monomères PNA (T, C, L et Q) sont indiquées. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig3.jpg"> 
Figure 3 : Structure chimique d’un oligomère PNA et purification par RP-HPLC. (A) la structure chimique de la séquence PNA P3. (B, C) Données de RP-HPLC de brut PNA P3 (B) et re-purifiée PNA P3 (C). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig4.jpg"> 
Figure 4 : Spectre de MALDI-TOF de purifiée PNA P3. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig5.jpg"> 
Figure 5 : Hairpin RNA et séquences PNA et caractérisation de la liaison de PAGE non dénaturants. (A) RNA barettes (rHP1 et rHP2), PNA P3 et un PNA· ARN2 triplex formé entre PNA P3 et rHP2. (B) Non dénaturants PAGE (12 %) résulte pour rHP1 et rHP2 liaison PNA P3. Le tampon d’incubation est de 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. Les épingles à cheveux RNA chargés (rHP1 et rHP2) sont à 1 µM dans 20 µL. Les concentrations de l’ANP dans les voies de gauche à droite sont 0, 0,2, 0,4, 1, 1,6, 2, 4, 10, 16, 20, 28, et 50 µM. PNA P3 ne lie pas aux rHP1 (panneau supérieur) mais lie à rHP2 (panneau inférieur). (C) Kd détermination pour la liaison de P3 à rHP2. La fraction de formation triple (Y) a été complotée contre la concentration de la PNA. La figure est adaptée de référence31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig6.jpg"> 
Figure 6 : Étude de titrage de fluorescence de liaison PNA P3à 2-aminopurine-étiqueté RNAs. Le résidu 2-aminopurine est désigné comme « 2 » dans la séquence d’ARN. Le tampon d’incubation est de 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM HEPES, pH 7,5. (A) un PNA· ARN2 triplex formé entre P3 et un ARNdb 2-aminopurine-étiqueté (dsRNA2-2AP). (B) une hypothétique duplex PNA-ARN formé entre P3 et un ARN simple brin 2-aminopurine-étiqueté (ssRNA2-2AP). (C, E) Spectres d’émission de fluorescence pour la 2-aminopurine-étiqueté ARN duplex (1 µM) et l’ARN à simple brin (1 µM), respectivement, avec varié P3 concentration à un pH de 7,5. Le pic à environ 475 nm est due à l’émission de fluorescence faible de la base de L à l’ANP. (D, F) K d détermination basée sur les parcelles de l’intensité de fluorescence 2-aminopurine (370 nm) du duplex de RNA et ARN simple brin, respectivement, contre la concentration de PNA P3. La figure est adaptée de référence31. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56221/56221fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56221/56221fig7.jpg"> 
Figure 7 : Thermal fusion des résultats des duplex de RNA-PNA. Le tampon d’incubation est de 200 mM NaCl, 0,5 mM EDTA, 20 mM NaH2PO4, pH 7,5. Tous les échantillons contiennent 5 µM d’ARN simple brin (ssRNA1) et PNA dans 130 µL. (A) ARN à simple brin (ssRNA1), PNAs (P1, P2, P3, P4 et P5) et un duplex de PNA-RNA hypothétique formée entre PNA P3 et ssRNA1 dans une orientation parallèle. L’affrontement stérique est indiqué pour le Watson-Crick comme Q-G ou paires de L-G. Courbes de fusion (B) pour différents PNAs liaison au ssRNA1. Les températures de fusion sont indiqués pour les courbes avec fusion des transitions. La figure est adaptée de référence31.

Nous rapportons les protocoles pour la synthèse et purification d’oligomères de Peptide Nucleic Acid (PNA) incorporant des résidus modifiée. Décrit les méthodes biochimiques et biophysiques pour la caractérisation de la reconnaissance des duplex de RNA par les mis à jour le PNAs.

Reconnaissance de séquence-spécifique et sélective d’ARN Double-brin sur ARN monocaténaire par chimiquement modifiées acides nucléiques peptidiques

RNAs are emerging as important biomarkers and therapeutic targets. Thus, there is great potential in developing chemical probes and therapeutic ligands ...

L'objectif général de cet article méthodologique est de présenter les protocoles détaillés utilisés par notre laboratoire pour étudier la reconnaissance moléculaire des ARN double brin par des acides nucléiques peptidiques chimiquement modifiés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie chimique de l'ARN, telles que la détection et le ciblage de structures d'ARN. Le principal avantage de cette technique réside dans le fait que les principes de conception peuvent s'appliquer au ciblage de n'importe quelle structure en duplex d'ARN.La procédure sera démontrée par Desiree Toh, une chargée de recherche de mon laboratoire. Pour commencer cette procédure, ajoutez quatre microlitres d'une solution de glycérol à 35 % à des échantillons d'ARN-PNA préparés au préalable et mélangez délicatement. À l'aide d'une micropipette et de pointes de chargement pour gel, déposez soigneusement 20 microlitres de chaque échantillon sur un gel de polyacrylamide préparé au préalable en veillant à ne pas introduire de bulles d'air.Faites migrer le gel à une tension constante de 250 volts pendant cinq heures. Au bout de cinq heures, éteignez l'alimentation électrique et retirez la plaque de verre du support à gel. Retirez ensuite le ruban scellant le gel et démontez la plaque de verre.Retirez délicatement le gel de la plaque de verre et placez-le dans un récipient contenant 350 millilitres d'eau déionisée. Ajoutez soigneusement 35 microlitres de bromure d'éthidium dans le récipient et placez-le sur l'agitateurmoteur à vitesse lente pendant 30 minutes. Après avoir éliminé la solution de bromure d'éthidium, rincez le gel avec 1,5 à deux litres d'eau distillée.Ensuite, analyser le gel à l’aide d’un imageur équipé d’un laser vert de 532 nanomètres et d’un filtre d’émission réglé à 610 nanomètres. Quantifier les intensités des bandes du gel à l’aide d’un logiciel gratuit. Transférer la quantité appropriée d’ARN double brin marqué par la 2-aminopurine dans un tube propre de 1,5 millilitre.Ensuite, concentrer les solutions d'ARN à l'aide d'un concentrateur sous vide. Puis, transférer les volumes appropriés de l'ADNpe correspondant pour différentes concentrations à partir du stock principal préparé précédemment vers des tubes séparés de 1,5 millilitre. Concentrer les solutions d'ADNpe à l'aide du concentrateur sous vide.Ajouter 975 microlitres de tampon d'incubation dans le tube contenant l'ARN sec et mélanger soigneusement pour s'assurer que tout l'ARN est dissous. Après une courte centrifugation de la solution d'ARN, procéder au recuit en plaçant le tube dans un bloc chauffant préchauffé pendant 10 minutes. Une fois terminé, éteindre le bloc chauffant et laisser l'échantillon refroidir à température ambiante.Ajouter 75 microlitres d'ARN à chacun des tubes contenant le PNA séché et mélanger soigneusement. Après avoir laissé les échantillons à température ambiante pendant au moins une heure, les incuber à quatre degrés Celsius toute la nuit. Transférer maintenant les quantités appropriées d'ARN simple brin marqué à l'aminopurine 2 dans des tubes séparés de 1,5 millilitre.Transférez les volumes appropriés d'ADP ciblé pour différentes concentrations à partir du stock principal vers les tubes respectifs contenant l'ARN simple brin. Après séchage des échantillons, ajoutez 75 microlitres de tampon d'incubation à chacun des tubes et mélangez soigneusement. Soumettez chaque échantillon à un appariement en plaçant chaque tube dans un bloc chauffant préchauffé pendant 10 minutes.Après avoir laissé les échantillons refroidir à température ambiante, incubez-les à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, transférez 70 microlitres de chaque échantillon dans une cuvette carrée d'un centimètre. Placez la cuvette dans un fluorimètre et mesurez l'émission sur une plage de longueurs d'onde allant de 330 à 550 nanomètres.Une fois la mesure terminée, retirez le tampon de la cuvette. Rincez la cuvette avec de l'eau distillée et séchez-la à l'aide de gaz azote. Après avoir répété la mesure pour tous les échantillons, tracez l'intensité de fluorescence en fonction de la longueur d'onde.Transférez les quantités appropriées d'ARN simple brin dans des tubes séparés de 1,5 millilitre. Ensuite, transférez les volumes appropriés de PNA ciblé depuis le stock principal vers les tubes respectifs contenant l'ARN simple brin. Après séchage des échantillons, ajoutez 130 microlitres de tampon d'incubation à chacun des tubes et mélangez soigneusement.Soumettez chaque échantillon à un recuit en plaçant chaque tube dans un bloc chauffant préchauffé pendant 10 minutes. Après avoir laissé les échantillons refroidir à température ambiante, incubez-les à quatre degrés Celsius toute la nuit. Transférez ensuite 130 microlitres de chaque échantillon dans une cuvette à huit microcellules, une cellule contenant du tampon d'incubation.À l'aide d'un spectrophotomètre UV-Vis, mesurez l'absorbance de chaque échantillon à 260 nanomètres. Effectuez les mesures en augmentant la température de 15 à 95 degrés Celsius, puis en la diminuant de 95 à 15 degrés Celsius, avec une vitesse de rampe de 0,5 degré Celsius par minute. Les oligomères d'ADN peptidique ont été obtenus après deux purifications par chromatographie liquide à haute performance en phase inverse.L'identité des PNA peut être confirmée par analyse MALDI/TOF. Les données d'électrophorèse sur gel en conditions non dénaturantes suggèrent que le PNA modifié Q et L ne peut reconnaître la région d'ARN double brin qu'en présence d'une paire C-G. Cette reconnaissance spécifique et renforcée s'effectue par la formation de deux triplex PNA-ARN impliquant T-A-U-L-G-C et Q-C-G.Une étude de titration par fluorescence de la 2-aminopurine a montré qu'une PNA modifiée par des résidus Q et L se lie à un ARN double brin ciblé, mais pas à un ARN simple brin. Les PNA contenant des résidus Q ne présentent pas de transition de fusion thermique, suggérant une absence de liaison à l'ARN simple brin en raison du conflit stérique dans la paire Q-G de type Watson-Crick. Par rapport à la PNA non modifiée P1, les PNA P4 et P5 contenant des résidus L présentent une température de fusion plus faible pour les duplex ARN-PNA correspondants, en raison du conflit stérique dans la paire L-G de type Watson-Crick.Les données de fusion thermique détectées par absorbance UV sont cohérentes avec les données de titrage de fluorescence de la 2-aminopurine, qui montrent également qu'un PNA contenant des résidus Q et L ne se lie pas fortement à de l'ARN simple brin. L'incorporation d'une base Q est plus délétère que celle d'une base L, car la base Q provoque un encombrement stérique plus important lors de la formation d'une paire Q-G de type Watson-Crick. Une fois maîtrisées, les différentes expériences peuvent être réalisées en une semaine si elles sont effectuées correctement.Après avoir suivi cette procédure, d'autres méthodes telles que la détection et la ciblage des structures d'ARN dans les cellules peuvent être réalisées afin de répondre à des questions supplémentaires, comme savoir si nous pouvons détecter les structures d'ARN et réguler leurs fonctions en utilisant des PNA (acides peptidiques nucléiques) à liaison double brin. Depuis son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie de l'ARN et des maladies pour explorer le développement de thérapeutiques ciblant la structure des ARN.

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