Name: Visualisation des cellules multiciliées dans le poisson-zèbre à travers un protocole combiné de toute monture Fluorescent In Situ hybridation et Immunofluorescence (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-18T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Découvrez une méthode de marquage simultané des protéines et ARN pour visualiser les cellules multiciliées dans le rein embryonnaire du poisson-zèbre Danio rerio. Cette technique permet d'étudier le développement des cils en biologie du développement.

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Ce travail a été soutenu en partie par la subvention R01DK100237 à RAW et la National Science Foundation Graduate Research Fellowship no DGE-1313583 à A.N.M. Nous remercions également le Collège de Science Summer Undergraduate Research Fellowship Program pour soutien à M.U. Nous tenons à remercier le Centre pour la recherche de poisson-zèbre à l’Université de Notre Dame pour leurs soins dévoués de notre poisson-zèbre. Nous tenons également à remercier le département des Sciences biologiques ainsi que les membres de notre laboratoire pour l’ensemble de leur soutien et leur compréhension valable.

Le protocole suivant utilise des poissons zèbres adultes maintenus et pris en charge par le Centre pour la recherche de poisson-zèbre à l’Université de Notre Dame. Toutes les méthodes pour travailler avec des embryons et des poissons zèbres adultes ont été approuvées par le Comité de l’emploi et d’institutionnels animalier.
1. Fixation de l’embryon
<ol><li>Recueillir des embryons de poisson-zèbre à l’aide des méthodes décrites précédemment39,40. À 24 hpf, ajouter 500 µL de solution de mélange de protéase non spécifique (50 mg/mL) à l’E3 dans un embryon plat incuber à température ambiante (RT).</li>
	<li>Une fois les embryons commencent à sortir du chorion, évacuer tout le liquide de la capsule de l’embryon.</li>
	<li>Lavez les embryons 2 - 3 fois avec frais E3 en ajoutant environ 20 mL d’E3, agitant doucement l’E3 dans le plat et puis transvaser le liquide dans un réceptacle de déchets liquid.</li>
	<li>Pour euthanasier les embryons avant fixation, ajouter 2 mL de tricaïne 0,2 % pour l’E3.</li>
	<li>Transférer les embryons dans un flacon en verre de 5 mL à l’aide d’une pipette Pasteur de plastique. Enlever la plus grande partie de la solution de tricaïne/E3 à l’aide de la pipette, après que les embryons sont sont installés au fond du flacon.</li>
	<li>Difficulté 24 embryons hpf avec 5 mL de paraformaldéhyde à 4 % (PFA) pour 2-4 h à ta, sans agitation. ATTENTION : PFA est toxique et des solutions PFA doivent être manipulées sous une hotte chimique, tandis que le chercheur porte des lunettes de protection, des gants et une blouse de laboratoire. Préparation du fixateur PFA de la poudre PFA granulé doit être effectuée avec des soins exceptionnels, comme la PFA granulé tend à se disperser dans une charge statique. Remarque : Les embryons peuvent fixer dans 4 % PFA pour la nuit à 4 ° C. Préparer 4 % PFA en chauffant 1 x tamponné phosphate salin (PBS) à ébullition en remuant sans cesse la solution pour dissoudre complètement la PFA granulé. Une fois que la solution est refroidie vers le bas à RT, les 4 % PFA est filtre stérilisé en le faisant passer à travers un système jetable de 0,45 µm pour filtration sous vide, puis et aliquotés en portions de 15 mL ou 50 mL pour le stockage à-20 ° C.</li>
	<li>Enlevez les 4 % PFA et embryons de laver deux fois avec 1 tamponné de phosphate X saline avec 0,1 % Tween-20 (PBST) à température ambiante. Lavez les embryons une fois avec 5 mL de méthanol (MeOH) à 100 % à RT. Ajouter 5 mL de frais 100 % MeOH pour les embryons et incuber à-20 ° C pendant au moins 20 min. Remarque : Les embryons peuvent être stockés dans 100 % MeOH à-20 ° C jusqu’au moment de la préparation de l’embryon.</li>
</ol>2. hybridation et préparation de l’embryon
<ol><li>Réhydrater les embryons par un lavage une fois dans 5 mL de 50 % MeOH dans 1 x PBST pendant 5 min à continuer RT. réhydratation en lavant les embryons dans 5 mL de 30 % MeOH dans 1 x PBST pendant 5 min à température ambiante. Lavez les embryons dans 5 mL de 1 x PBST deux fois pour 5 min chacun, à RT.</li>
	<li>Permeabilize les embryons en incubant eux dans 5 mL d’une solution de 1 : 1 000 protéinase K (pK) (10 mg/mL) à 1 x PBST pendant 2 min à température ambiante. Remarque : Les embryons âgés peuvent être incubés plus longtemps que 2 min de la concentration de pK indiquée ci-dessus, mais une concentration de 5 mg/mL et incubation temps moins de 2 min est suggérée pour les embryons âgés de moins de 24 hpf.</li>
	<li>Enlever la solution de pK et laver immédiatement en 5 mL 1 x PBST deux fois à température ambiante. fixer les embryons dans 5 mL de 4 % PFA à ta pendant au moins 20 min. Remarque : Les embryons peuvent fixer dans 4 % PFA pour la nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Supprimer les PFA et laver deux fois dans 5 mL de 1 x PBST à température ambiante.</li>
	<li>Transfert des embryons dans 5 mL de 1 x PBST dans des tubes de microcentrifuge de fond plat placé debout dans un panier de microcentrifuge RT pour faciliter les interactions entre chaque embryon et la solution d’hybridation ultérieure.</li>
	<li>Lavez les embryons deux fois en 1,5 mL de solution d’hybridation (Hyb +) à RT. Ajouter 1,5 mL de frais Hyb + et incuber les embryons à 70 ° C dans un four à hybridation pour 4 à 6 h.</li>
	<li>Remplacer les 1,5 mL de Hyb + avec un volume de solution de sonde (10 µL RNA sonde/500 µL Hyb +) suffisant pour couvrir entièrement les embryons. Remarque : Une synthèse antisens sonde ARN utilisant précédemment décrit des méthodes39.</li>
	<li>Hybrider la sonde pendant la nuit dans le four de l’hybridation à 70 ° C avec le poteau de tubes individuels placés dans le panier de microcentrifuge, sans agitation.</li>
</ol>3 chaudes lavages et blocage
NOTE : Hot lavages sont effectuées en mettant la solution appropriée sur les embryons et puis incubation dans le four de l’hybridation à 70 ° C. Pour conserver les solutions de lavage à 70 ° C, placer les tubes de 50 mL de chaque solution dans le four à hybridation lorsque la sonde / Hyb + mélange est ajouté.
<ol><li>Retirer la sonde. Lavez les embryons deux fois à 70 ° C à 1,5 mL de 50 % formamide/2 x tampon citrate de solution saline-sodium (SSC) pendant 20-30 min chaque. Remarque : La sonde peut être stockée dans Hyb + à-20 ° C et ré-utilisée à une date ultérieure.</li>
	<li>Laver une fois les embryons à 70 ° C à 1,5 mL de 2 x SSC pendant 15 min. Lavez les embryons deux fois à 70 ° C à 1,5 mL de 0,2 X SSC de 20-30 min chacun. X SSC remplacer 0,2 à 1,5 mL de réactif de blocage et incuber une nuit à 4 ° C. Remarque : Il est possible d’incuber blocage réactif à ta pendant 4 h au lieu de la nuit.</li>
</ol>4. anticorps d’Incubation et de lavages de tampon acide maléique
NOTE : Garder les embryons abri de la lumière ambiante.
<ol><li>Remplacer le réactif de blocage avec 0,2 mL d’anti-DIG-POD en bloquant réactif à un ratio de 1 : 1 000 et incuber pendant 3 heures sous une feuille ou d’une autre couverture occultants à température ambiante. Remarque : Par ailleurs, les anticorps peuvent incuber pendant la nuit à 4 ° C.</li>
	<li>Après 3 h, lavez les embryons dans 1,5 mL de tampon de l’acide maléique 2 - 4 fois pour 10-15 min chacun, à RT. Incuber les embryons pendant la nuit à 4 ° C à 1,5 mL de tampon de l’acide maléique fraîches. Remarque : Il n’est pas nécessaire d’incuber pendant la nuit dans le tampon de l’acide maléique, mais cela diminue donc fond de sonde.</li>
</ol>5. sonde de détection et la suppression de la peroxydase
NOTE : Garder les embryons abri de la lumière ambiante.
<ol><li>Retirer le tampon de l’acide maléique et remplacez par 1,5 mL de PBS 1 x. Lavez les embryons deux fois dans 1,5 mL de PBS 1 x de 5 min chacun à RT. Incuber les embryons dans 0,2 mL de Cy3 fluorescent coloration solution pendant 60 min à température ambiante. Remarque : Le temps d’Incubation peut varier pour différentes sondes.</li>
	<li>Lavez les embryons avec 1,5 mL de la MeOH pourcentage suivant en 1 X PBS pendant 10 min à RT : 30 % MeOH, 50 % MeOH, 75 % MeOH et 100 % MeOH.</li>
	<li>Incuber les embryons avec 1,5 mL de 1 % H2O2 dans MeOH pendant 30 min à RT. Wash les embryons avec 1,5 mL de MeOH solutions suivantes dans du PBS 1 x pendant 10 min à RT : 75 % MeOH, 50 % MeOH et 30 % MeOH. Lavez les embryons deux fois plus de 5 min chacun à ta dans 1,5 mL de PBS 1 x. Remarque : Les embryons peuvent être stockés dans du PBS pendant la nuit à 4° C.</li>
</ol>6. immunofluorescence
NOTE : Garder les embryons abri de la lumière ambiante.
<ol><li>Lavez les embryons dans 1,5 mL de ddH2O pendant 5 min à RT. Wash les embryons dans 1,5 mL d’acétone préalablement réfrigérée (conservé à-20 ° C) à 7 min à température ambiante. Wash les embryons une fois dans 1,5 mL de ddH2O pendant 5 min à RT. Wash les embryons une fois à 1.5 mL de 1 x PBST avec 1 % de DMSO (PBDT) pendant 5 min à température ambiante.</li>
	<li>Incuber les embryons dans 1,5 mL de PBDT + 10 % sérum fœtal (SVF) sur un rocker à ta pendant 2 h.</li>
	<li>Supprimer PBDT + FBS et remplacer avec 1,5 mL d’anticorps primaires, tubuline anti-acétylé (produit à partir de souris) et anti-γ-tubuline (issus de lapin), dilué ensemble à 1 : 400 PBDT + 1 % FBS. Incuber les embryons pendant une nuit à 4 ° C. Remarque : Le temps d’Incubation peuvent varier selon l’anticorps primaire. Essais de différents intervalles de temps peuvent être nécessaires pour optimiser l’étiquetage.</li>
</ol>7. secondaires anticorps
NOTE : Garder les embryons abri de la lumière ambiante.
<ol><li>Pour éliminer les anticorps non lié excès des embryons, laver dans 1,5 mL de PBDT + 1 % FBS + 0,1 M NaCl, pendant 1 min à ta sur un rocker.</li>
	<li>Lavez les embryons 5 fois dans 1,5 mL de PBDT + 1 % FBS + 0.1 M de NaCl de 30 min chacun sur un rocker à température ambiante. Lavez les embryons dans 1,5 mL de PBDT + 1 % FBS pendant 30 min à ta sur un rocker.</li>
	<li>Incuber les embryons pendant la nuit à 4 ° C à 200 µL de l’anticorps secondaires, Alexa 488 chèvre anti-souris IgG et Alexa 647 chèvre anti-lapin IgG, dilué ensemble dans PBDT au 1/500.</li>
</ol>8. la coloration DAPI
NOTE : Garder les embryons abri de la lumière ambiante.
<ol><li>Lavez les embryons rapidement à ta dans 1,5 mL de PBDT deux fois. Remplacer les PBDT avec 1,5 mL de DAPI, dilué 1:15000 dans 1 X PBST et incuber 15 min à ta sur un rocker.</li>
	<li>Lavez les embryons dans 1,5 mL de PDBT + 1 % FBS + 0,1 M NaCl trois fois à ta pendant 15-20 min chaque. Conservation des embryons en 1,5 mL de PBDT à 4 ° C jusqu’au moment de monter et de l’image.</li>
</ol>9. montage et d’imagerie pour le poisson-zèbre pronéphros
<ol><li>Embryon laïcs latérale sur la lame de verre dans un petit volume, environ 10 µL, de PBDT.</li>
	<li>Presser l’embryon derrière les yeux avec une paire de pinces fines pour retirer la tête et certains de la balle jaune.</li>
	<li>Utilisez la pince fine pour gratter doucement la boule jaune d’oeuf restant du corps de l’embryon. Retirez le jaune dissocié et le liquide supplémentaire de la diapositive avec un tissu mince.</li>
	<li>Ajouter une goutte de montage multimédia à la queue restante de l’embryon et placer pour que la queue est disposée latéralement. Placez un lamelle couvre-objet sur le dessus de la queue pour aplatir l’échantillon, puis placer dans une boîte couverte de diapositive.</li>
	<li>Cils de rein au grossissement 60 X sur un microscope confocal, via les canaux suivants d’image : DAPI en bleu (laser ensemble à 408.0 nm), FITC en vert (laser ensemble à 488,0 nm), Cy3 marqués au colorant en rouge (laser ensemble à 561.0 nm) et Alexa 680 en blanc (laser ensemble à 637,0 nm).</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Le protocole décrit ci-dessus est optimisé pour marquage CCM dans le pronéphros avec transcriptions odf3b et α-tubuline dans des embryons de poisson-zèbre 24 hpf. Pour de meilleurs résultats, il est recommandé d’utiliser des embryons fraîchement fixes et préparés. Les embryons qui ont été fixés et stockés dans MeOH ou Hyb + à-20 ° C pendant plus d’une semaine peuvent être utilisés, mais la probabilité de fond indésirables augmente avec le temps que les embryons sont conservés dans le stockage de coloration.
Modifications et dépannage de cette technique sont nécessaires pour adapter cette méthode pour les autres suites de marqueurs particulières, par exemple les autres anticorps et autres cavitation antisense. Plusieurs méthodes permettant d’ajuster les paramètres des étapes du processus d’hybridation, support entier in situ ont été documentés précédemment par notre groupe et d’autres31,34,36,38, 39. De même, chaque protéine anticorps nécessitera quelques dépannage en termes de temps de coloration et gammes approximatives de dilutions et temps d’incubation pour chaque anticorps primaire sont mieux estimés par évaluation des résultats documentés28, 35. pour les embryons âgés de moins de 24 hpf, pK traitement devrait être inférieur à 2 min, où des embryons plus vieux que 24 hpf devrait être traitées avec pK pendant plus de 2 min. En outre, des embryons plus vieux que 24 hpf devrait être blanchi de pigment avant traitement pK.
Après coloration avec la solution de coloration fluorescente, il est essentiel d’enlever toute tache, anticorps et peroxydases restants en accomplissant la série de lavages de méthanol et d’eau oxygénée. Les lavages de PBS immédiatement après sont vitales pour enlever l’excès de méthanol des embryons. Ce qui est important, avant de poursuivre avec les anticorps de l’IF, nous avons trouvé que l’acétone et eau déionisée lavages faire les embryons moins susceptibles d’adhérer à un autre et/ou les tubes à centrifuger. Dans notre expérience, les anticorps pour les facteurs de transcription spécifiques et d’autres gènes, bien qu’ils peuvent travailler efficacement taches occidentales, ne fonctionnent pas bien, car si dans le poisson-zèbre. Toutefois, des protéines hautement conservées et abondantes, comme la tubuline α et β-caténine, fonctionnent bien dans le poisson-zèbre pour IF16,37.
Avec du poisson, il est possible de visualiser des ARN transcrits des gènes qui n’ont pas encore d’anticorps spécifiques dans le poisson-zèbre. En combinant les poissons avec IF, comme en témoigne le présent protocole, co-localisation des transcriptions d’ARN et de protéine peut être vu en vivo (Figure 2). La souplesse du protocole permet un dépannage rapide pour la visualisation de diverses transcriptions d’ARN et de protéines dans de nombreux tissus et points dans le temps. Lorsqu’il est combiné avec les traits déjà respectés des embryons de poisson-zèbre, ce protocole de poisson + si fournit un autre outil pour étudier l’expression des gènes et des protéines importantes du règlement de la voie du développement.

Depuis les dernières décennies, le poisson zèbre (Danio rerio) est devenu un organisme modèle privilégié pour étudier la biologie du développement. Les embryons se développent en dehors de la mère et sont optiquement transparents. En outre, la formation des organes vitaux tels que le œil, des reins et du cerveau se produit rapidement, avec des structures formées par seulement 24 heures après la fécondation (hpf). Ce qui est important, le génome du poisson-zèbre est très conservé avec mammifères1,2,3. En outre, poisson-zèbre et organes de mammifères ont similaires l’anatomie et la physiologie. Le poisson-zèbre rein embryonnaire ou pronéphros, démontre la valeur du système modèle pour étudier la fonction du gène pendant néphrogénèse précoce et de la détermination du sort des populations de cellules épithéliales conservée du néphron vertébrés4, 5 , 6 , 7 , 8 , 9 , 10. de même, l’embryon de poisson zèbre est devenu de plus en plus important dans l’examen de l’ontogénie du MCCs11,12,13,14,15, 16 , 17.
Comme leur nom l’indique, le CCM est des cellules épithéliales, caractérisés par un faisceau de cils mobiles situées sur la surface apicale17. Dans le poisson-zèbre, MCCs fonctionnent dans les écoulements de fluides et sont dispersées dans un « poivre » comme la mode dans le milieu de chaque néphron du pronéphros par 24 hpf11,12,13,14, 15 , 16 , 17. bien qu’ils n’ont été notés dans une poignée de rein humain maladie cas18,19,20,21, CCM est fréquents dans les autres tissus comme le cerveau des mammifères et trachée22,23,24, qui pose une multitude de défis pour la conception expérimentale. Des études élégants dans divers modèles vertébrés, y compris le poisson-zèbre ont démontré une voie conservée du destin MCC, avec l’encoche voie de signalisation comme inhibiteur de la MCC développement12,17,25 ,26,27. Par conséquent, le poisson-zèbre pronéphros fournit un modèle facilement accessible afin d’étudier les mécanismes génétiques de MCC development in vivo11,12,13,14, 15 , 16 , 17.
Transparence tant facile manipulation génétique des embryons de poissons zèbres se sont avérés pour être des traits précieux lorsque l'on étudie les voies génétiques et moléculaires qui régulent le sort de la cellule, la croissance des tissus et le développement de l' embryon précoce1,2 ,3. Comme telles, techniques traditionnelles pour visualiser les transcriptions de protéines et de gènes, tels que l’hybridation in situ et toute monture si, ont été appliqués aux et optimisé pour le poisson-zèbre16,28,29, 30,31,32,33,34,35,36,37,38. En combinant les protocoles populaires pour les poissons et si, il est possible d’étiqueter et d’analyser les CCM en vivo28,16,37,38.

<table><tbody><tr><td>solution de mélange de protéase non spécifique</td><td>Roche</td><td>11459643001, pronase de Streptomyces griseus</td><td>Diluer dans E3 <fort>sans</fort> bleu de méthylène pour obtenir une solution mère de 50mg/mL ; conserver à -20&deg ; Solution</td></tr><tr><td></td><td></td> C<td>E3</td><td>Diluer 50X E3 (250 mM NaCl, 8,5 mM KCl, 16,5 mM CaCl2, 16,5 mM MgSO4 dans de l’eau distillée) dans de l’eau distillée ; ajouter 1 x 10-5 M de bleu de méthylène (sigma M9140) pour inhiber la contamination</td></tr><tr><td>tricaïne (méthanesulfonate d’éthyle3-aminobenzoate)</td><td>Fluka</td><td>A5040-250G</td><td>Pour obtenir une solution mère à 0,2 %, dissoudre 1 g de poudre de tricaïne dans 10 mL de Tris, pH 9,5 et eau distillée jusqu’à 500 mL</td></tr><tr><td>Boîtes pour embryons</td><td>VWR</td><td>351029</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Flacons en verre</td><td>Wheaton</td><td>225012</td><td></td></tr><tr><td>jetables Pasteur Pippettes</td><td>VWR</td><td>414004-004</td><td></td></tr><tr><td>Solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 %</td><td>Services de microscopie électronique</td><td>19210</td><td>Dissoudre 4 % de PFA dans 1X PBS et porter à ébullition sous une hotte. Refroidir et aliquoter, puis conserver à -20&deg ;C. Ne pas recongeler une fois décongelé pour être utilisé.</td></tr><tr><td>10X PBS</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB11072</td><td>Diluer dans de l’eau distillée pour faire un stock 1X</td></tr><tr><td>Tween-20 American</td><td>Bioanalytical</td><td>AB02038</td><td>Fabriquer un stock Tween-20 à 0,1 % en diluant dans de l’eau distillée.</td></tr><tr><td>1X solution saline tamponnée au phosphate avec 0,1 % de Tween 20 (PBST)</td><td>Sigma</td><td>P9416</td><td>0,1 % Tween-20 dans 1X méthanol PBS</td></tr><tr><td>(MeOH)</td><td>Sigma</td><td>34860-4L</td><td></td></tr><tr><td>protéinase K</td><td>Roche</td><td>3115879001</td><td>Dissoudre dans de l’eau distillée pour obtenir un stock de 10 mg/mL ; aliquote et stocker à -20&deg ; C</td></tr><tr><td>tubes de microcentrifugation à fond plat</td><td>VWR</td><td>87003-300 ; 87003-298</td><td></td></tr><tr><td>formamide</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00600</td><td>stocker à -20&deg ; </td></tr><tr><td>Solution d’hybridation C (HYB+)</td><td></td><td></td><td>50 % formamide, 5X SSC, 0,1 % Tween-20, 5 mg/mL d’ARN de torula de levure, 50 &mu ; g/&mu ; L héparine ; Stocker à -20&deg ; </td></tr><tr><td>Four d’hybridation</td> C <td>Fisher Scientific</td><td>13-247-10Q</td><td></td></tr><tr><td>20X solution tampon de citrate salin-sodium (SSC) American</td><td>Bioanalytical</td><td>AB13156</td><td>diluer dans de l’eau distillée pour faire des stocks 2X et 0,2X</td></tr> solution de <tr><td>réactif bloquant</td><td>Roche</td><td>11096176001</td><td>diluer dans un tampon d’acide maléique pour obtenir une solution mère à 10 %; conserver à 4&deg ; </td></tr><tr><td>C solution tampon d’acide maléique</td><td>Sigma</td><td>M0375 et S7653</td><td>150mM d’acide maléique, 100mM de NaCl (pH 7,5)</td></tr><tr><td>anti-Digoxigénine-POD, Fab fragments</td><td>Roche</td><td>11207739910</td><td>stocker à 4&deg ; </td></tr><tr><td>Solution de coloration fluorescente C Cy3</td><td>PerkinElmer, Inc.</td><td>NEL744001KT, le système TSA Plus Cyanin3</td><td>à 4&deg ; C; préparer la solution de coloration fraîche en faisant une dilution de 1:50 du réactif TSA (dissous dans 60 μL de DMSO) dans le tampon du kit</td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène (H2O2)</td><td>Sigma</td><td>H1009-500mL</td><td>stocker à 4&deg ; C</td></tr><tr><td>eau distillée de qualité moléculaire (ddH2O)</td><td>Mediatech</td><td>25-055-CM</td><td></td></tr><tr><td>acétone</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00636-01000</td><td>stocker une aliquote à -20&deg ; C</td></tr><tr><td>DMSO</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB00435-01000</td><td></td></tr><tr><td>sérum fœtal bovin (FBS)</td><td>Gibco</td><td>10438-034</td><td>aliquote et stockage à -20&deg ; C</td></tr><tr><td>monoclonal anti-acétylé tubuline clone 6-11B-1</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T6793</td><td>aliquote et stocker à -20&deg ; C</td></tr><tr><td>anti-&gamma ;-tubuline anitbody produit chez le lapin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5192</td><td>aliquote et stocké à -20&deg ; C</td></tr><tr><td>odf3b clone d’ADNc MGC :63985</td><td>OpenBiosystems</td><td>IMAGE :6792478</td><td>stocker le stock de glycérol bactérien à -80&deg ; C</td></tr><tr><td>NaCL</td><td>American Bioanalytical</td><td>AB01915-05000</td><td></td></tr><tr><td>Alexa farine 647 chèvre anti-lapin IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A21245</td><td>magasin à 4&deg ; C; protéger de la lumière</td></tr><tr><td>Alexa fluor 488 chèvre anti-souris IgG</td><td>Life Technologies</td><td>A11029</td><td>magasin à 4&deg ; C; protéger de la lumière</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Life Technologies</td><td>D1306</td><td>aliquote et stocker à -20&deg ; </td></tr><tr><td>Lame en verre</td> C <td>Thermo-Fisher</td><td>4445</td><td></td></tr><tr><td>lamelle en verre</td><td>Thermo-Fisher</td><td>12-540A</td><td>18 x 18 mm</td></tr><tr><td>pince fine</td><td>Roboz</td><td>RS-1050</td><td>Dumont Pince à épiler Motif #55</td></tr><tr><td>support de montage</td><td>Polysciences, Inc.</td><td>18606, magasin Aqua-Poly/Mount</td><td>à 4&deg ; </td></tr><tr><td>Microscope confocal C et logiciel</td><td></td><td></td> associé <td>Nous utilisons un microscope confocal Nikon C2plus avec le logiciel AR NIS-elements</td></tr><tr><td>Rocker</td><td>Bio-Rad</td><td>1660710EDU</td><td></td></tr></tbody></table>

visualisation des cellules multiciliées dans le poisson-zèbre à travers un protocole combiné de toute monture fluorescent in situ hybridation et immunofluorescence

Visualizing Multiciliated Cells in the Zebrafish Through a Combined Protocol of Whole Mount Fluorescent In Situ Hybridization and Immunofluorescence

Ces dernières années, l’embryon de poisson zèbre est devenue un modèle populaire pour étudier la biologie du développement en raison de caractéristiques telles que l’ex utero le développement de l’embryon et de la transparence optique. En particulier, l’embryon de poisson zèbre est devenu un organisme important d’étudier l’organogenèse rein vertébrés ainsi que le développement de cellules multiciliées (MCC). Pour visualiser les tableaux dans le rein de l’embryon de poisson zèbre, nous avons développé un protocole combiné de l’ensemble-mount fluorescent in situ hybridation (poisson) et monter ensemble immunofluorescence (IF) qui permet l’imagerie haute résolution. Ce manuscrit décrit notre technique pour localiser conjointement les transcriptions d’ARN et de protéine comme un outil pour mieux comprendre la réglementation des programmes de développement par le biais de l’expression des divers facteurs de la lignée.

Des embryons de poisson-zèbre sauvage ont été fixés à 24 hpf et immédiatement préparé comme indiqué ci-dessus. La figure 1 illustre un flux de travail expérimental ainsi que les étapes illustrées sélectionnées. Le flux de travail décrite aux étapes 1 à 8 englobe les processus d’approvisionnement de l’échantillon, la fixation et manipulation du tissu fixe d’étiqueter les transcriptions endogènes avec cavitation antisense suivie par immunofluorescence à étiquette protéines d’intérêt. Étape 9 dans le flux de travail désigne spécifiquement conçus pour optimiser la visualisation du poisson-zèbre tronc embryonnaire de techniques d’imagerie et le montage. Dans les dessins qui accompagnent l’étape 9, nous illustrons la méthode de manipulation permettant de positionner le tissu sur une lame de verre. Dans cette étape, la boule de tête et le jaune de œuf embryon sont retirés, laissant la queue pour être positionnés latéralement entre lame et lamelle. Enlèvement de la boule jaune d’oeuf et la tête est suggérée pour la meilleure image de la population résidente de la MCC dans le pronéphros, comme la boule jaune auto-fluorescente et entrave le processus de montage.
Les images représentatives obtenues à l’aide d’un microscope confocal figurent dans la Figure 2, qui montre le même embryon sauvage au grossissement 60 X et un zoom numérique au même grossissement. Les meilleurs panneaux fournissent des images de chaque canal individuellement, tandis que les deux panneaux de fond sont la superposition composite de ces données d’imagerie. La case blanche (à l’image de la colonne de gauche) décrit la zone qui est au cœur du zoom numérique (l’image de la colonne de droite). Mis en évidence dans la dernière case du zoom numérique, noyaux ont été marquées au DAPI et CCM ont été détectés, basé sur un ribosonde antisens conçu pour reconnaître les odf3b, où les anticorps anti-γ-tubuline désigne les corpuscules basaux et α-tubuline indique les cils. Dans le zoom numérique de l’incrustation en composite, le cercle en pointillés jaune indique le périmètre d’un MCC, qui a été identifié en raison de la possession des transcriptions de odf3b , plusieurs corpuscules basaux et cils. La cellule adjacente mono-ciliées, étiquetée avec un cercle en pointillé jaune, a été identifiée basées sur le phénotype de posséder un seul corps basal et un seul cil.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig1.jpg"> Figure 1 : schéma de diagramme expérimental. Cette organigramme montre un flux de travail expérimental, accompagnée d’illustrations des étapes critiques, au cours duquel le flocon indique incubation froide, les trois lignes courbes représentent la chaleur et l’horloge représente le temps d’incubation longue. Le flux de travail peut être effectuée dans un minimum de 6 jours (voir le numéro du jour dans le coin supérieur droit de chaque étape du processus), même si certaines mesures peuvent être effectuées sur de longues périodes de temps, tel qu’indiqué dans le protocole. Une description détaillée du processus de montage est dessinée, la queue de l’embryon montée finale entre la lame et lamelle. Une boîte noire pointillée indique la zone qui est imagée au grossissement 60 X. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56261/56261fig2.jpg"> Figure 2 : représentant les résultats de visualisation MCCs du pronéphros zebrafish. Projections de maximale de l’image d’un embryon de poisson zèbre sauvage hpf 24 à 60 X grossissement, mais aussi un zoom numérique sur la confocale à grossissement 60 X de la même embryon. Les cases blanches indiquent la région a été consacrée pour le zoom. Taches individuelles de DAPI (noyaux), odf3b (CCM), γ-tubuline (corpuscules basaux) et α-tubuline (cils) sont étiquetés et ensuite fusionnées dans les panneaux de fond deux. Dans le zoom numérique, nous fournissons des approximations de l’emplacement de la cellule comme suit : un tableau est délimité par le cercle en pointillés de jaune, et le cercle en pointillé jaune indique une cellule mono-ciliées. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56261/56261fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Développement de cils est vitale pour l’organogenèse appropriée. Ce protocole décrit une méthode optimisée pour étiqueter et de visualiser les cellules ciliées du poisson-zèbre.

Visualisation des cellules multiciliées dans le poisson-zèbre à travers un protocole combiné de toute monture Fluorescent In Situ hybridation et Immunofluorescence

In recent years, the zebrafish embryo has emerged as a popular model to study developmental biology due to traits such as ex utero embryo development and ...

L'objectif général de ce protocole est de marquer et de visualiser in situ les cellules multiciliées du poisson-zèbre. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie du développement, comme par exemple quels facteurs régulent les cellules multiciliées dans le rein embryonnaire du poisson-zèbre ? Le principal avantage de cette technique est que les protéines et les transcrits d'ARN peuvent être marqués simultanément, ce qui est utile en l'absence d'anticorps spécifiques au poisson-zèbre.Nous avons eu pour la première fois l'idée de cette méthode lorsque nous avons cherché à marquer les cellules multiciliées dans le pronephros tout en analysant la présence de cils après avoir modifié l'embryon. Commencez par fixer les embryons de poisson zèbre à 24 heures post-fécondation dans cinq millilitres de paraformaldéhyde à 4 % pendant deux à quatre heures à température ambiante sans agitation. Ensuite, lavez les embryons deux fois dans du PBS contenant 0,1 % de Tween 20 ou du PBST, puis effectuez un lavage avec cinq millilitres de méthanol à 100 %.Ensuite, incuber les embryons dans cinq millilitres d'éthanol frais à 100 % pendant au moins 20 minutes à moins 20 degrés Celsius. Pour préparer les embryons en vue de l'hybridation, réhydrater les nouveau-nés dans cinq millilitres de méthanol à 50 % et de PBST pendant cinq minutes, puis dans cinq millilitres de méthanol à 30 % et de PBST pendant cinq minutes. Laver les embryons deux fois pendant cinq minutes chacun dans cinq millilitres de PBST et incuber les embryons dans cinq millilitres d'une solution de protéinase K et de PBST à un rapport de un sur 1 000 pendant deux minutes, immédiatement suivie de deux autres lavages dans cinq millilitres de PBST.Fixer les embryons dans cinq millilitres de paraformaldéhyde à 4 % pendant au moins 20 minutes à température ambiante, puis effectuer deux lavages dans cinq millilitres de PBST 20. Pour faciliter les interactions entre les embryons et la solution d'hybridation, transférer les embryons dans cinq millilitres de PBST dans des tubes microcentrifugeuses plats verticaux placés dans un support microcentrifugeuse, puis laver les embryons deux fois pendant cinq minutes chacun dans 1,5 millilitre de solution d'hybridation. Après le deuxième lavage, incuber les embryons dans 1,5 millilitre de solution d'hybridation fraîche à 70 degrés Celsius dans un four d'hybridation pendant quatre à six heures.Ensuite, remplacer la solution d'hybridation par 10 microlitres de la sonde ARN d'intérêt et 500 microlitres de solution d'hybridation pour une hybridation de la sonde durant la nuit à 70 degrés Celsius. Le lendemain matin, laver les embryons deux fois dans 1,5 millilitre de formamide à 50 % et de tampon SSC (salin-citrate de sodium) 2X, pendant 20 à 30 minutes par lavage à 70 degrés Celsius. Puis, laver les embryons une fois dans 1,5 millilitre de SSC 2X seul à 70 degrés Celsius pendant 15 minutes, suivi de deux lavages dans 1,5 millilitre de SSC 0,2X à 70 degrés Celsius, pendant 20 à 30 minutes par lavage.Après le deuxième lavage, remplacez le SSC 0,2X par 1,5 millilitre de réactif de blocage pour une incubation toute la nuit à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, remplacez le réactif de blocage par 0,2 millilitre d'anticorps anti-digoxine conjugué à la peroxydase de raifort dans le réactif de blocage, à un ratio de un sur 1 000, pour une incubation de trois heures à température ambiante, à l'abri de la lumière. Ensuite, lavez les embryons deux à quatre fois dans 1,5 millilitre de tampon à l'acide malique, pendant 10 à 15 minutes par lavage, puis effectuez une incubation toute la nuit à quatre degrés Celsius dans 1,5 millilitre de tampon frais à l'acide malique.Le lendemain matin, remplacer le tampon acide malique par 1,5 millilitre de PBS et laver les embryons deux fois dans 1,5 millilitre de PBS pendant cinq minutes par lavage. Incuber les embryons dans 0,2 millilitre de solution fluorescente Si3 pendant 60 minutes, suivie de quatre lavages consécutifs de 10 minutes chacun dans 1,5 millilitre de concentrations croissantes de méthanol. Après la dernière incubation, incuber les embryons à température ambiante dans 1,5 millilitre de peroxyde d'hydrogène à 1 % dans du méthanol pendant 30 minutes.Ensuite, laver les embryons pendant 10 minutes par lavage dans des solutions de méthanol descendantes de 1,5 millilitre, suivies de deux lavages de cinq minutes dans 1,5 millilitre de PBS. Ensuite, laver les embryons dans 1,5 millilitre d'eau doublement distillée pendant cinq minutes, suivis d'un lavage de sept minutes dans 1,5 millilitre d'acétone à moins 20 degrés Celsius. Laver les embryons dans un autre 1,5 millilitre d'eau doublement distillée pendant cinq minutes, puis effectuer un lavage de cinq minutes dans 1,5 millilitre de PBST avec 1 % DMSO ou PBDT.Incuber les embryons à température ambiante dans 1,5 millilitre de PBDT avec 10 % de FBS sur un agitateur rotatif pendant deux heures. Ensuite, remplacer le PBDT et le FBS par 1,5 millilitre d'anticorps primaires pour une incubation nocturne à quatre degrés Celsius. Le lendemain matin, laver les embryons dans 1,5 millilitre de PBDT, de FBS et de chlorure de sodium 0,1 molaire pendant une minute sous agitation, suivie de cinq lavages de 30 minutes chacun sous agitation dans 1,5 millilitre de PBDT, de FBS et de chlorure de sodium.Après le dernier lavage, laver les embryons une fois dans 1,5 millilitre de PBDT contenant uniquement du FBS pendant 30 minutes sous agitation, puis procéder à une incubation nocturne dans 200 microlitres des anticorps secondaires appropriés à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière. Le lendemain matin, laver rapidement les embryons deux fois dans 1,5 millilitre de PBDT, puis les incuber 15 minutes dans 1,5 millilitre de DAPI sur un agitateur. Ensuite, laver les embryons trois fois dans 1,5 millilitre de PBDT contenant du FBS et du chlorure de sodium, chaque lavage durant de 15 à 20 minutes, et conserver les embryons dans 1,5 millilitre de PBDT à quatre degrés Celsius, à l’abri de la lumière ambiante.Pour imager les reins de poisson zèbre, placer les embryons en position latérale sur des lames de verre dans environ 10 microlitres de PBDT. À l’aide d’une pince fine et d’un microscope stéréoscopique, presser délicatement le premier embryon derrière les yeux pour enlever la tête ainsi qu’une partie du vitellus. Ensuite, gratter doucement le reste du vitellus du corps de l’embryon.Lors du retrait de la sphère de jaune d'œuf, faites attention à ne pas toucher l'extension du sac vitellin, car le tissu d'intérêt se déchire facilement et se trouve juste au-dessus de cette extension. Utilisez un tissu fin pour éliminer le jaune dissocié et le liquide excédentaire de la lame. Ensuite, ajoutez une goutte de milieu de montage à la queue restante et positionnez-la latéralement.Aplatir la queue avec une lamelle et placer la préparation dans une boîte à diapositives couverte. Ensuite, utiliser l'objectif 60X d'un microscope confocal pour visualiser les cils rénaux sur les canaux de fluorescence appropriés. Sur les images représentatives suivantes d'un embryon de poisson zèbre coloré comme vient de l'être démontré, les cellules multiciliées peuvent être identifiées en fonction de la visualisation de la sonde ribonucléique antisense utilisée pour détecter l'expression du transcrit ODF3B, des corps basaux marqués par la tubuline gamétique et des cils marqués par la tubuline alpha acétylée.En effet, à cet agrandissement du pronephros embryonnaire, on peut observer une cellule multiciliée portant des transcrits d'ODF3B, ainsi que de nombreux corps basaux et cils. La cellule monociliée adjacente se distingue par son phénotype à unique corps basal et cil unique. Lors de la réalisation de cette procédure, il est important de se rappeler d'utiliser des embryons fraîchement fixés et de protéger les échantillons de la lumière ambiante dès l'ajout du premier anticorps.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

Dans cette vidéo, nous démontrons une méthode permettant d'analyser le cerveau des vertébrés en développement dans embryons de poissons zèbres vivent à la résolution seule cellule par microscopie confocale. Cela inclut la méthode par laquelle nous injectons de l'embryon de poisson zèbre à cellule unique, puis monter et l'image du cerveau en développement.

En direct l&#39;imagerie du cerveau de poisson zèbre embryonnaires par microscopie confocale

Monter toute l'hybridation in situ est l'une des techniques les plus utilisées en biologie du développement. Ici, nous présentons une haute résolution double fluorescentes dans le protocole de l'hybridation in situ pour analyser le profil d'expression précise d'un seul gène et de déterminer le chevauchement des domaines d'expression de deux gènes. Nous incluons une iodure de propidium nucléaires contre-coloration pour mettre en évidence l'organisation tissulaire.

Zebrafish entier Mont haute résolution double fluorescent In Situ Hybridation

Ce protocole décrit l'imagerie des neurones individuels ou des cellules de la crête neurale dans la vie des embryons de poisson zèbre. Cette méthode est utilisée pour examiner les comportements cellulaires actine et la localisation utilisant la fluorescence confocale time-lapse microscopie.

Imagerie en temps réel de la motilité cellulaire et cytosquelette d&#39;actine des neurones individuels et de la crête neurale dans les embryons de poissons zèbres

La clé de la compréhension des processus morphogénétiques qui façonnent l'embryon précoce est la capacité de cellules d'image à haute résolution. Nous décrivons ici une technique de marquage des cellules individuelles ou de petits amas de cellules dans des embryons de zebrafish entier avec membrane cible protéine fluorescente verte.

L&#39;étiquetage et l&#39;imagerie des cellules dans le cerveau postérieur Zebrafish

Décrit ici est un protocole d'imagerie semi-automatisé de la fluorescence spécifique de tissu d'embryons de poisson zèbre.

Imagerie semi-automatique de la fluorescence spécifique de tissu dans embryons de poissons zèbres

L’imagerie du comportement dynamique des organites et d’autres structures subcellulaires in vivo peut faire la lumière sur leur fonction dans des conditions physiologiques et pathologiques. Ici, nous présentons des méthodes de marquage génétique de deux organites, les centrosomes et les mitochondries, et d’imagerie de leur dynamique dans des embryons de poisson-zèbre vivants à l’aide de la microscopie à grand champ et confocale.

Imagerie Structures subcellulaires dans le Embryo Living Zebrafish

Techniques sont décrites à immunocoloration phospho-épitopes dans embryons de poisson zèbre entiers et ensuite procéder à deux couleurs confocal fluorescent localisation dans des structures cellulaires aussi petites que les cils primaires. Les techniques de fixation et d'imagerie peuvent définir l'emplacement et de la cinétique de l'apparition ou de l'activation de protéines spécifiques.

Immunocoloration phospho-épitopes dans ciliées organes de Mont entiers embryons de poissons zèbres

Ce protocole démontre l'immunofluorescence séquentielle et l'immunohistochimie sur des cryosections des embryons de poisson zèbre de stade précoce permettant des analyses précises de colocalisation dans des populations cellulaires spécifiques.

Immunofluorescence séquentielle et immunohistochimie sur les embryons de poissons zèbres cryosectionnés

Ici, nous présentons un protocole pour la détection fluorescente des protéines par anticorps dans des préparations entières d'embryons et de larves de poissons zèbres.

Immunohistochimie du mont entier dans les embryons et larves de poissons-zèbres

Ce protocole décrit comment obtenir des images en combinant l’hybridation in situ et l’immunohistochimie de coupes embryonnaires de poisson-zèbre. L’hybridation in situ a été réalisée avant la cryosection, suivie d’une coloration des anticorps. Il est utile de détecter les schémas d’expression de deux gènes chez le poisson zèbre s’il y a une pénurie d’anticorps.

In situ Hybridation combinée à l’immunohistochimie dans des embryons de poisson-zèbre cryosectionnés

Découvrez une méthode de marquage simultané des protéines et ARN pour visualiser les cellules multiciliées dans le rein embryonnaire du poisson-zèbre Danio rerio. Cette technique permet d'étudier le développement des cils en biologie du développement.

Visualisation des cellules multiciliées dans le poisson-zèbre à travers un protocole combiné de toute monture Fluorescent In Situ hybridation et Immunofluorescence (Vidéo) | JoVE Journal

Visualisation des cellules multiciliées dans le poisson-zèbre à travers un protocole combiné de toute monture Fluorescent In Situ hybridation et Immunofluorescence

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