Reconnaissance de séquence-spécifique et sélective d’ARN Double-brin sur ARN monocaténaire par chimiquement modifiées acides nucléiques peptidiques

L’objectif général de cet article sur les méthodes est de présenter les protocoles détaillés utilisés par notre laboratoire pour étudier la reconnaissance moléculaire des ARN double brin par les acides nucléiques peptidiques chimiquement modifiés. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie chimique de l’ARN, telles que la détection et le ciblage des structures de l’ARN. Le principal avantage de cette technique est que les principes de conception peuvent être applicables au ciblage de n’importe quelle structure duplex d’ARN.

La démonstration de la procédure sera faite par Desiree Toh, une associée de recherche de mon laboratoire. Pour commencer cette procédure, ajoutez quatre microlitres d’une solution de glycérol à 35 % à des échantillons d’ARN PNA préalablement préparés et mélangez doucement. À l’aide d’une micropipette et d’embouts de chargement de gel, versez soigneusement 20 microlitres de chaque échantillon dans un gel de polyacrylamide préalablement préparé en veillant à ne pas introduire de bulles d’air.

Faites fonctionner le gel à une tension constante de 250 volts pendant cinq heures. Au bout de cinq heures, coupez l’alimentation électrique et retirez la plaque de verre du support de gel. Retirez ensuite le ruban d’étanchéité en gel et démontez la plaque de verre.

Retirez délicatement le gel de la plaque de verre et placez-le dans un récipient rempli de 350 millilitres d’eau déminéralisée. Ajoutez délicatement 35 microlitres de bromure d’éthidium dans le récipient et placez-le sur la plate-forme à basse vitesse pendant 30 minutes. Après avoir éliminé la solution de bromure d’éthidium, rincez le gel avec 1,5 à deux litres d’eau distillée.

Ensuite, scannez le gel à l’aide d’un imageur avec un laser vert de 532 nanomètres et le filtre d’émission réglé à 610 nanomètres. Quantifiez l’intensité de la bande de gel à l’aide d’un logiciel libre. Transférez la quantité appropriée d’ARN double brin marqué à la 2-aminopurine dans un tube propre de 1,5 millilitre.

Concentrez ensuite les solutions d’ARN à l’aide d’un concentrateur à vide. Ensuite, transférez les volumes appropriés de l’ANP ciblé pour diverses concentrations à partir du stock principal préalablement préparé dans des tubes séparés de 1,5 millilitre. Concentrez les solutions PNA à l’aide du concentrateur sous vide.

Ajoutez 975 microlitres de tampon d’incubation dans le tube contenant l’ARN séché et mélangez soigneusement pour vous assurer que tout l’ARN est dissous. Après avoir brièvement centrifugé la solution d’ARN, soumettez-la à un recuit en plaçant le tube dans un bloc de chaleur préchauffé pendant 10 minutes. Lorsque vous avez terminé, éteignez le bloc de chaleur et laissez l’échantillon refroidir à température ambiante.

Ajoutez 75 microlitres d’ARN dans chacun des tubes contenant le PNA séché et mélangez soigneusement. Après avoir laissé les échantillons reposer à température ambiante pendant au moins une heure, incubez-les à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Maintenant, transférez les quantités appropriées d’ARN simple brin marqué à la 2-aminopurine dans des tubes séparés de 1,5 millilitre.

Transférez les volumes appropriés de PNA ciblés pour diverses concentrations de la matrice principale vers les tubes respectifs contenant l’ARN simple brin. Après avoir séché les échantillons, ajoutez 75 microlitres de tampon d’incubation dans chacun des tubes et mélangez soigneusement. Soumettez chaque échantillon au recuit en plaçant chaque tube dans un bloc de chaleur préchauffé pendant 10 minutes.

Après avoir laissé les échantillons refroidir à température ambiante, incubez-les à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Ensuite, transférez 70 microlitres de chaque échantillon dans une cuvette d’un centimètre carré. Placez la cuvette dans un spectrophotomètre de fluorescence et mesurez l’émission sur une gamme de longueurs d’onde de 330 à 550 nanomètres.

Une fois la mesure terminée, retirez le tampon de la cuvette. Rincez la cuvette à l’eau distillée et séchez-la à l’azote gazeux. Après avoir répété la mesure pour tous les échantillons, tracez l’intensité de fluorescence en fonction de la longueur d’onde.

Transférez les quantités appropriées d’ARN simple brin dans des tubes séparés de 1,5 millilitre. Transférez ensuite les volumes appropriés de PNA ciblés de la matrice principale vers les tubes respectifs contenant l’ARN simple brin. Après avoir séché les échantillons, ajoutez 130 microlitres de tampon d’incubation dans chacun des tubes et mélangez soigneusement.

Soumettez chaque échantillon au recuit en plaçant chaque tube dans un bloc de chaleur préchauffé pendant 10 minutes. Après avoir laissé les échantillons refroidir à température ambiante, incubez-les à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Maintenant, transférez 130 microlitres de chaque échantillon dans une cuvette de huit microcellules avec une cellule contenant un tampon d’incubation.

À l’aide d’un spectrophotomètre UV-Vis, mesurez l’absorbance de chaque échantillon à 260 nanomètres. Mesurez à une température croissante de 15 à 95 degrés Celsius, suivie d’une température décroissante de 95 à 15 degrés Celsius à une vitesse de rampe de 0,5 degré Celsius par minute. Les oligomères PNA ont été obtenus après deux purifications HPLC en phase inverse.

L’identité des PNA peut être confirmée par l’analyse MALDI/TOF. Les données PAGE non dénaturantes suggèrent que le PNA modifié Q et L ne peut reconnaître la région de l’ARN double brin qu’avec une paire C-G. Cette reconnaissance spécifique et renforcée se fait par le biais de la formation triple basée sur le T-A-U-L-G-C et le Q-C-G PNA RNA à deux.

Une étude de titrage par fluorescence 2-aminopurine a montré qu’un PNA modifié en Q et L se lie à un ARN double brin ciblé, mais pas à un ARN simple brin. Les PNA contenant des résidus Q ne présentent pas de transitions de fusion thermique, ce qui suggère une absence de liaison à l’ARN simple brin en raison du choc stérique dans la paire Q-G de type Watson Watson-Crick. Par rapport aux PNA P1 non modifiés, les PNA P4 et P5 contenant des résidus L présentent une température de fusion plus basse pour les duplex d’ARN PNA correspondants en raison du choc stérique dans la paire L-G de type Watson-Crick.

Les données de fusion thermique détectées par absorbance UV sont cohérentes avec les données de titrage de fluorescence 2-aminopurine qui montrent également qu’un PNA contenant des résidus Q et L ne se lie pas fortement à l’ARN simple brin. L’incorporation d’une base Q est plus déstabilisante qu’une base L car une base Q a un conflit stérique plus important dans la formation d’une paire Q-G de type Watson-Crick. Une fois maîtrisées, les différentes expériences peuvent être réalisées en une semaine si elles sont bien réalisées.

Après cette procédure, d’autres méthodes telles que l’exploration et le ciblage des structures d’ARN dans les cellules peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que la détection des structures d’ARN et la régulation des fonctions de l’ARN en utilisant des PNA de liaison à l’ARN double brin. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie de l’ARN et des maladies pour explorer le développement thérapeutique ciblé de la structure de l’ARN.