Imagerie confocale d’ARN bicaténaire et récepteurs de reconnaissance de modèle dans l’infection par le Virus ARN de polarité négative
26 janvier 2019
ARN bicaténaire produite lors de la réplication des virus à ARN sont reconnaissables par les récepteurs de reconnaissance de modèle pour induire une réponse immunitaire innée. Pour les virus à ARN sens négatif, l’interaction entre l’Arndb à basse altitude et PRRs reste floue. Nous avons développé une méthode de microscopie confocale afin de visualiser les arénavirus dsRNA et PRR dans des cellules individuelles.
L’essai traditionnel de détection d’ARN à double brin n’est habituellement pas assez sensible pour détecter l’ARN à double brin formé dans l’infection négative-sens de virus d’ARN. Par conséquent, l’interaction entre l’ARN à double brin et les récepteurs de reconnaissance du modèle hôte est restée largement insaisissable pour ces virus. En utilisant ce protocole, nous sommes en mesure de visualiser et de caractériser l’interaction entre la protéine nucléaire virale, l’ARN à double brin et l’hôte d’un PRR à un niveau d’une seule cellule pour le virus de l’ARN à sens négatif. Il s’agit d’un test multiplexe qui permet la coloration simultanée de l’ARN double brin et deux cibles virales ou de protéines hôtes dans les cellules individuelles. Contrairement à l’analyse ARN-FISH, cette technique est indépendante de la séquence arn et généralement compatible avec la détection d’anticorps des cibles protéiques. Commencez 24 heures avant l’infection en ensemencement de 200 000 cellules A549 épithéliales pulmonaires humaines sur des couvercles en verre enduits de Poly-D-Lysine glissés dans des plaques de 12 puits et les cultivant à 37
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Aperçu
Cette étude explore la reconnaissance de l'ARN double brin (dsARN) produit pendant la réplication des virus ARN par les récepteurs de reconnaissance des motifs (PRR) pour induire une réponse immunitaire innée. L'accent est mis sur les virus ARN à polarité négative, où l'interaction entre les faibles niveaux de dsARN et les PRR n'est pas bien comprise. Une méthode de microscopie confocale a été développée pour visualiser le dsARN des arénavirus et les PRR dans des cellules individuelles.
Composants clés de l'étude
Domaine de la science
- Neuroscience
- Immunologie
- Virologie
Contexte
- L'ARN double brin est un sous-produit de la réplication des virus ARN.
- Les récepteurs de reconnaissance des motifs jouent un rôle crucial dans la réponse immunitaire innée.
- L'interaction entre le dsARN et les PRR dans les virus ARN à polarité négative est mal comprise.
- La visualisation du dsARN et des PRR peut améliorer la compréhension de l'évasion immunitaire virale.
Objectif de l'étude
- Élucider l'interaction entre le dsARN et les PRR dans les virus ARN à polarité négative.
- Développer une méthode pour visualiser ces interactions dans des cellules individuelles.
- Contribuer à la compréhension de la réponse immunitaire innée aux virus ARN.
Méthodes utilisées
- Microscopie confocale pour la visualisation du dsARN et des PRR.
- Essais cellulaires pour évaluer la réponse immunitaire.
- Analyse des niveaux de dsARN pendant la réplication virale.
- Études comparatives avec différents virus ARN.
Principaux résultats
- Visualisation réussie du dsARN des arénavirus et des PRR dans des cellules individuelles.
- Identification d'interactions spécifiques entre le dsARN et les PRR.
- Aperçu des mécanismes de réponse immunitaire déclenchés par le dsARN.
- Clarification du rôle du dsARN dans la pathogenèse virale.
Conclusions
- La méthode de microscopie confocale développée est efficace pour étudier les interactions dsARN et PRR.
- La compréhension de ces interactions peut conduire à de nouvelles stratégies thérapeutiques contre les virus ARN.
- Cette recherche contribue au domaine plus large de l'immunologie virale.
Questions fréquemment posées
Executive Industry Relevance
Visualizing low-abundance double-stranded RNA (dsRNA) in negative-sense RNA virus infection addresses a critical gap in understanding innate immune activation and viral immune evasion. This capability supports target validation and mechanistic de-risking in antiviral discovery by enabling direct observation of pattern recognition receptor (PRR) engagement with viral replicative intermediates. The method enhances predictive confidence in early-stage target selection for arenavirus and related pathogens, informing portfolio prioritization in high-containment pathogen programs.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by visualizing dsRNA-PRR interactions at single-cell resolution in pathogenic virus models.
- Operational Value: Provides a sensitive, sequence-independent detection method compatible with multiplexed protein staining for pathway clarification.
- Predictive Value: Supports biological de-risking of PRR targets by confirming ligand engagement in relevant infection contexts.
Screening & Assay Development
- Assay Readiness: Generates quantitative, spatially resolved readouts of dsRNA and PRR colocalization for assay standardization.
- Screening Relevance: Prepares validated biological systems for downstream compound screening by establishing baseline immune activation metrics.
- Platform Utility: Compatible with antibody-based detection, enabling reuse across viral targets and host proteins in imaging workflows.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery observations to preclinical validation by mapping dsRNA distribution and PRR recruitment in disease-relevant systems.
- Mechanistic Insight: Clarifies spatial and temporal dynamics of innate immune signaling, informing biomarker selection for pathway modulation.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables data-driven go/no-go decisions based on visual confirmation of target engagement in high-pathogenicity models.
Pipeline & Workflow Integration
The method fits within the discovery continuum from target hypothesis testing through lead identification to preclinical validation, particularly for immunomodulatory antivirals targeting PRR pathways.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing of PRR agonist/antagonist mechanisms by visualizing dsRNA as the endogenous ligand in infected cells.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative imaging outputs that enable comparison of compound effects on dsRNA-PRR interactions.
- Analytics: Provides multiplexed fluorescence readouts (dsRNA, viral protein, PRR) for high-content analysis of immune activation states.
- Translational Research: Connects in vitro observations to preclinical continuity by confirming PRR activation in primary or stem-cell-derived lung epithelial models.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized imaging platform applicable to multiple negative-sense RNA viruses and host targets beyond arenaviruses.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases target validation confidence by reducing mechanistic ambiguity in PRR-ligand interactions.
- Operational Value: Enhances assay reproducibility and scalability through standardized confocal protocols and sensitive dsRNA detection.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality by providing direct visual evidence of pathway modulation, reducing late-stage attrition.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of immunomodulatory candidates based on confirmed target engagement in pathogenic virus contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in confocal microscopy, immunofluorescence staining, and biosafety-level-appropriate virology techniques.
- Dependent on access to high-sensitivity dsRNA antibodies (e.g., 9D5 clone) and compatible fluorescence imaging infrastructure.
- Necessitates standardization across laboratories for consistent dsRNA signal quantification and colocalization analysis.
- Must account for cell model variability (e.g., A549 vs. primary airway epithelium) in dsRNA production and PRR expression levels.
- Practical limitations include potential antibody cross-reactivity and the need for optimization in high-containment (BSL-3/BSL-4) settings.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:04
Title
1:05
Preparation of A549 Cells and JUNV (Junn virus) Infection
2:09
Fixation and Immunostaining
5:10
Results: Distribution and Colocalization Between the Retinoic Acid Like Receptors RLRs (RIG-I and MDA-5) and dsRNA in JUNV-infected Cells
5:52
Conclusion
