Mitochondrial Ca^{2 +} rétention capacité dosage et Ca^{2 +}-déclenchée gonflement Mitochondrial test

Ce protocole a pour but de décrire une méthode afin d’examiner la capacité de rétention en Ca^{2 +} et Ca^{2 +}- déclenchée mitochondrial gonflement des mitochondries isolées de SH-SY5Y cellules étape par étape.

L’objectif global de cette expérience est de déterminer la capacité de rétention du calcium mitochondrial dans le gonflement mitochondrial induit par le calcium. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans l’étude du dysfonctionnement mitochondrial, comme un métabolisme énergétique anormal. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est très simple et efficace.

Pour commencer, ensemencez environ trois millions de cellules SH-SY5Y par boîte de culture cellulaire de 10 centimètres. Retirez le milieu et lavez trois fois les cellules avec environ un millilitre de PBS glacé dans une boîte de culture cellulaire de 10 centimètres. Ajoutez un millilitre de PBS glacé dans la boîte de culture cellulaire de 10 centimètres et grattez les cellules adhérentes dans un nouveau tube de 1,5 millilitre.

Centrifuger à 800 fois G pendant 10 minutes à quatre degrés Celsius. Pendant la centrifugation, préparez cinq millilitres de tampon d’isolement mitochondrial, complétés par 50 microlitres de solution mère d’inhibiteur de protéase. Retirez le surnageant et remettez la pastille en suspension avec un millilitre de tampon d’isolement mitochondrial.

Incuber le tube de 1,5 millilitre sur de la glace pendant 30 minutes. Ensuite, lysez les cellules suspendues avec un homogénéisateur en verre, de haut en bas manuellement sur de la glace. Transférez l’homogénat dans un tube de 1,5 millilitre.

Ensuite, centrifugez à 1 000 fois G pendant cinq minutes à quatre degrés Celsius pour éliminer les débris. Après la centrifugation, transférez le surnageant dans un nouveau tube de 1,5 millilitre avant de centrifuger à nouveau comme précédemment. Après avoir transféré le surnageant dans un nouveau tube, centrifugez-le à 14 000 fois G pendant 15 minutes à quatre degrés Celsius.

Retirez le surnageant et remettez en suspension la pastille contenant des mitochondries avec un millilitre de tampon d’isolement mitochondrial. Ensuite, centrifugez la solution pendant 15 minutes à 14 000 fois G et quatre degrés Celsius pour précipiter les mitochondries. La pastille de mitochondrie résultante doit être conservée sur de la glace et remise en suspension dans 50 à 100 microlitres de chlorure de potassium, en fonction du volume de la pastille avant tout essai.

Enfin, utilisez cinq microlitres de solution mitochondriale pour mesurer la concentration en protéines mitochondriales à l’aide d’un dosage standard des BCA, en mesurant OD562 à l’aide d’un lecteur de plaques. Préparez le milieu de chlorure de potassium et ajoutez le colorant fluorescent vert liant le calcium à une concentration finale de 0,5 micromolaire avant l’expérience. Pour déterminer la capacité de rétention du calcium mitochondrial, transférez d’abord un millilitre de mitochondries isolées dans un milieu de chlorure de potassium contenant 0,5 colorant fluorescent vert de liaison micromolaire de calcium dans chaque puits d’une plaque à six puits.

Incuber les mitochondries et le colorant fluorescent vert liant le calcium dans la plaque à six puits à température ambiante, à l’abri de la lumière ambiante pendant une minute. Après l’incubation, ajoutez quatre aliquotes d’un microlitre à la solution de chlorure de calcium de 20 millimolaires dans chaque puits de la plaque à six puits en utilisant le réglage de distribution automatique pour introduire 200 nanomoles de calcium par milligramme de protéine mitochondriale. Utilisez le spectromètre fluorescent pour surveiller les changements de fluorescence toutes les trois secondes pendant deux minutes avec une longueur d’onde d’excitation de 506 nanomètres et une longueur d’onde d’émission de 531 nanomètres.

La plaque est équipée d’une agitation à 600 tr/min pendant trois secondes entre les lectures, contrôlée par un logiciel. Ajoutez une aliquote supplémentaire de quatre microlitres de solution de chlorure de calcium de 20 millimolaires dans chaque puits, puis surveillez les changements de fluorescence toutes les trois secondes pendant deux minutes. Pour déterminer le gonflement mitochondrial induit par le calcium, transférez un millilitre de mitochondries isolées dans un milieu de chlorure de potassium dans chaque puits d’une plaque à six puits.

Ensuite, ajoutez 10 microlitres de solution aqueuse de chlorure de calcium de 20 millimolaires à la protéine mitochondriale pour déclencher le gonflement mitochondrial. À l’aide d’un lecteur de microplaques contrôlé par un logiciel, enregistrez la diminution de l’absorbance toutes les trois secondes pendant 10 minutes à 540 nanomètres. Les résultats représentatifs de la capacité de rétention calcique mitochondriale du bongkrekic, un inhibiteur du pore de transition de perméabilité mitochondriale induite par le calcium, ou MPTP, ouvrant l’atractyloside, un activateur de l’ouverture du MPTP induite par le calcium et un contrôle à blanc, sont présentés ici.

La capacité dans le traitement par bongkrekic est beaucoup plus élevée que dans le groupe atractyloside, comme prévu. Les résultats représentatifs de l’enflure mitochondriale induite par le calcium de Bongkrekic, de l’atractyloside et de l’absence de traitement sont présentés ici. La diminution de l’absorbance observée à 540 nanomètres indique les gonflements mitochondriaux.

Les résultats suggèrent que le BKA peut inhiber l’ouverture du MPTP, tandis que l’ATR peut faciliter l’ouverture du MPTP. Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en cinq heures si elle est exécutée correctement. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de garder toutes les solutions sur la glace.