Visualisation des cellules multiciliées dans le poisson-zèbre à travers un protocole combiné de toute monture Fluorescent In Situ hybridation et Immunofluorescence

L'objectif général de ce protocole est de marquer et de visualiser in situ les cellules multiciliées du poisson-zèbre. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, comme par exemple quels facteurs régulent les cellules multiciliées dans le rein embryonnaire du poisson-zèbre ? Le principal avantage de cette technique est que les protéines et les transcrits d'ARN peuvent être marqués simultanément, ce qui est utile en l'absence d'anticorps spécifiques au poisson-zèbre.

Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous avons cherché à marquer les cellules multiciliées dans le pronephros tout en analysant la présence de cils après avoir modifié l'embryon. Commencez par fixer les embryons de poisson zèbre à 24 heures post-fécondation dans cinq millilitres de paraformaldéhyde à 4 % pendant deux à quatre heures à température ambiante sans agitation. Ensuite, lavez les embryons deux fois dans du PBS contenant 0,1 % de Tween 20 ou du PBST, puis effectuez un lavage avec cinq millilitres de méthanol à 100 %.

Ensuite, incuber les embryons dans cinq millilitres d'éthanol frais à 100 % pendant au moins 20 minutes à moins 20 degrés Celsius. Pour préparer les embryons en vue de l'hybridation, réhydrater les nouveau-nés dans cinq millilitres de méthanol à 50 % et de PBST pendant cinq minutes, puis dans cinq millilitres de méthanol à 30 % et de PBST pendant cinq minutes. Laver les embryons deux fois pendant cinq minutes chacun dans cinq millilitres de PBST et incuber les embryons dans cinq millilitres d'une solution de protéinase K et de PBST à un rapport de un sur 1 000 pendant deux minutes, immédiatement suivie de deux autres lavages dans cinq millilitres de PBST.

Fixer les embryons dans cinq millilitres de paraformaldéhyde à 4 % pendant au moins 20 minutes à température ambiante, puis effectuer deux lavages dans cinq millilitres de PBST 20. Pour faciliter les interactions entre les embryons et la solution d'hybridation, transférer les embryons dans cinq millilitres de PBST dans des tubes microcentrifugeuses plats verticaux placés dans un support microcentrifugeuse, puis laver les embryons deux fois pendant cinq minutes chacun dans 1,5 millilitre de solution d'hybridation. Après le deuxième lavage, incuber les embryons dans 1,5 millilitre de solution d'hybridation fraîche à 70 degrés Celsius dans un four d'hybridation pendant quatre à six heures.

Ensuite, remplacer la solution d'hybridation par 10 microlitres de la sonde ARN d'intérêt et 500 microlitres de solution d'hybridation pour une hybridation de la sonde durant la nuit à 70 degrés Celsius. Le lendemain matin, laver les embryons deux fois dans 1,5 millilitre de formamide à 50 % et de tampon SSC (salin-citrate de sodium) 2X, pendant 20 à 30 minutes par lavage à 70 degrés Celsius. Puis, laver les embryons une fois dans 1,5 millilitre de SSC 2X seul à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes, suivi de deux lavages dans 1,5 millilitre de SSC 0,2X à 70 degrés Celsius, pendant 20 à 30 minutes par lavage.

Après le deuxième lavage, remplacez le SSC 0,2X par 1,5 millilitre de réactif de blocage pour une incubation toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, remplacez le réactif de blocage par 0,2 millilitre d'anticorps anti-digoxine conjugué à la peroxydase de raifort dans le réactif de blocage, à un ratio de un sur 1 000, pour une incubation de trois heures à température ambiante, à l'abri de la lumière. Ensuite, lavez les embryons deux à quatre fois dans 1,5 millilitre de tampon à l'acide malique, pendant 10 à 15 minutes par lavage, puis effectuez une incubation toute la nuit à quatre degrés Celsius dans 1,5 millilitre de tampon frais à l'acide malique.

Le lendemain matin, remplacer le tampon acide malique par 1,5 millilitre de PBS et laver les embryons deux fois dans 1,5 millilitre de PBS pendant cinq minutes par lavage. Incuber les embryons dans 0,2 millilitre de solution fluorescente Si3 pendant 60 minutes, suivie de quatre lavages consécutifs de 10 minutes chacun dans 1,5 millilitre de concentrations croissantes de méthanol. Après la dernière incubation, incuber les embryons à température ambiante dans 1,5 millilitre de peroxyde d'hydrogène à 1 % dans du méthanol pendant 30 minutes.

Ensuite, laver les embryons pendant 10 minutes par lavage dans des solutions de méthanol descendantes de 1,5 millilitre, suivies de deux lavages de cinq minutes dans 1,5 millilitre de PBS. Ensuite, laver les embryons dans 1,5 millilitre d'eau doublement distillée pendant cinq minutes, suivis d'un lavage de sept minutes dans 1,5 millilitre d'acétone à moins 20 degrés Celsius. Laver les embryons dans un autre 1,5 millilitre d'eau doublement distillée pendant cinq minutes, puis effectuer un lavage de cinq minutes dans 1,5 millilitre de PBST avec 1 % DMSO ou PBDT.

Incuber les embryons à température ambiante dans 1,5 millilitre de PBDT avec 10 % de FBS sur un agitateur rotatif pendant deux heures. Ensuite, remplacer le PBDT et le FBS par 1,5 millilitre d'anticorps primaires pour une incubation nocturne à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, laver les embryons dans 1,5 millilitre de PBDT, de FBS et de chlorure de sodium 0,1 molaire pendant une minute sous agitation, suivie de cinq lavages de 30 minutes chacun sous agitation dans 1,5 millilitre de PBDT, de FBS et de chlorure de sodium.

Après le dernier lavage, laver les embryons une fois dans 1,5 millilitre de PBDT contenant uniquement du FBS pendant 30 minutes sous agitation, puis procéder à une incubation nocturne dans 200 microlitres des anticorps secondaires appropriés à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière. Le lendemain matin, laver rapidement les embryons deux fois dans 1,5 millilitre de PBDT, puis les incuber 15 minutes dans 1,5 millilitre de DAPI sur un agitateur. Ensuite, laver les embryons trois fois dans 1,5 millilitre de PBDT contenant du FBS et du chlorure de sodium, chaque lavage durant de 15 à 20 minutes, et conserver les embryons dans 1,5 millilitre de PBDT à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière ambiante.

Pour imager les reins de poisson zèbre, placer les embryons en position latérale sur des lames de verre dans environ 10 microlitres de PBDT. À l’aide d’une pince fine et d’un microscope stéréoscopique, presser délicatement le premier embryon derrière les yeux pour enlever la tête ainsi qu’une partie du vitellus. Ensuite, gratter doucement le reste du vitellus du corps de l’embryon.

Lors du retrait de la sphère de jaune d'œuf, faites attention à ne pas toucher l'extension du sac vitellin, car le tissu d'intérêt se déchire facilement et se trouve juste au-dessus de cette extension. Utilisez un tissu fin pour éliminer le jaune dissocié et le liquide excédentaire de la lame. Ensuite, ajoutez une goutte de milieu de montage à la queue restante et positionnez-la latéralement.

Aplatir la queue avec une lamelle et placer la préparation dans une boîte à diapositives couverte. Ensuite, utiliser l'objectif 60X d'un microscope confocal pour visualiser les cils rénaux sur les canaux de fluorescence appropriés. Sur les images représentatives suivantes d'un embryon de poisson zèbre coloré comme vient de l'être démontré, les cellules multiciliées peuvent être identifiées en fonction de la visualisation de la sonde ribonucléique antisense utilisée pour détecter l'expression du transcrit ODF3B, des corps basaux marqués par la tubuline gamétique et des cils marqués par la tubuline alpha acétylée.

En effet, à cet agrandissement du pronephros embryonnaire, on peut observer une cellule multiciliée portant des transcrits d'ODF3B, ainsi que de nombreux corps basaux et cils. La cellule monociliée adjacente se distingue par son phénotype à unique corps basal et cil unique. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser des embryons fraîchement fixés et de protéger les échantillons de la lumière ambiante dès l'ajout du premier anticorps.