Dissection et préparation de tranches coronales de développer la glande pituitaire souris

L’objectif global de cette procédure est d’obtenir des coupes coronales hypophysaires appropriées avec des architectures tissulaires bien préservées de souris en développement. Cette procédure peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine du développement hypophysaire, telles que l’histologie hypophysaire, la différenciation cellulaire, la prolifération et l’apoptose. Le principal avantage de cette technique est que les hypophyses murines en développement peuvent être disséquées sans dommages visibles et correctement orientées pour réaliser des coupes coronales.

Nous avons eu l’idée de cette méthode pour la première fois lorsque nous avons constaté que, pour développer des hypophyses murines, il était techniquement difficile d’obtenir des coupes coronales appropriées. Après avoir anesthésié et fixé les souris selon le protocole textuel, utilisez des ciseaux pour ouvrir l’os du crâne. Ensuite, à l’aide d’une pince, soulevez doucement le cerveau postérieur de la base du crâne.

Ensuite, au premier signe de la sella turcica, arrêtez de soulever mais tenez le cerveau postérieur et utilisez des ciseaux fins pour couper la tige hypophysaire et les fibres nerveuses connectées à la base du cerveau. Continuez à soulever et à retirer tout le cerveau pour exposer complètement la glande pituitaire. La glande pituitaire repose sur la surface dorsale de l’os sphénoïdal et est entourée latéralement par des nerfs trijumeau.

Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper toute la région sellaire, y compris la glande pituitaire, les nerfs trigéminaux latéraux et sous l’os sphénoïdal. Mettez le mouchoir dans une boîte de 35 mm contenant 4 % de PFA et incubez-le à 4 degrés Celsius pendant 40 minutes à 3 heures, selon l’âge. Ensuite, utilisez 10 ml de PBS pour laver le mouchoir fixé pendant cinq changements de 15 minutes chacun.

Transférez le tissu fixé dans une boîte de 35 mm contenant 1 mL de PBS et, sous un stéréomicroscope, dissociez les glandes pituitaires. Pour les hypophyses P5 à P14, à l’aide de pinces fines et de ciseaux, retirez les membranes conjonctives entre les nerfs et l’os, et isolez soigneusement la glande pituitaire ainsi que les nerfs trijumeaux latéraux dans leur ensemble, mais en laissant la selle turcica. Pour les hypophyses P21 et adultes, retirez les nerfs et les membranes conjonctives autour de l’hypophyse et libérez la glande des tissus environnants.

Après déshydratation, clarification du xylène et infiltration de cire effectuées selon le protocole textuel, sur un système de console d’enrobage de tissus, retirer l’échantillon de la cassette et le placer dans un moule de base à moitié rempli de cire de paraffine fondue. Pour les glandes pituitaires P21 et adultes, utilisez des pinces fines réchauffées pour positionner la glande pituitaire avec son axe court perpendiculaire à la surface inférieure d’un moule de base. Pour les hypophyses P0 à P4, orientez les spécimens avec leurs os sphénoïdes perpendiculairement à la surface inférieure d’un moule de base.

Pour les glandes pituitaires P5 à P14, orientez les spécimens avec leurs nerfs trigéminaux perpendiculairement à la surface inférieure d’un moule de base. Après avoir positionné la glande, à l’aide d’une pince fine chauffée, maintenez doucement le tissu dans la position souhaitée jusqu’à ce que la cire devienne semi-solide sur une plaque de refroidissement. Remplissez le moule avec de la cire de paraffine fondue.

Laissez refroidir le bloc de paraffine jusqu’à ce que la cire soit complètement solidifiée. Réfrigérez le bloc de paraffine à moins 20 degrés Celsius pendant 10 à 20 minutes, puis utilisez un microtome pour le couper en fines tranches, en affinant la position du bloc de paraffine pendant la section. Effectuer l’immunomarquage selon le protocole textuel.

Comme montré ici, pour disséquer la glande pituitaire de la souris néonatale, toute la région sellaire contenant la glande pituitaire, les nerfs trigéminaux et l’os sphénoïdal en dessous a été disséquée à partir de la base du crâne. La minuscule et délicate glande pituitaire est restée intacte pendant le processus. Pour les souris âgées de plus de cinq jours, les glandes pituitaires attachées aux nerfs trijumeaux latéraux ont été isolées.

La structure de croissance de la glande pituitaire isolée de la souris P7 était bien préservée. Ici, la glande pituitaire de la souris P21 a été isolée avec succès sans dommages visibles tout en enlevant les tissus environnants. Dans cette figure, la coloration H&E des coupes coronales correctement orientées démontre une morphologie bien préservée de l’adénohypophyse et de la neurohypophyse dans les glandes pituitaires P0, P7 et P21.

Enfin, les lames traitées étaient également compatibles avec le marquage par immunofluorescence. À titre d’exemple, l’adénohypophyse et la neurohypophyse ont montré un immunomarquage spécifique de la GH et de la GFAP, respectivement. Une fois maîtrisé, le processus de dissection à l’intégration peut être effectué en 7,5 heures chez les souris adultes et encore moins chez les souris plus jeunes s’il est effectué correctement.

Lors de cette procédure, il est important de se rappeler de disséquer toute la région sellaire pour éviter de toucher l’hypophyse avec des outils chirurgicaux. Suite à cette procédure, l’hypophyse qui n’a pas été préfixée peut également être isolée. Dans ce cas, il faut prendre plus de précautions pour éviter tout dommage indésirable.

La glande doit également être disséquée le plus rapidement possible. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de disséquer les glandes pituitaires de souris et de préparer des coupes coronaires hypophysaires à différents stades de développement.