Name: Mitochondrial Ca2 + rétention capacité dosage et Ca2 +-déclenchée gonflement Mitochondrial test (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-05-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 53 s
Description: Apprenez à mesurer la capacité de rétention du calcium mitochondrial et le gonflement induit par Ca²⁺ dans les mitochondries isolées de cellules SH-SY5Y. Cette méthode simple permet d'étudier la dysfonction mitochondriale.

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Cette étude a été financée par des subventions de l’attribution de le scientifique exceptionnelle du Shandong (JQ201421) et la subvention de la NSFC (81371226).

1. isolation des mitochondries
Remarque : Toutes les solutions et les équipements doivent être prérefroidir 0 - 4 ° C et gardés sur glace.
<ol><li>Semences environ 3 x 106 SH-SY5Y cellules / boîte de Petri de cellule 10 cm. Des cellules de culture en haute-glucose Dulbecco modifiée milieu Eagle avec 10 % sérum de veau fœtal, la pénicilline (100 U/mL)-streptomycine (100 µg/mL). Maintenir à 37 ° C dans un incubateur contenant 5 % de CO2 pendant la nuit. NOTE : au moins 1-2 x 107 SH-SY5Y cellules sont nécessaires pour chaque dosage d’isolement.</li>
	<li>Retirez le support et laver les cellules avec environ 1 mL de PBS froid glace dans une boîte de Petri de cellulaire de 10 cm 3 fois.</li>
	<li>Ajouter de nouveau 1 mL de PBS froid glace en boîte de Petri de cellule 10 cm et racler les cellules adhérentes dans un nouveau tube de 1,5 mL. Centrifuger à 800 x g pendant 10 min à 4 ° C.</li>
	<li>Au cours de la centrifugation, préparer 5 mL de tampon d’isolement mitochondriale (250 mM saccharose, 10 HEPES (4-(2-hydroxyethyl)-1-pipérazine ethanesulfonic acide), 10 mM KCl, 1,5 mM MgCl2, 1 mM EDTA) additionné de 50 μL de stock d’inhibiteurs de la protéase solution (concentration de x 100 ; 1 comprimé sans EDTA dissous dans 500 µL de ddH2O).</li>
	<li>Retirez le surnageant et Resuspendre le culot avec 1 mL de tampon d’isolement mitochondriale. Incuber le tube 1,5 mL sur la glace pendant 30 min.</li>
	<li>Lyser les cellules les suspension avec un homogénéisateur de verre (15 à 25 coups) monter et descendre manuellement sur la glace. Remarque : Assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles lorsque les cellules sont homogénéisés. Compter les cellules intactes et les noyaux mis à nu par microscope visuellement et confirmer que > rupture cellulaire 90 % s’est produite.</li>
	<li>Transférer l’homogénat dans un tube de 1,5 mL et centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min à 4 ° C pour éliminer les débris (noyaux et des cellules intactes restantes).</li>
	<li>Transvaser le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 mL et centrifuger à 1 000 x g pendant 5 min 4 ° C.</li>
	<li>Transférer le surnageant dans un nouveau tube et centrifuger à 14 000 x g pendant 15 min 4 ° C.</li>
	<li>Retirez le surnageant et Resuspendre le culot contenant des mitochondries avec 1 mL de tampon d’isolement mitochondriale.</li>
	<li>Centrifuger la solution pendant 15 min à 14 000 x g 4 ° C pour précipiter les mitochondries.</li>
	<li>Le culot de mitochondries qui en résultent doit être conservé dans la glace et resuspendu dans médias KCl 50-100 μL (KCl 125 mM, 2 mM K2HPO4, 1 mM MgCl2, 20 mM HEPES, glutamate de 5 mM, malate de 5 mM et la 2 μM roténone, pH 7,4) selon le volume de granulés avant n’importe quel cul Ay.</li>
	<li>5 μL de solution mitochondriale permet de mesurer la concentration de protéines mitochondriales de l’essai normalisé de BCA, mesurant OD562 à l’aide d’un lecteur de plaque13.</li>
</ol>2. détermination des mitochondries Ca2 + capacité de rétention
<ol><li>Préparer les médias de KCl et ajouter le Ca2 +-liaison colorant fluorescent vert à une concentration finale de 0,5 μM avant l’expérience.</li>
	<li>Transférer 1 mL de mitochondries isolées (0,4 mg/mL) dans des milieux de KCl contenant 0,5 μM Ca2 +-liaison colorant fluorescent vert dans chaque boîte de 6 puits bien.</li>
	<li>Incuber les mitochondries et le Ca2 +-liaison colorant fluorescent vert dans la plaque de 6 puits à température ambiante, abrie de la lumière ambiante pour 1 min. Ajouter 4 μL aliquotes d’un 20 mM CaCl2 solution (20 mM CaCl2, 127 mM KCl, 1 mM MgCl2 20 mM HEPES, glutamate de 5 mM, malate de 5 mM, pH 7,4) à chaque plaque 6 puits, puits à l’aide de la boîte automatique distribuer réglage d’introduire 200 nmol Ca2 +/mg protéine mitochondriale.</li>
	<li>Utiliser un spectromètre à fluorescence pour surveiller les changements de fluorescence toutes les 3 s pendant 2 min avec une longueur d’onde d’excitation de 506 nm et une longueur d’onde d’émission de 531 nm. La plaque est équipée d’agitation à 600 tr/min pour 3 s entre lecture commandée par le logiciel (Figure 1).</li>
	<li>Ajouter une aliquote de 4 μL supplémentaires de 20 mM CaCl2 solution dans chaque puits et surveiller les changements de fluorescence toutes les 3 s pour 2 min. Répétez cette étape jusqu'à ce que la fluorescence augmente avec le temps. Remarque : Les mitochondries sont mis au défi avec l’addition Ca2 + indiquée par la fluorescence d’enregistrement accrue. Lorsque le mPTP s’ouvre, la fluorescence augmente avec le temps.</li>
	<li>Interpréter la quantité totale de Ca2 + ajoutés jusqu'à ce que le mPTP s’ouvre comme la capacité de rétention en2 + Ca.</li>
</ol>3. détermination du Ca 2 +-induite de gonflement Mitochondrial
<ol><li>Préparer les médias KCl avant l’expérience.<ol>
<li>Transférer 1 mL de mitochondries isolées (0,4 mg/mL) dans les médias de KCl dans chaque boîte de 6 puits bien.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Ajouter 10 μL de 20 mM CaCl2 solution aqueuse (500 nmol/mg de protéine mitochondriale) dans les protéines mitochondriales pour déclencher le gonflement mitochondrial.</li>
	<li>Enregistrer la diminution de l’absorbance à 540 nm toutes les 3 s sur un lecteur de microplaques, commandé par le logiciel pendant 10 min (Figure 2). Les changements de fluorescence sont provoquées par un afflux de solutés à travers la membrane mitochondriale interne. Remarque : La diminution absorbance à 540 nm correspond aux mitochondries gonflées. Si le lecteur ne respecte pas une diminution de l’absorbance, un plus long intervalle de lecture ou du temps de lecture peuvent être adoptées.</li>
</ol>

<ol><li>Rossi, C. S., Lehninger, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stoichiometry+of+respiratory+stimulation%2C+accumulation+of+Ca%2B%2B+and+phosphate%2C+and+oxidative+phosphorylation+in+rat+liver+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Stoichiometry of respiratory stimulation, accumulation of Ca++ and phosphate, and oxidative phosphorylation in rat liver mitochondria.</a> J Biol Chem. 239 (11), 3971-3980 (1964).</li>
<li>Gunter, T. E., Buntinas, L., Sparagna, G., Eliseev, R., Gunter, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+calcium+transport%3A+mechanisms+and+functions%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Calcium%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial calcium transport: mechanisms and functions.</a> Cell Calcium. 28 (5-6), 285-296 (2000).</li>
<li>Crofts, A. R., Chappell, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+Ion+Accumulation+and+Volume+Changes+of+Isolated+Liver+Mitochondria.+Reversal+of+Calcium+Ion-Induced+Swelling%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Calcium Ion Accumulation and Volume Changes of Isolated Liver Mitochondria. Reversal of Calcium Ion-Induced Swelling.</a> Biochem J. 95, 387-392 (1965).</li>
<li>Wojda, U., Salinska, E., Kuznicki, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+ions+in+neuronal+degeneration%5BTitle%5D)+AND+%22IUBMB+Life%22%5BJournal%5D)">Calcium ions in neuronal degeneration.</a> IUBMB Life. 60 (9), 575-590 (2008).</li>
<li>Celsi, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondria%2C+calcium+and+cell+death%3A+a+deadly+triad+in+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Mitochondria, calcium and cell death: a deadly triad in neurodegeneration.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (5), 335-344 (2009).</li>
<li>Murphy, A. N., Bredesen, D. E., Cortopassi, G., Wang, E., Fiskum, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bcl-2+potentiates+the+maximal+calcium+uptake+capacity+of+neural+cell+mitochondria%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Bcl-2 potentiates the maximal calcium uptake capacity of neural cell mitochondria.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 93 (18), 9893-9898 (1996).</li>
<li>Rajdev, S., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Calcium+green-5N%2C+a+novel+fluorescent+probe+for+monitoring+high+intracellular+free+Ca2%2B+concentrations+associated+with+glutamate+excitotoxicity+in+cultured+rat+brain+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22Neurosci+Lett%22%5BJournal%5D)">Calcium green-5N, a novel fluorescent probe for monitoring high intracellular free Ca2+ concentrations associated with glutamate excitotoxicity in cultured rat brain neurons.</a> Neurosci Lett. 162 (1-2), 149-152 (1993).</li>
<li>Stout, A. K., Reynolds, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-affinity+calcium+indicators+underestimate+increases+in+intracellular+calcium+concentrations+associated+with+excitotoxic+glutamate+stimulations%5BTitle%5D)+AND+%22Neuroscience%22%5BJournal%5D)">High-affinity calcium indicators underestimate increases in intracellular calcium concentrations associated with excitotoxic glutamate stimulations.</a> Neuroscience. 89 (1), 91-100 (1999).</li>
<li>Bambrick, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cyclosporin+A+increases+mitochondrial+calcium+uptake+capacity+in+cortical+astrocytes+but+not+cerebellar+granule+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Bioenerg+Biomembr%22%5BJournal%5D)">Cyclosporin A increases mitochondrial calcium uptake capacity in cortical astrocytes but not cerebellar granule neurons.</a> J Bioenerg Biomembr. 38 (1), 43-47 (2006).</li>
<li>Zhao, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell-permeable+peptide+antioxidants+targeted+to+inner+mitochondrial+membrane+inhibit+mitochondrial+swelling%2C+oxidative+cell+death%2C+and+reperfusion+injury%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Cell-permeable peptide antioxidants targeted to inner mitochondrial membrane inhibit mitochondrial swelling, oxidative cell death, and reperfusion injury.</a> J Biol Chem. 279 (33), 34682-34690 (2004).</li>
<li>Muriel, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mitochondrial+free+calcium+levels+%28Rhod-2+fluorescence%29+and+ultrastructural+alterations+in+neuronally+differentiated+PC12+cells+during+ceramide-dependent+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22J+Comp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Mitochondrial free calcium levels (Rhod-2 fluorescence) and ultrastructural alterations in neuronally differentiated PC12 cells during ceramide-dependent cell death.</a> J Comp Neurol. 426 (2), 297-315 (2000).</li>
<li>Allman, R., Hann, A. C., Phillips, A. P., Martin, K. L., Lloyd, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Growth+of+Azotobacter+vinelandii+with+correlation+of+Coulter+cell+size%2C+flow+cytometric+parameters%2C+and+ultrastructure%5BTitle%5D)+AND+%22Cytometry%22%5BJournal%5D)">Growth of Azotobacter vinelandii with correlation of Coulter cell size, flow cytometric parameters, and ultrastructure.</a> Cytometry. 11 (7), 822-831 (1990).</li>
<li>Wiechelman, K. J., Braun, R. D., Fitzpatrick, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+the+bicinchoninic+acid+protein+assay%3A+identification+of+the+groups+responsible+for+color+formation%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Investigation of the bicinchoninic acid protein assay: identification of the groups responsible for color formation.</a> Anal Biochem. 175 (1), 231-237 (1988).</li>
<li>Petronilli, V., Nicolli, A., Costantini, P., Colonna, R., Bernardi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+permeability+transition+pore%2C+a+voltage-dependent+mitochondrial+channel+inhibited+by+cyclosporin+A%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Regulation of the permeability transition pore, a voltage-dependent mitochondrial channel inhibited by cyclosporin A.</a> Biochim Biophys Acta. 1187 (2), 255-259 (1994).</li>
<li>Pastorino, J. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+consequences+of+the+sustained+or+transient+activation+by+Bax+of+the+mitochondrial+permeability+transition+pore%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Functional consequences of the sustained or transient activation by Bax of the mitochondrial permeability transition pore.</a> J Biol Chem. 274 (44), 31734-31739 (1999).</li>
<li>Gunter, T. E., Sheu, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characteristics+and+possible+functions+of+mitochondrial+Ca%282%2B%29+transport+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characteristics and possible functions of mitochondrial Ca(2+) transport mechanisms.</a> Biochim Biophys Acta. 1787 (11), 1291-1308 (2009).</li>
</ol>

X. Sun supervisé les expériences. Li Wei a effectué des expériences. Chen Zhang et X. soleil a écrit le livre.

Ici, nous avons décrit un protocole simple et efficace pour le mitochondrial Ca2 + rétention capacité dosage et Ca2 +-déclenchée essai de gonflement mitochondrique.
Pour l’isolement mitochondriale, assurez-vous que tous les matériaux et les tubes sont sur la glace, surtout quand les cellules de l’homogénéisation. 0,25 % de trypsine-EDTA peut également servir pour détacher les cellules du plat pendant 5 min à 37 ° C. Après les coups de 15-25, il est nécessaire d’observer l...

Les mitochondries sont les principaux organes cellulaires pour produire près de 95 % de l’ATP utilisé dans les cellules de mammifère par la phosphorylation oxydative. Il est signalé que la concentration micromolaire séquestrée de Ca2 + par les mitochondries, la présence d’ADP et de phosphate inorganique peut être utilisé pour phosphoryler l’ADP à la synthèse d’ATP1. Quand la concentration cytosolique Ca2 + va au-delà d’un seuil, les mitochondries peuvent absorption Ca2 + rapidement et l’efflux il lentement. Ainsi, les mitochondries de fonctionnement peuvent afflux l’augmentation Ca cytosolique2 +. Sans rapport avec la participation de la phosphorylation oxydative, la mitochondrial Ca2 + également prendre part à des signaux de calcium cytosolique et activer le mécanisme apoptotique mitochondriale en provoquant l’ouverture de la PFMP en interne mitochondriale membrane2. Il a été largement reconnu qu’élévation anormale de la Ca intracellulaire2 + peut induire mitochondrial enflure massive en ouvrant le mPTP3. Ainsi, le présent protocole a pour but d’évaluer la fonction mitochondriale en quantifiant la capacité mitochondriale de Ca2 + rétention et Ca2 +-trigged gonflement mitochondrial.
Capacité de rétention en ca2 + est la mesure de la capacité des mitochondries de calcium cytosolique de l’absorption. Mitochondries peuvent mettre en mémoire tampon le calcium libre cytosolique et régulent les processus cellulaires dépendant du calcium par l’absorption de calcium sous forme de précipités inactives. Capacité altérée de Ca2 + rétention se produit dans les phénomènes de stress associés à la limitation de l’énergie et de4,maladies neurodégénératives voire5. Les mitochondries isolées ou cellules perméabilisées digitonine peuvent être utilisés pour identifier la capacité de rétention Ca2 + , et la capacité élevée d’accumuler Ca2 + par les mitochondries isolées avec le glutamate supplementaires et le malate n’est pas effectuée par le procédure d’isolement mitochondrial6. Une quantité titrée de digitonine devrait être utilisée pour permeabilize les membranes plasmiques des différents types de cellules. Le sel de hexapotassium de Ca2 +-liaison colorant fluorescent vert, un Ca2 +-cellule-imperméants sensible indicateur visible de la lumière-excitables, a été largement utilisé7. Ca2 +-vert colorant fluorescent est un indicateur de faible affinité et utilisée pour montrer que des concentrations2 + Ca libre intracellulaires continuent d’augmenter au cours de reliure prolongée de stimulations (5 min)8. Cette méthode était moins sensible que la technique du filtre radioactif, mais a été grandement simplifiée. Les autres Ca2 + élève fluorescence verte de calcium et l’absorption de Ca2 + par les mitochondries retourne la fluorescence au niveau de référence. Des additions séquentielles de Ca2 + ont été faites jusqu'à ce que les mitochondries n’a pas d’absorption extramitochondrial Ca2 + 9. Un lecteur de microplaques de fluorescence peut être utilisé pour signaler en permanence la fluorescence verte de calcium.
Après accumulation de Ca2 + , les mitochondries dépolarisé, libéré Ca2 + dans le milieu et a commencé à enfler. Ca2 +-a déclenché des mitochondries gonflement est utilisé pour indiquer l’ouverture du mPTP. La microscopie électronique et la diminution de lumière absorbance à 540 nm peut être utilisé pour mesurer le Ca2 +-déclenchée mitochondrial gonflement10,11. Volume de mitochondries peut être directement déterminé par l’angle avant diffusion de la lumière12, où la diminution de l’absorbance reflète gonflement passif de la matrice mitochondriale.
Ici, nous illustrons la méthodologie afin d’examiner la capacité mitochondriale de Ca2 + rétention et Ca2 +-a déclenché un gonflement mitochondrique en mitochondries isolées des cellules SH-SY5Y.

<table><tbody><tr><td>Lignée cellulaire SH-SY5Y</td><td>ATCC (The Global Bioresource Center)</td><td>Numéro ATCC : CRL-2266</td><td></td></tr><tr><td>Vert calcique-5N</td><td>Life Technologies</td><td>c-3737</td><td>Ca2+-liant vert colorant fluorescent</td></tr><tr><td>inhibiteurs complets de protéase</td><td>Roche Molecular Biochemicals</td><td>4693116001</td><td></td></tr><tr><td>homogénéisateur de verre</td><td>Kimble Chase</td><td>9885303002</td><td></td></tr><tr><td>glutamate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RES5063G-A7</td><td></td></tr><tr><td>malate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>46940-U</td><td></td></tr><tr><td>roténone</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8875</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>00457</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900050</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9541</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>V900266</td><td></td></tr><tr><td>Varioskan flash instruments</td><td>Thermo Scientific</td><td>IC100E</td><td></td></tr><tr><td>Bongkrekate</td><td>Biovision</td><td>1820-100</td><td></td></tr><tr><td>atractyloside</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C4992</td><td></td></tr><tr><td>à haute teneur en glucose Dulbecco' s modified Eagle medium</td><td>Hyclone</td><td>SH30022</td><td>4,5 g/L de glucose, L-glutamine, sans pyruvate</td></tr><tr><td>de sodium Sérum fœtal bovin</td><td>Hyclone</td><td>SV30087</td><td></td></tr><tr><td>pénicilline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P3032</td><td></td></tr><tr><td>streptomycine</td><td>Invitrogen</td><td>11860-038</td><td></td></tr><tr><td>Kit de dosage BCA</td><td>Thermo Scientific</td><td>NCI3225CH</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Hyclone</td><td>SH30256.01</td><td></td></tr><tr><td>Plat de culture cellulaire de 10 cm</td><td>NEST</td><td>704001</td><td></td></tr></tbody></table>

mitochondrial ca2 + rétention capacité dosage et ca2 +-déclenchée gonflement mitochondrial test

Mitochondrial Ca2+ Retention Capacity Assay and Ca2+-triggered Mitochondrial Swelling Assay

La production d’ATP par phosphorylation oxydative est la principale fonction des mitochondries. Les mitochondries chez les eucaryotes supérieurs participent également à cytosolique Ca2 + mise en mémoire tampon, et la production d’ATP dans les mitochondries peut être véhiculée par intramitochondrial Ca2 + concentration libre. Capacité de ca2 + rétention peut être considérée comme la capacité des mitochondries pour retenir le calcium dans la matrice mitochondriale. Ca intracellulaire accumulé2 + conduit à la perméabilité de la membrane mitochondriale interne, appelé l’ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale (mPTP), ce qui conduit à la fuite des molécules avec un moléculaire poids moins de 1,5 kDa. Ca2 +-a déclenché des mitochondries gonflement est utilisé pour indiquer l’ouverture du mPTP. Nous décrivons ici deux essais afin d’examiner la capacité de rétention en Ca2 + et Ca2 +-a déclenché un gonflement mitochondrique en mitochondries isolées. Après certains montants de Ca2 + sont ajoutés, toutes les étapes peuvent être remplies en une seule journée et enregistrés par un lecteur de microplaques. Ainsi, ces deux tests simples et efficaces peuvent être adoptées pour évaluer le Ca2 +-fonctions mitochondriales liées.

Représentant les résultats de Ca2 + capacité de rétention : Les résultats ont été exprimés en valeurs de fluorescence. Avec les impulsions supplémentaires du Ca2 + (200 nmols/mg protéine mitochondriale), la fluorescence a augmenté de double au-dessus de référence avec l’ouverture du mPTP. 5 μM Bongkrekate (BKA), un inhibiteur de Ca2 +-induite par le mPTP ouverture ou 1 μM atractyloside (RTA), un activateur de Ca2 +-induite par le mPT...

Ce protocole a pour but de décrire une méthode afin d’examiner la capacité de rétention en Ca2 + et Ca2 +- déclenchée mitochondrial gonflement des mitochondries isolées de SH-SY5Y cellules étape par étape.

Mitochondrial Ca2 + rétention capacité dosage et Ca2 +-déclenchée gonflement Mitochondrial test

The production of ATP by oxidative phosphorylation is the primary function of mitochondria. Mitochondria in higher eukaryotes also participate in ...

L'objectif général de cette expérience est de déterminer la capacité de rétention du calcium mitochondrial lors d'un gonflement mitochondrial induit par le calcium. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l'étude du dysfonctionnement mitochondrial, telles que le métabolisme énergétique anormal. Le principal avantage de cette technique est qu'elle est très simple et efficace.Pour commencer, ensemencez environ trois millions de cellules SH-SY5Y par boîte de culture cellulaire de 10 centimètres. Retirez le milieu et lavez les cellules avec environ un millilitre de PBS glacé dans une boîte de culture cellulaire de 10 centimètres, trois fois. Ajoutez un millilitre de PBS glacé dans la boîte de culture cellulaire de 10 centimètres et grattez les cellules adhérentes pour les transférer dans un nouveau tube de 1,5 millilitre.Centrifuger à 800 × g pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Pendant la centrifugation, préparer cinq millilitres de tampon d'isolement mitochondrial, supplémenté avec 50 microlitres de solution mère d'inhibiteur de protéase. Éliminer le surnageant et re-suspendre le culot dans un millilitre de tampon d'isolement mitochondrial.Incuber le tube de 1,5 millilitre sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, lyser les cellules en suspension à l’aide d’un homogénéisateur en verre, en effectuant manuellement des mouvements de va-et-vient sur de la glace. Transférer l’homogénat dans un tube de 1,5 millilitre.Ensuite, centrifuger à 1 000 ×g pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les débris. Après la centrifugation, transférer le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre avant de centrifuger à nouveau comme précédemment. Après le transfert du surnageant dans un nouveau tube, centrifuger à 14 000 ×g pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.Éliminer le surnageant et re-suspendre le culot contenant les mitochondries dans un millilitre de tampon d'isolement mitochondrial. Puis centrifuger la solution pendant 15 minutes à 14 000 × g et à 4 °C pour précipiter les mitochondries. Le culot mitochondrial obtenu doit être conservé sur glace et re-suspendu dans 50 à 100 microlitres de milieu de chlorure de potassium, selon le volume du culot, avant tout essai.Enfin, utilisez cinq microlitres de solution mitochondriale pour mesurer la concentration en protéines mitochondriales par un dosage BCA standard, en mesurant l'OD562 à l'aide d'un lecteur de plaques. Préparez le milieu de chlorure de potassium et ajoutez le colorant vert fluorescent fixant le calcium à une concentration finale de 0,5 micromolaire avant l'expérience. Pour déterminer la capacité de rétention du calcium mitochondrial, transférez d'abord un millilitre de mitochondries isolées en milieu de chlorure de potassium contenant 0,5 micromolaire de colorant vert fluorescent fixant le calcium dans chaque puits d'une plaque à six puits.Incubez les mitochondries et le colorant vert fluorescent fixant le calcium dans la plaque à six puits à température ambiante, à l’abri de la lumière ambiante pendant une minute. Après l’incubation, ajoutez des aliquotes de quatre microlitres de la solution de chlorure de calcium à 20 millimolaire dans chaque puits de la plaque à six puits en utilisant le réglage de distribution automatique afin d’introduire 200 nanomoles de calcium par milligramme de protéine mitochondriale. Utilisez le spectromètre de fluorescence pour surveiller les variations de fluorescence toutes les trois secondes pendant deux minutes, avec une longueur d’onde d’excitation de 506 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 531 nanomètres.La plaque est équipée d'un agitage à 600 tr/min pendant trois secondes entre chaque lecture, contrôlé par un logiciel. Ajoutez une aliquote supplémentaire de quatre microlitres de solution de chlorure de calcium à 20 millimolaire dans chaque puits, puis surveillez les variations de fluorescence toutes les trois secondes pendant deux minutes. Pour déterminer le gonflement mitochondrial induit par le calcium, transférez un millilitre de mitochondries isolées en milieu de chlorure de potassium dans chaque puits d'une plaque à six puits.Ensuite, ajoutez 10 microlitres de solution aqueuse de chlorure de calcium à 20 millimolaire aux protéines mitochondriales pour déclencher un gonflement mitochondrial. À l’aide d’un lecteur de microplaque contrôlé par un logiciel, enregistrez la diminution de l’absorbance toutes les trois secondes pendant 10 minutes à 540 nanomètres. Les résultats représentatifs de la capacité de rétention du calcium mitochondrial en présence de bongkrékique, un inhibiteur de l’ouverture du pore de transition de perméabilité mitochondriale induite par le calcium, ou MPTP, d’atractyloside, un activateur de l’ouverture du MPTP induite par le calcium, et d’un témoin blanc sont présentés ici.La capacité dans le traitement à la bongkrékine est beaucoup plus élevée que dans le groupe à l'atractyloside, comme prévu. Des résultats représentatifs du gonflement mitochondrial induit par le calcium en présence de bongkrékine, d'atractyloside et dans le témoin non traité sont présentés ici. La diminution de l'absorbance mesurée à 540 nanomètres indique les gonflements mitochondriaux.Les résultats suggèrent que la BKA peut inhiber l'ouverture du MPTP, tandis que l'ATR peut faciliter l'ouverture du MPTP. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures si elle est effectuée correctement. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler de garder toutes les solutions sur de la glace.

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Ce protocole décrit une méthode pour mesurer en temps réel des flux de calcium mitochondrial par imagerie de fluorescence. La méthode tire parti d'une circulaire permuté YFP à base de capteurs de calcium à double excitation ratiométrique (ratiométrique pericam-mt) sélectivement exprimé dans les mitochondries.

Surveillance des changements dynamiques dans les niveaux de calcium mitochondrial cours de l&#39;apoptose en utilisant un capteur de calcium codées génétiquement

Un protocole spectrofluorimétrique pour la mesure de l'ouverture de pore de transition de perméabilité mitochondriale dans les mitochondries isolées de souris coeur est présenté ici. Le test consiste à mesurer simultanément les mitochondries...

Multi-paramètres de mesure de l&#39;ouverture des pores de transition de perméabilité dans le Cœur de souris mitochondries isolées

Cette vidéo décrit un test basé sur un lecteur de plaque pour mesurer l’absorption de calcium mitochondrial dans des mitochondries isolées. Le test analyse le signal de fluorescence d’un colorant fluorescent sensible au calcium pour étudier la cinétique de l’absorption mitochondriale du calcium et de la surcharge calcique.

Dosage de l’absorption du calcium mitochondrial : méthode basée sur un lecteur de plaque pour mesurer l’absorption du calcium dans des mitochondries isolées

Cette vidéo décrit un test basé sur l’imagerie par microscopie confocale pour mesurer l’absorption de calcium mitochondrial dans les cellules en culture. Le test utilise le colorant fluorescent sensible au calcium Rhod-2/AM pour mesurer le calcium mitochondrial dans les cellules cultivées perméabilisées.

Dosage de l’influx de calcium pour mesurer l’absorption de calcium mitochondrial dans les cellules cultivées

Cette vidéo montre la procédure d’évaluation de la capacité de rétention du calcium mitochondrial en surveillant les changements en temps réel de la fluorescence lorsque les mitochondries absorbent le calcium. Ce test est utile pour étudier la fonction mitochondriale et les processus liés au calcium, y compris l’apoptose et les maladies neurodégénératives.

Détermination de la capacité de rétention calcique des mitochondries isolées

Les mitochondries peuvent utiliser le potentiel électrochimique à travers leur membrane interne (Δ Ψm) pour séquestrer le calcium (Ca2 +), ce qui leur permet de façonner Ca cytosolique 2+ de signalisation dans la cellule. Nous décrivons un procédé pour mesurer simultanément les mitochondries Ca2 + d'absorption et ΔΨ m dans les cellules vivantes en utilisant des colorants fluorescents et de la microscopie confocale.

Mesure simultanée de mitochondrial Calcium et mitochondrial potentiel membranaire dans des cellules vivantes par microscopie à fluorescence

Nous présentons ici deux protocoles pour mesurer des influx mitochondriale de Ca2 + dans les mitochondries isolées et des cellules. Pour les mitochondries isolées, nous détaillons une plaque base lecteur Ca2 + importation de dosage à l’aide du Ca2 + sensibles teindre calcium vert-5N. Pour les cellules cultivées, on décrit une méthode de microscopie confocale en utilisant le Ca2 + colorant Rhod-2/AM.

Analyses des Influx de Calcium mitochondrique dans les mitochondries isolées et des cellules

Dans ce travail, nous décrivons un protocole modifié pour tester le flux de substrat respiratoire mitochondrial en utilisant la perfringolysine O recombinante en combinaison avec la respirométrie à base de microplaques. Avec ce protocole, nous montrons comment la metformine affecte la respiration mitochondriale de deux lignées cellulaires tumorales différentes.

Mesure du flux de substrat mitochondrial dans les cellules O-perméabilisées de perfringolysine recombinante

Ce protocole vise à fournir une méthode d’imagerie mitochondriale in vitro et in vivo du Ca2+ dans les astrocytes et les neurones.

Imagerie de l’absorption mitochondriale de Ca2+ dans les astrocytes et les neurones à l’aide d’indicateurs ca2+ codés génétiquement (GECI)

Ce protocole décrit un test comparatif, utilisant des activités complexes mitochondriales CI+CIII et CII+CIII en présence ou en l’absence de Na+, pour étudier l’existence de pools de CoQ fonctionnels partiellement segmentés.

La sensibilité de la membrane mitochondriale interne au Na+ révèle des pools de CoQ fonctionnels partiellement segmentés

Ici, nous présentons une compilation de tests pour mesurer directement la fonction mitochondriale dans les cellules de mammifères indépendamment de leur capacité à consommer de l’oxygène moléculaire.

Tests indépendants de l’oxygène pour mesurer la fonction mitochondriale chez les mammifères

Apprenez à mesurer la capacité de rétention du calcium mitochondrial et le gonflement induit par Ca²⁺ dans les mitochondries isolées de cellules SH-SY5Y. Cette méthode simple permet d'étudier la dysfonction mitochondriale.

Mitochondrial Ca^{2 +} rétention capacité dosage et Ca^{2 +}-déclenchée gonflement Mitochondrial test

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