Name: Dissection et préparation de tranches coronales de développer la glande pituitaire souris (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-11-16T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 53 s
Description: Apprenez à disséquer la glande pituitaire de souris en développement et à préparer des coupes coronales préservant l'architecture tissulaire. Cette méthode permet d'étudier l'histologie et la différenciation cellulaire.

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Ce travail a été soutenu par les subventions de la Fondation de sciences naturelles nationales de la Chine (31201086, 31470759 et 31671219) et la Fondation des sciences naturelles de Shanghai (12ZR1436900).

souris C57BL/6 sont élevés dans des conditions spécifiques exempts de micro-organismes pathogènes. Toutes les méthodes expérimentales animales sont en conformité avec les directives approuvées par le Comité d’éthique à l’Université de médecine militaire de seconde et animalier.
 1. dissection de Postnatal développant hypophyse <ol><li>Perform anesthésie : placer la souris néonatales (P0 - P5) sur la glace pilée pour induire l’hypothermie. Pour les souris âgées de 5 jours, injecter 5 % uréthane (30 µL/g de poids corporel) par voie intrapéritonéale pour induire l’anesthésie. Évaluer les réponses pour queue/orteil pincées. Poursuivre uniquement après que la souris ne répond pas aux stimuli nocifs.</li>
	<li>Garantir la souris en décubitus dorsal (couché sur le dos, face vers le haut) en enregistrant doucement les pattes de devant et pattes sur une surface de travail qui peut être épinglé (c.-à-d., mousse de styrol) à l’intérieur d’une hotte chimique.</li>
	<li>Effectuer perfusion transcardial.
	<ol><li>Couper la cage thoracique de souris avec des ciseaux chirurgicaux pour exposer le cœur (et les autres organes thoraciques).</li>
		<li>Fixer le cœur battant avec une pince émoussée et insérer une aiguille 26G (0,45 mm) dans le ventricule gauche. L’aiguille est attachée à une seringue de 10 mL remplie avec du sérum physiologique hépariné tamponnée au phosphate (PBS ; additionné de nitrite de sodium 5 mg/mL et 10 U/mL héparine, pH 7,4, chauffé à 37 ° C avant utilisation). Immédiatement coupé l’oreillette droite avec des ciseaux fins et commencent à perfuse le corps avec du PBS chaud jusqu'à ce que le liquide sortant de l’oreillette droite est clair. 
		NOTE : Environ 5 à 10 mL de PBS est nécessaire pour les souris néonatales et 10-20 mL de PBS de souris adultes.</li>
		<li>Maintenir l’aiguille en place et mettre en place une autre seringue remplie de paraformaldéhyde à 4 % (PFA ; pH 7,4). Perfuse 10 mL et 20 mL de fixateur pour néonatale et P21 souris, respectivement. 
		ATTENTION : PFA est toxique. Il peut causer des irritations respiratoires et la peau et des lésions oculaires. Porter des gants et travailler sous une hotte chimique.</li>
	</ol></li> <li>Décapiter la souris PFA-correction et couper l’OS crânien ouvert avec des ciseaux.
	<ol><li>, Soulevez doucement le cerveau postérieur de la base du crâne avec une petite pince. Dès les premiers signes de la selle turcique, arrêt levage mais maintenez le cerveau postérieur, couper la tige pituitaire et les fibres nerveuses se connecter à la base du cerveau avec des ciseaux fins. Cette étape est essentielle pour s’assurer que l’hypophyse n’est pas levé de loin avec le cerveau.</li>
		<li>Puis garder le cerveau de levage et enlever tout le cerveau afin d’exposer l’hypophyse entièrement. Couper la région entière sella dont la glande pituitaire, les nerfs trijumeau latérales et le dessous sphénoïde avec des ciseaux (environ 3 x 5 mm 2).</li>
	</ol></li> <li>Mettre le tissu découpé dans un plat de 35 mm ou d’un puits d’une plaque de 6 puits contenant 2 mL froid 4 % PFA (pH 7,4). Fixer le tissu à 4 ° C pendant 40 min pour P0 - P7 hypophyses, 1 h pour P14 hypophyses, 1,5 h pour P21 - P28 hypophyses et 3 h pour adultes hypophyses.</li>
	<li>Dissociation plus d’hypophyse <ol><li>laver le tissu fixe avec 10 mL de PBS, 5 changements, 15 min chacun. L’hypophyse néonatale ainsi que ses tissus environnants et les sous sphénoïde peuvent être traitées directement à la déshydratation. Toutefois, des glandes pituitaires de souris plus de 5 jours doit être dissociés sous un microscope stéréo.</li>
		<li>Mettre le tissu fixe dans un plat de 35 mm contenant 1 mL de PBS. Pour P5 - P14 hypophyses, retirer les membranes conjonctives entre les nerfs et les os avec des ciseaux et des pinces fines et isoler soigneusement l’hypophyse ainsi que latérales nerfs trijumeau dans son ensemble, mais laissant la selle turcique. La glande isolée et les nerfs sont reliés par des membranes conjonctives avec une &#34; H &#34;-comme l’aspect ( Figure 1 b).</li>
		<li>Pour P21 et adulte hypophyses, enlever les nerfs et les membranes conjonctives autour de la glande pituitaire et libérer la glande les tissus environnants. Enroulez le tissu hypophysaire avec papier-tissu de nettoyage pour lentilles et mettez-la dans une cassette d’encastrement. 
		NOTE : Enveloppant l’hypophyse minuscule avec papier-tissu de nettoyage pour lentilles contribue à prévenir toute perte potentielle de spécimens et de préserver l’intégrité des tissus dans la procédure suivante d’enrobage de paraffine. Il n’est peut-être pas nécessaire d’envelopper l’hypophyse s’il est traité dans une petite bouteille dans la procédure cryo-embedding.</li>
	</ol></li></ol> 2. Paraffine Embedding et sectionnement <ol><li>déshydrater les spécimens en incorporant des cassettes avec des solutions d’éthanol 50 %, 65 %, 75 % et 95 % pour 15 min chacun. Par la suite déshydrater avec 3 changements d’éthanol pur, 3 min de chaque pour P0 - P4 glandes, 4 min de chaque pour P5 - P14 glandes et 5 min chacun pour P21 et glandes plus âgés. Clair avec xylène, 3 changements, 3 min de chaque pour P0 - P4 glandes, 4 min de chaque pour P5 - P14 glandes et à 5 min de chaque pour P21 et glandes plus âgés. Infiltrer avec cire de paraffine fondue, 3 changements, 7 min de chaque pour P0 - P4 glandes, et 8 min deux fois suivi par 6 min une fois pour P5 et glandes âgées. 
	Remarque : Les paramètres optimaux pour le traitement des tissus peuvent être ajustés empiriquement. Pour obtenir des Articles de haute qualité, déshydratation insuffisante ou plue devrait être évitée. Le même est vrai pour dégager le tissu à l’aide de xylène.</li>
	<li><ol><li>L' orientation lors de l’incorporation sur un tissu intégrant le système de la console, retirer l’échantillon de la cassette et le placer dans un moule à base remplie à moitié avec de la cire de paraffine fondue. L’orientation correcte de la glande pituitaire encastrement est essentielle pour satisfaire les sections coronales.</li>
		<li>Pour P21 et adulte hypophyses, positionner l’hypophyse avec son axe court perpendiculairement à la surface de fond d’un moule (le plan de section). Utilisez sphénoïde OS et nerfs trijumeau comme points de repère anatomiques pour P0 - P4 et P5 - P14 hypophyses, respectivement. Orienter les spécimens avec leurs nerfs trijumeau ou lame transversale des os sphénoïde perpendiculaires à la surface de fond d’un moule.</li>
		<li>Tenez délicatement le tissu dans la position désirée avec une pince fine chauffée jusqu'à ce que la cire devienne semi-solide sur une plaque de refroidissement. Remplir le moule avec la cire de paraffine fondue. Laissez le bloc de paraffine refroidir jusqu'à ce que la cire est complètement solidifiée. 
		Remarque : L’hypophyse à jour embryonnaire 18,5 (E18.5) peut être traitée de la même manière que l’hypophyse néonatale. Mais la glande pituitaire (Rathke &#39; pochettes s) âgés de moins de E16.5 devrait être intégrée avec la tête entière et orientée avec l’axe sagittal (de bouche à la protubérance occipitale) perpendiculaire à la surface de fond d’un moule.</li>
	</ol></li> <li>Refroidir le bloc de paraffine à-20 ° C pendant 10-20 min et puis le couper en fines tranches (4 µm d’épaisseur est préféré) avec un microtome. Pour obtenir des sections coronales satisfaisantes, affiner la position des blocs de paraffine pendant la découpe. Monter les tranches de tissus sur lames de verre enduit de polylysine pour éviter le détachement des tranches dans les procédures suivantes. 
	Remarque : Vous pouvez également spécimens peuvent être déshydratés dans 15 %, 30 % (P/V) des solutions de saccharose (dans du PBS) à 4 ° C jusqu'à ce qu’ils déposent au fond, incorporé dans l’enrobage cryo composé utilisant la même méthode d’orientation et rapidement gelé sur la glace sèche. Ensuite, couper les blocs de tissus congelés en tranches de 8 à 10 mm à l’aide d’un cryostat. La morphologie des cryo-sections, cependant, est souvent inférieure aux sections de paraffine.</li>
</ol> 3. H &#38; E coloration et Immunofluorescence Labeling <ol><li>chaude les diapositives sous une chaleur bloquent à 55 ° C et déparaffinage xylène, 2 changements, 4 min. Déshydrater les échantillons avec deux fois plus d’éthanol à 95 % et 75 % éthanol deux fois, 3 min chaque. Laver les lames avec l’eau distillée pendant 5 min sur un agitateur.</li>
	<li>Pour H &#38; E coloration, détachant les sections en solution l’hématoxyline alun pendant 6 min, rincer dans runnl’eau du robinet pendant 2 min, ING se différencient avec 0,2 % d’eau ammoniaque pour 45 s et re-rincer à l’eau courante pendant 2 min. Puis déshydrater les sections avec l’éthanol à 95 % pour 1 min et la tache avec de l’éosine à 2 min. séquentiellement déshydratent, effacer et Mont.</li>
	<li>En immunofluorescence labeling <ol><li>traite les sections avec du méthanol contenant 3 % H 2 O 2 et 0,01 % NaN 3 pendant 20 min à température ambiante pour inactiver les peroxydases endogènes. Récupérer les antigènes en faisant bouillir des sections dans le tampon d’extraction (EDTA 1 mM et 1 mM Tris-HCl, pH 7,4) dans un autocuiseur pendant 2 min. laisser incuber les sections avec un tampon de blocage (5 % de sérum de chèvre dans du PBS) pendant 30 min à 37 ° C.</li>
		<li>Incuber les sections avec des anticorps de lapin anti-croissance hormone (GH) (1:2, 000) ou des anticorps de lapin anti-gliales protéine fibrillaire acide (GFAP) (1:2, 000) diluées dans un tampon bloquant toute la nuit à 4 ° C.</li>
		<li>Incuber des sections avec l’anticorps secondaire (chèvre du anti-lapin IgG-HRP, 1 : 300 dans un tampon bloquant) pendant 35 min à 37 ° C.</li>
		<li>Amplifier les signaux à l’aide de Biotinyl Tyramide (01:50 dans une solution saline tamponnée de Tris contenant 0,3 % H 2 O 2) pendant 15 min à température ambiante et de visualiser avec la Streptavidine-Alexa594 ou 488 (1 : 300 dans le blocage de tampon, 30 min, 37 ° C).</li>
		<li>Contre-coloration les noyaux au DAPI (50 mg/L dans du PBS) pendant 5 min à température ambiante. 
		Remarque : Il n’est peut-être pas nécessaire amplifier le signal à l’aide du système d’Amplification de Signal Tyramide (TSA). Par ailleurs, un anticorps secondaire conjugué fluorescence permet de visualiser le signal.</li>
	</ol></li> <li>D’acquérir des images à l’aide d’un microscope à fluorescence équipé DAPI, Texas Red et jeux de filtres FITC, × 4/0,13 × 40/0,75 objectifs et appareil photo 5,0 mégapixels. Utilisez la 360, 488 et longueurs d’onde de 594 nm laser pour imagerie DAPI Alexa 488 - sections et colorés à Alexa 594, respectivement. Optimiser la puissance du laser (0,8 servait généralement) et durée d’exposition aux niveaux souhaités pour chaque canal. Capturer l’image sous le contrôle du logiciel d’acquisition image et superposer les images de fluorescence ultérieurement à l’aide de logiciels de traitement d’image.</li>
</ol>

<ol><li>Fauquier, T., Lacampagne, A., Travo, P., Bauer, K., Mollard, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hidden+face+of+the+anterior+pituitary%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Endocrinol+Metab%22%5BJournal%5D)">Hidden face of the anterior pituitary.</a> Trends Endocrinol Metab. 13 (7), 304-309 (2002).</li>
<li>Haedo, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+pituitary+function+by+cytokines%5BTitle%5D)+AND+%22Horm+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of pituitary function by cytokines.</a> Horm Res. 72 (5), 266-274 (2009).</li>
<li>Zhu, X., Gleiberman, A. S., Rosenfeld, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+physiology+of+pituitary+development%3A+signaling+and+transcriptional+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Physiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Molecular physiology of pituitary development: signaling and transcriptional networks.</a> Physiol Rev. 87 (3), 933-963 (2007).</li>
<li>Bancalari, R. E., Gregory, L. C., McCabe, M. J., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Pituitary+gland+development%3A+an+update%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Dev%22%5BJournal%5D)">Pituitary gland development: an update.</a> Endocr Dev. 23, 1-15 (2012).</li>
<li>Kelberman, D., Rizzoti, K., Lovell-Badge, R., Robinson, I. C., Dattani, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetic+regulation+of+pituitary+gland+development+in+human+and+mouse%5BTitle%5D)+AND+%22Endocr+Rev%22%5BJournal%5D)">Genetic regulation of pituitary gland development in human and mouse.</a> Endocr Rev. 30 (7), 790-829 (2009).</li>
<li>Peker, S., Kurtkaya-Yapicier, O., Kilic, T., Pamir, M. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Microsurgical+anatomy+of+the+lateral+walls+of+the+pituitary+fossa%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Neurochir+%28Wien%29%22%5BJournal%5D)">Microsurgical anatomy of the lateral walls of the pituitary fossa.</a> Acta Neurochir (Wien). 147 (6), 641-648 (2005).</li>
<li>Wolpert, S. M., Molitch, M. E., Goldman, J. A., Wood, J. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Size%2C+shape%2C+and+appearance+of+the+normal+female+pituitary+gland%5BTitle%5D)+AND+%22AJR+Am+J+Roentgenol%22%5BJournal%5D)">Size, shape, and appearance of the normal female pituitary gland.</a> AJR Am J Roentgenol. 143 (2), 377-381 (1984).</li>
<li>Carbajo-Perez, E., Watanabe, Y. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+proliferation+in+the+anterior+pituitary+of+the+rat+during+the+postnatal+period%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Tissue+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular proliferation in the anterior pituitary of the rat during the postnatal period.</a> Cell Tissue Res. 261 (2), 333-338 (1990).</li>
<li>Nantie, L. B., Himes, A. D., Getz, D. R., Raetzman, L. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Notch+signaling+in+postnatal+pituitary+expansion%3A+proliferation%2C+progenitors%2C+and+cell+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Endocrinol%22%5BJournal%5D)">Notch signaling in postnatal pituitary expansion: proliferation, progenitors, and cell specification.</a> Mol Endocrinol. 28 (5), 731-744 (2014).</li>
<li>Tzou, S. C., Landek-Salgado, M. A., Kimura, H., Caturegli, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+mouse+pituitary+immunogen+for+the+induction+of+experimental+autoimmune+hypophysitis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of mouse pituitary immunogen for the induction of experimental autoimmune hypophysitis.</a> J Vis Exp. (46), (2010).</li>
<li>Budry, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Related+pituitary+cell+lineages+develop+into+interdigitated+3D+cell+networks%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Related pituitary cell lineages develop into interdigitated 3D cell networks.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (30), 12515-12520 (2011).</li>
<li>Wilson, D. B., Wyatt, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histopathology+of+the+pituitary+gland+in+neonatal+little+%28lit%29+mutant+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Histol+Histopathol%22%5BJournal%5D)">Histopathology of the pituitary gland in neonatal little (lit) mutant mice.</a> Histol Histopathol. 7 (3), 451-455 (1992).</li>
<li>Jonkers, B. W., Sterk, J. C., Wouterlood, F. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcardial+perfusion+fixation+of+the+CNS+by+means+of+a+compressed-air-driven+device%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Transcardial perfusion fixation of the CNS by means of a compressed-air-driven device.</a> J Neurosci Methods. 12 (2), 141-149 (1984).</li>
<li>Cao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ZBTB20+is+required+for+anterior+pituitary+development+and+lactotrope+specification%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">ZBTB20 is required for anterior pituitary development and lactotrope specification.</a> Nat Commun. 7, 11121(2016).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Pour développer des hypophyses murins, il a été techniquement difficile d’obtenir des sections coronales appropriées en raison de leurs caractéristiques de minuscules et fragiles et les particularités anatomiques6,8. Certains groupes de recherche a donc choisi des sections misagittal d’analyser la morphologie embryonnaire et néonatale hypophysaire11,,12. Bien que la section longitudinal de l’hypophyse es...

La glande pituitaire ou hypophyse est un organe endocrine sécrétant des hormones essentielles pour l’homéostasie1,2. Anatomiquement, l’hypophyse est une structure '' two-in-one'', consistant en la neurohypophyse et l’adénohypophyse. Ces pièces ont très différemment de fonction et différentes origines embryonnaires. La neurohypophyse est dérivée de l’ectoderme neural et sécrète de l’ocytocine et l’hormone antidiurétique. L’adénohypophyse provient de la poche de Rathke et est responsable de la libération d’hormones dont l’hormone de croissance, prolactine, hormone stimulant la thyroïde, hormone folliculo - stimulante, hormone lutéinisante, hormone corticotrope, et hormone folliculostimulante de mélanocytes –3,4,5.
La glande pituitaire repose sur la surface dorsale de l’OS sphénoïde (selle turcique) du crâne de souris et est fixée sur le plancher du cerveau par une tige fragile. Il est entouré latéralement par les nerfs trijumeau et vers l’avant par le chiasma6,7. La glande a une forme ovale allongée avec son grand axe perpendiculaire à celui de la tête. Sur sa face dorsale, la neurohypophyse et l’adénohypophyse peuvent facilement être délimités, avec l’ancien occupant la région médiane dorsale et la dernière s’étendant latéralement et sur le ventre. Pendant le développement postnatal, la taille de l’hypophyse augmente rapidement durant le premier mois après la naissance de8,9. Néanmoins, l’hypophyse de la souris est toujours très petite taille avec un poids moyen de 1,9 mg et d’un diamètre d’axe de ~ 3 mm en adulte10, axe de diamètre de 2 à 2,5 mm au 21e jour (P21) et seulement 1 à 1,5 mm au P0.
Une section coronale est préférable pour afficher l’adénohypophyse et neurohypophyse en une seule tranche de l’hypophyse de la souris. Toutefois, certaines compétences techniques sont nécessaires pour obtenir satisfaisant coronales sections des glandes pituitaires des pays en développement de souris grâce à sa taille exceptionnellement petite et anatomie distincte. Dans cet article en vidéo, nous démontrons comment disséquer les hypophyses souris et préparer les sections coronales hypophysaires aux stades de développement différents.

<table><tbody><tr><td>Tools/Equipment</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux-droits</td><td>JinZhong</td><td>J21010</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Ciseaux fins à tension</td><td>JinZhong</td><td>WA1010</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs Pince</td></tr><tr><td>émoussée</td><td>JinZhong</td><td>JD1020</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Pinces fines</td><td>Dumont</td><td>RS-5015</td><td>pour l’isolement de l’aiguille pituitaire</td></tr><tr><td>26G (0,45 mm)</td><td>HongDa</td><td></td><td>pour perfusion transcardique</td></tr><tr><td>Seringue (1 mL)</td><td>BD</td><td></td><td>300841 peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Seringue (10 mL)</td><td>BD</td><td></td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs Antenne</td></tr><tr><td>de 35 mm</td><td>Corning</td><td>430165</td><td>peut être achetée auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Le papier de nettoyage</td><td>d’objectif ShuangQuan</td><td></td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Microscope anatomique</td><td>OLYMPUS</td><td>SZX-ILLB2-200</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs Cassette</td></tr><tr><td>d’encastrement</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-272423</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Système de console d’encastrement de tissus</td><td>KEDEE KD-BM11</td><td></td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Microtome</td><td>Thermo Fisher</td><td>HM315R</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs Lames</td></tr><tr><td>Superfrost-Plus</td><td>Thermo Fisher</td><td>22-037-246</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Verre de couverture</td><td>Thermo Fisher</td><td>12-543</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Microscope à fluorescence</td><td>OLYMPUS</td><td>BH2-RFCA</td><td>peut être acheté auprès d’autres fournisseurs</td></tr><tr><td>Nom</td><td>Entreprise</td><td>Numéro de catalogue</td><td>Comments</td></tr><tr><td>Reagents</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Urethane</td><td></td><td>BBI EB0448</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma</td><td>S9625</td><td>pour PBS</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma</td><td>P9541</td><td>pour PBS</td></tr><tr><td>Na2HPO4.12H2O</td><td>Sigma</td><td>71650</td><td>pour PBS</td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Sigma</td><td>P2222</td><td>pour PBS</td></tr><tr><td>NaNO2</td><td>Sigma</td><td>237213</td><td></td></tr><tr><td>Héparine sodique injectable</td><td>SPH</td><td>H31022051</td><td>pour perfusion saline</td></tr><tr><td>Paraformaldéhyde (PFA)</td><td>Sigma</td><td>P6148</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>SCR</td><td>10009218</td><td></td></tr><tr><td>Xylène</td><td>SCR</td><td>10023418</td><td></td></tr><tr><td>Paraffine</td><td>Thermo Fisher</td><td>8330</td><td></td></tr><tr><td>Hématoxyline</td><td>Sigma</td><td>H9627</td><td>pour H& Coloration E</td></tr><tr><td>Eosin Y</td><td>Sigma</td><td>E4009</td><td>pour H& E coloration lapin</td></tr><tr><td>anti hormone de croissance (GH)</td><td>Hormone</td><td></td> nationale <td>pour immunocoloration anticorps</td></tr><tr><td></td> Programme <td></td><td></td><td>hypophysaire</td></tr><tr><td>Lapin anti-souris Anticorps GFAP</td><td>Sigma</td><td>G9269</td><td>pour immunocoloration</td></tr><tr><td>Chèvre anti-lapin IgG, HRP</td><td>Jackson</td><td>111-035-003</td><td>pour immunocoloration</td></tr><tr><td>Système TSA</td><td>NEN Produits de sciences de la vie</td><td>NEL700</td><td>pour l’immunomarquage</td></tr><tr><td>Streptavidine, Alexa Fluor 594</td><td>Thermo Fisher</td><td>S32356</td><td>pour l’immunomarquage</td></tr><tr><td>Anti-FITC Alexa Fluor 488</td><td>Thermo Fisher</td><td>A11090</td><td>pour l’immunomarquage</td></tr></tbody></table>

dissection et préparation de tranches coronales de développer la glande pituitaire souris

Dissection and Coronal Slice Preparation of Developing Mouse Pituitary Gland

La glande pituitaire ou hypophyse est un organe endocrine sécrétant des hormones essentielles pour l’homéostasie. Il se compose de deux glandes avec origines embryonnaires distinctes et les fonctions — la neurohypophyse et l’adénohypophyse. L’hypophyse en développement de souris est minuscule et délicat avec une forme ovale allongée. Une section coronale est préférée à afficher l’adénohypophyse et la neurohypophyse en une seule tranche de l’hypophyse de la souris.
Le but du présent protocole est d’atteindre la bonne sections coronales hypophysaires avec des architectures de tissu bien préservé des pays en développement de la souris. Dans ce protocole, nous décrivons en détail comment disséquer et traiter des glandes pituitaires correctement des pays en développement de la souris. Tout d’abord, les souris sont fixés par transcardial perfusion de formaldéhyde avant la dissection. Puis les trois techniques différentes de dissection sont appliquées pour obtenir les hypophyses intacts selon l’âge de la souris. Chez les souris foetales de jours embryonnaires (E) 17,5-18,5 et nouveaux-nés vers le haut à 4 jours, les régions de sella entière y compris le sphénoïde, glandes et des nerfs trijumeau sont disséquées. Pour les petits âgés jours (P) 5-14, les glandes pituitaires reliés aux nerfs trijumeau sont disséqués dans son ensemble. Pour les souris âgé de plus de 3 semaines, les glandes pituitaires sont soigneusement disséqués gratuite les tissus environnants. Nous affichons également comment intégrer les glandes pituitaires dans une orientation appropriée en utilisant les tissus environnants comme repères pour obtenir satisfaisant des sections coronales. Ces méthodes sont utiles dans l’analyse des caractéristiques histologiques et du développement des glandes pituitaires dans le développement des souris.

Ce protocole présente une méthode pour disséquer les glandes pituitaires des pays en développement de la souris. Pour la souris néonatale, des régions entières sella contenant la glande pituitaire, les nerfs trijumeau et le dessous sphénoïde ont été disséqués à partir de la base du crâne. L’hypophyse minuscule et délicate sont restés intact au cours du processus (Figure 1 a). Pour les souris plus de 5 jours, les glandes pituitaires attachés aux nerfs trijumea...

Nous présentons un protocole pour disséquer les glandes pituitaires et préparer hypophysaires sections coronales des pays en développement de la souris.

Dissection et préparation de tranches coronales de développer la glande pituitaire souris

The pituitary gland or hypophysis is an important endocrine organ secreting hormones essential for homeostasis. It consists of two glands with separate ...

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir des coupes coronales hypophysaires appropriées avec des architectures tissulaires bien préservées de souris en développement. Cette procédure peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement hypophysaire, telles que l’histologie hypophysaire, la différenciation cellulaire, la prolifération et l’apoptose. Le principal avantage de cette technique est que les hypophyses murines en développement peuvent être disséquées sans dommages visibles et correctement orientées pour réaliser des coupes coronales.Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons constaté que, pour développer des hypophyses murines, il était techniquement difficile d’obtenir des coupes coronales appropriées. Après avoir anesthésié et fixé les souris selon le protocole textuel, utilisez des ciseaux pour ouvrir l’os du crâne. Ensuite, à l’aide d’une pince, soulevez doucement le cerveau postérieur de la base du crâne.Ensuite, au premier signe de la sella turcica, arrêtez de soulever mais tenez le cerveau postérieur et utilisez des ciseaux fins pour couper la tige hypophysaire et les fibres nerveuses connectées à la base du cerveau. Continuez à soulever et à retirer tout le cerveau pour exposer complètement la glande pituitaire. La glande pituitaire repose sur la surface dorsale de l’os sphénoïdal et est entourée latéralement par des nerfs trijumeau.Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper toute la région sellaire, y compris la glande pituitaire, les nerfs trigéminaux latéraux et sous l’os sphénoïdal. Mettez le mouchoir dans une boîte de 35 mm contenant 4 % de PFA et incubez-le à 4 degrés Celsius pendant 40 minutes à 3 heures, selon l’âge. Ensuite, utilisez 10 ml de PBS pour laver le mouchoir fixé pendant cinq changements de 15 minutes chacun.Transférez le tissu fixé dans une boîte de 35 mm contenant 1 mL de PBS et, sous un stéréomicroscope, dissociez les glandes pituitaires. Pour les hypophyses P5 à P14, à l’aide de pinces fines et de ciseaux, retirez les membranes conjonctives entre les nerfs et l’os, et isolez soigneusement la glande pituitaire ainsi que les nerfs trijumeaux latéraux dans leur ensemble, mais en laissant la selle turcica. Pour les hypophyses P21 et adultes, retirez les nerfs et les membranes conjonctives autour de l’hypophyse et libérez la glande des tissus environnants.Après déshydratation, clarification du xylène et infiltration de cire effectuées selon le protocole textuel, sur un système de console d’enrobage de tissus, retirer l’échantillon de la cassette et le placer dans un moule de base à moitié rempli de cire de paraffine fondue. Pour les glandes pituitaires P21 et adultes, utilisez des pinces fines réchauffées pour positionner la glande pituitaire avec son axe court perpendiculaire à la surface inférieure d’un moule de base. Pour les hypophyses P0 à P4, orientez les spécimens avec leurs os sphénoïdes perpendiculairement à la surface inférieure d’un moule de base.Pour les glandes pituitaires P5 à P14, orientez les spécimens avec leurs nerfs trigéminaux perpendiculairement à la surface inférieure d’un moule de base. Après avoir positionné la glande, à l’aide d’une pince fine chauffée, maintenez doucement le tissu dans la position souhaitée jusqu’à ce que la cire devienne semi-solide sur une plaque de refroidissement. Remplissez le moule avec de la cire de paraffine fondue.Laissez refroidir le bloc de paraffine jusqu’à ce que la cire soit complètement solidifiée. Réfrigérez le bloc de paraffine à moins 20 degrés Celsius pendant 10 à 20 minutes, puis utilisez un microtome pour le couper en fines tranches, en affinant la position du bloc de paraffine pendant la section. Effectuer l’immunomarquage selon le protocole textuel.Comme montré ici, pour disséquer la glande pituitaire de la souris néonatale, toute la région sellaire contenant la glande pituitaire, les nerfs trigéminaux et l’os sphénoïdal en dessous a été disséquée à partir de la base du crâne. La minuscule et délicate glande pituitaire est restée intacte pendant le processus. Pour les souris âgées de plus de cinq jours, les glandes pituitaires attachées aux nerfs trijumeaux latéraux ont été isolées.La structure de croissance de la glande pituitaire isolée de la souris P7 était bien préservée. Ici, la glande pituitaire de la souris P21 a été isolée avec succès sans dommages visibles tout en enlevant les tissus environnants. Dans cette figure, la coloration H&E des coupes coronales correctement orientées démontre une morphologie bien préservée de l’adénohypophyse et de la neurohypophyse dans les glandes pituitaires P0, P7 et P21.Enfin, les lames traitées étaient également compatibles avec le marquage par immunofluorescence. À titre d’exemple, l’adénohypophyse et la neurohypophyse ont montré un immunomarquage spécifique de la GH et de la GFAP, respectivement. Une fois maîtrisé, le processus de dissection à l’intégration peut être effectué en 7,5 heures chez les souris adultes et encore moins chez les souris plus jeunes s’il est effectué correctement.Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de disséquer toute la région sellaire pour éviter de toucher l’hypophyse avec des outils chirurgicaux. Suite à cette procédure, l’hypophyse qui n’a pas été préfixée peut également être isolée. Dans ce cas, il faut prendre plus de précautions pour éviter tout dommage indésirable.La glande doit également être disséquée le plus rapidement possible. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer les glandes pituitaires de souris et de préparer des coupes coronaires hypophysaires à différents stades de développement.

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JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

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