Visualisation des cellules multiciliées dans le poisson-zèbre à travers un protocole combiné de toute monture Fluorescent In Situ hybridation et Immunofluorescence

L’objectif global de ce protocole est de marquer et de visualiser des cellules multiciliées du poisson-zèbre in situ. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, telles que : quels facteurs régulent les sulfates multiciliés dans le rein embryonnaire du poisson-zèbre ? Le principal avantage de cette technique est que les transcrits de protéines et d’ARN peuvent être marqués simultanément, ce qui est utile en l’absence d’anticorps spécifiques au poisson-zèbre.

Nous avons d’abord eu l’idée de cette méthode lorsque nous sommes allés marquer des cellules multiciliées dans le pronéphros tout en analysant la présence de cils après avoir apporté des modifications à l’embryon. Commencez par fixer les embryons de poisson-zèbre 24 heures après la fécondation dans cinq millilitres de paraformaldéhyde à 4 % pendant deux à quatre heures à température ambiante sans agitation. Ensuite, lavez les embryons deux fois dans du PBS avec 0,1 % de Tween 20 ou du PBST, puis un lavage avec cinq millilitres de 100 % de méthanol.

Ensuite, incubez les embryons dans cinq millilitres d’éthanol frais à 100 % pendant au moins 20 minutes à moins 20 degrés Celsius. Pour préparer les embryons à l’hybridation, réhydratez les nouveau-nés dans cinq millilitres de méthanol à 50 % et de PBST pendant cinq minutes, puis pendant cinq minutes dans cinq millilitres de méthanol à 30 % et de PBST. Lavez les embryons deux fois pendant cinq minutes chacun dans cinq millilitres de PBST et incubez les embryons dans cinq millilitres d’une solution de protéinase K et de PBST d’un à 1 000 pendant deux minutes immédiatement suivies de deux autres lavages dans cinq millilitres de PBST.

Fixez les embryons dans cinq millilitres de paraformaldéhyde à 4 % pendant au moins 20 minutes à température ambiante, suivis de deux lavages dans cinq millilitres de PBST 20. Pour faciliter les interactions entre les embryons et la solution d’hybridation, transférez les embryons dans cinq millilitres de PBST dans des microtubes de centrifugation verticaux à fond plat dans un support de micro-centrifugeuse et lavez les embryons deux fois pendant cinq minutes chacun dans 1,5 millilitre de solution d’hybridation. Après le deuxième lavage, incubez les embryons dans 1,5 millilitre de solution d’hybridation fraîche à 70 degrés Celsius dans un four d’hybridation pendant quatre à six heures.

Ensuite, remplacez la solution d’hybridation par 10 microlitres de sonde d’ARN d’intérêt et 500 microlitres de solution d’hybridation pour une hybridation de sonde de nuit à 70 degrés Celsius. Le lendemain matin, lavez les embryons deux fois dans 1,5 millilitre de formamide à 50 % et un tampon de citrate salin-sodium 2X ou SSC pendant 20 à 30 minutes par lavage à 70 degrés Celsius. Ensuite, lavez les embryons une fois dans 1,5 millilitre de 2X SSC seul à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes, suivi de deux lavages dans 1,5 millilitre de 0,2X SSC à 70 degrés Celsius pendant 20 à 30 minutes par lavage.

Après le deuxième lavage, remplacez le SSC 0,2X par 1,5 millilitre de réactif de blocage pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, remplacez le réactif bloquant par 0,2 millilitre d’anti-digoxine dans la peroxydase de raifort et le réactif bloquant dans un rapport de un à 1 000 pour une incubation de trois heures à température ambiante à l’abri de la lumière. Ensuite, lavez les embryons deux à quatre fois dans 1,5 millilitre de tampon d’acide malique pendant 10 à 15 minutes par lavage, suivi d’une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius dans 1,5 millilitre de tampon d’acide malique frais.

Le lendemain matin, remplacez le tampon d’acide malique par 1,5 millilitre de PBS et lavez les embryons deux fois dans 1,5 millilitre de PBS pendant cinq minutes par lavage. Incuber les embryons dans 0,2 millilitre de solution fluorescente Si3 pendant 60 minutes, suivi de quatre lavages consécutifs de 10 minutes dans 1,5 millilitre de concentrations croissantes de méthanol. Après la dernière incubation, incubez les embryons à température ambiante dans 1,5 millilitre de peroxyde d’hydrogène à 1 % et de méthanol pendant 30 minutes.

Ensuite, lavez les embryons pendant 10 minutes par lavage dans des solutions de méthanol descendantes de 1,5 millilitre, suivi de deux lavages de cinq minutes dans 1,5 millilitre de PBS. Ensuite, lavez les embryons dans 1,5 millilitre d’eau doublement distillée pendant cinq minutes, suivi d’un lavage de sept minutes dans 1,5 millilitre d’acétone de moins 20 degrés Celsius. Lavez les embryons dans 1,5 millilitre d’eau double distillée pendant cinq minutes, puis dans 1,5 millilitre de PBST avec 1 % de DMSO ou de PBDT.

Incuber les embryons à température ambiante dans 1,5 millilitres de PBDT avec 10 % FBS sur une bascule pendant deux heures. Ensuite, remplacez le PBDT et le FBS par 1,5 millilitre d’anticorps primaires pour une incubation d’une nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, lavez les embryons dans 1,5 millilitre de PBDT, FBS et 0,1 molaire de chlorure de sodium pendant une minute avec basculement, suivi de cinq lavages à bascule de 30 minutes dans 1,5 millilitre de PBDT, FBS et chlorure de sodium.

Après le dernier lavage, lavez les embryons une fois dans 1,5 millilitre de PBDT et FBS seulement pendant 30 minutes avec basculement suivi d’une incubation d’une nuit dans 200 microlitres des anticorps secondaires appropriés à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière. Le lendemain matin, lavez rapidement les embryons deux fois dans 1,5 millilitre de PBDT, suivis d’une incubation de 15 minutes dans 1,5 millilitre de DAPI sur un transat. Ensuite, lavez les embryons trois fois dans 1,5 millilitre de PBDT avec FBS et chlorure de sodium pendant 15 à 20 minutes par lavage et conservez les embryons dans 1,5 millilitre de PBDT à quatre degrés Celsius à l’abri de la lumière ambiante.

Pour imager les reins du poisson-zèbre, posez les embryons latéralement sur des lames de verre dans environ 10 microlitres de PBDT. À l’aide d’une paire de pinces fines et d’un microscope à dissection, pressez le premier embryon derrière les yeux pour retirer la tête et une partie de la boule vitelline. Ensuite, grattez doucement la boule jaune restante du corps de l’embryon.

Lors du retrait de la boule vitelline, veillez à ne pas toucher l’extension du sac vitellin car le tissu d’intérêt se déchire facilement et se trouve directement au-dessus de l’extension. Utilisez un mouchoir fin pour retirer le jaune dissocié et le liquide supplémentaire de la lame. Ensuite, ajoutez une goutte de support de montage à la queue restante et positionnez la queue latéralement.

Aplatissez la queue à l’aide d’une lamelle et placez la glissière dans une boîte à glissière couverte. Ensuite, utilisez l’objectif 60X d’un microscope confocal pour imager les cils du rein sur les canaux fluorescents appropriés. Dans les images représentatives suivantes d’un embryon de poisson-zèbre coloré comme nous venons de le démontrer, des cellules multiciliées peuvent être identifiées sur la base de la visualisation du riboprobe antisens utilisé pour reconnaître l’expression du transcrit ODF3B, des corps basaux marqués par la tubuline gamète et des cils marqués par la tubuline alpha acétylée.

En effet, à cette amplification du pronéphros embryonnaire, on peut observer une cellule multiciliée avec des transcrits ODF3B, de multiples corps basaux et cils. La cellule monociliée adjacente se distingue par son corps basal unique et son phénotype de cil unique. Lors de cette procédure, il est important de ne pas oublier d’utiliser des embryons fraîchement fixés et de protéger les échantillons de la lumière ambiante après l’ajout du premier anticorps.