Name: Méthode normalisée pour la stérilisation à haut débit des graines d’Arabidopsis (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-17T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 13 s
Description: Apprenez une méthode normalisée de stérilisation à haut débit des graines d'Arabidopsis utilisant l'eau de Javel et le gaz chlore. Cette technique optimise la germination tout en prévenant la contamination microbienne.

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Nous tenons à remercier Gauri Datta pour son aide dans la préparation des supports expérimentaux. Nous sommes également reconnaissants à Bettina Wittler et James Mann pour l’examen critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par les subventions DBI-1049341 de la NSF et MCB-1143813.

1. préparation de 1 x milieu de Murashige et Skoog (MS) <ol><li>Ajouter 4,31 g de MS basale mélange sel, 10 g de saccharose et 0,5 g de 2-(N-Morpholino) ethanesulfonic acide (MES) dans un bécher contenant 0,8 L d’eau distillée et mélanger pour dissoudre. Vérifier et ajuster le pH à 5,7 en utilisant 1 M d’hydroxyde de potassium (KOH). Ajouter de l’eau distillée pour faire 1 L.</li>
	<li>Divisent les médias deux bouteilles de 1 L, 500 mL chacun. Ajouter 5 g d’agar dans chaque bouteille. Laisser le couvercle lâche.</li>
	<li>Autoclave pendant 20 min à 121 ° C, 15 lb/po2 avec une barre magnétique remuer dans la bouteille.</li>
	<li>Après la stérilisation, placez les bouteilles dans une assiette mélanger à basse vitesse et laisser le milieu MS refroidir à 45-50 ° C (jusqu'à ce qu’on peut tenir le flacon à mains nues).</li>
	<li>à partir de cette étape, effectuez toutes les opérations dans des conditions stériles dans une hotte à flux laminaire. Ajouter 500 µL Gamborg ' Solution de vitamine à chaque bouteille et remuez le milieu MS pour répartir uniformément la solution de vitamine s.</li>
	<li>Verser suffisamment médias plaques pour couvrir environ la moitié de la profondeur de la plaque.</li>
	<li>Autoriser les plaques refroidir à température ambiante pendant environ 1 h permettre l’agar pour solidifier. 
	Remarque : Si les plaques ne doivent ne pas être utilisés immédiatement, les envelopper dans du plastique et conserver à 4 ° C (température du réfrigérateur). Couverte de plaques, boîtes ou tubes avec agar solidifié peuvent être conservés pendant plusieurs semaines à 4 ° C dans un récipient hermétique.</li>
</ol> 2. Stérilisation des graines d’Arabidopsis avec eau de Javel <ol><li>plaques de préparer les États membres conformément à l’article 1 du protocole. Autoclave 100 mL d’eau distillée en même temps que les médias de MS. Utiliser plus tard comme eau de rinçage et pour aider à suspendre les graines pour aider à placage. 
	Remarque : Si vous le souhaitez, mélange de gélose de 0,8 % (p/v) (p. ex. phytagar) peut également être stérilisés à l’autoclave dans cette étape. Le mélange agar peut être substitué à l’eau distillée pendant électrodéposition (étape 2.5.3.). La viscosité supplémentaire du mélange agar facilite les graines de l’espace sur la plaque ou la plante en lignes si nécessaire.</li>
	<li>Préparer 50 % (v/v) d’eau de Javel solution à être utilisé pour stériliser les graines. Pour diluer l’eau de Javel, ajouter 100 mL d’eau de Javel à 100 mL d’eau distillée. Ajouter 50 µL de Tween 20 détergent dans la solution d’eau de Javel. 
	Remarque : La solution d’eau de Javel préparée peut être conservée pendant jusqu'à un mois, tant que c’est seulement ouvert dans des conditions stériles.</li>
	<li>Graines de 100 aliquote dans un tube de microtubes de 1,5 mL.</li>
	<li>Stériliser les graines à l’aide d’une solution de 50 % eau de Javel.
	<ol><li>Dans une hotte à flux laminaire, ajouter 500 µL de la solution 50 % eau de Javel dans le tube de microcentrifuge contenant les graines. Tapoter le fond du tube pour suspendre les graines dans la solution d’eau de Javel. 
		Remarque : Vous pouvez également une coiffe ou agitateur-secoueur peut servir à garder les graines suspendues.</li>
	</ol></li> <li>Rincer la solution d’eau de Javel du tube de.
	<ol><li>Après 10 min, retirer la solution d’eau de Javel du tube microcentrifuge à l’aide d’une pipette ou un aspirateur muni d’un embout de la pipette sur la fin.</li>
		<li>Ajouter 500 µL d’eau distillée stérile au tube. Fermer le tube et renverser pour mélanger. Permettre aux graines de se déposer au fond du tube. Une fois que les graines sont sont installés au fond du tube délicatement enlever la solution d’eau de Javel par pipetage. Répétez ce processus de rinçage fois 6.</li>
		<li>Ajouter 1 mL d’eau distillée autoclavé dans le tube de suspendre les graines.</li>
	</ol></li> <li>Plaque les graines stérilisées sur plaques MS.
	<ol><li>Dans une hotte à flux laminaire, étiqueter le bas de la plaque de MS avec le nom de stock et la date du jour.</li>
		<li>Verser les graines dans le tube de microcentrifuge sur la plaque de MS. Répandre les graines autour de la plaque de MS en utilisant une boucle inoculation stérile, à usage unique ou une stérile de la pipette. 
		Remarque : Si les graines doivent être semées en lignes, une pipette avec une pointe 200 µL peut être utilisée pour placer individuellement les graines dans les positions souhaitées. Afin d’améliorer l’écoulement des semences, l’extrémité de l’embout de la pipette peut être coupée par 3 à 5 mm à l’aide de ciseaux. Toute les graines mal placés ou grappes de graines peut ensuite être repositionnés ou séparés à l’aide d’une boucle d’inoculer à usage unique stérile.</li>
		<li>Placer la plaque de MS à l’arrière de la de la hotte à flux laminaire avec le couvercle à moitié fermée. Permettre à l’excès d’eau s’évapore de la plaque MS.</li>
		<li>Placer le couvercle sur la plaque de MS. Joint de la plaque de MS en encapsulant la plaque avec du papier microporeux chirurgicale de bande (voir la Table des matières).</li>
	</ol></li></ol> 3. Stérilisation des graines d’Arabidopsis avec chlore gazeux <ol><li>plaques de préparer les États membres conformément à l’article 1 du protocole. Autoclave 100 mL d’eau distillée en même temps que les médias de MS ; cela servira plus tard afin de suspendre les graines à l’aide en placage. 
	Remarque : Si vous le souhaitez, mélange de gélose de 0,8 % (p/v) (p. ex. phytagar) peut également être stérilisés à l’autoclave dans cette étape. Le mélange agar peut être substitué à l’eau distillée pendant électrodéposition (étape 3.6.2.). La viscosité supplémentaire du mélange agar facilite les graines de l’espace sur la plaque ou la plante en lignes si nécessaire.</li>
	<li>Avant de commencer la stérilisation, calculer les quantités d’eau de Javel et l’acide chlorhydrique (HCl) pour produire du gaz de chlore.
	<ol><li>Calculer la quantité de HCl requis produire le 6.1 % Cl 2 requise pour la stérilisation.</li>
		<li>Utiliser la formule suivante : 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq1.jpg"> avec 7 000 mL comme le volume du conteneur stérilisation et 6,1 % Cl 2 ; le volume de HCl est fixée à 3 mL. 
		Remarque : Une feuille de calcul programmé pour effectuer le calcul pour différents volumes du conteneur et % Cl 2 est fourni comme la Table 1.</li>
	</ol></li> <li>Aliquot 100 graines dans le tube à microcentrifugation 0,5 mL. Fermer les bouchons pour chaque flacon, placer les flacons dans un panier en plastique et mettre de côté. 
	Remarque : Les graines peuvent être stockés pendant une période prolongée de temps à ce stade tant ils sont stockés dans de bonnes conditions. Conditions de stockage se trouvent dans la Section 3.3.2 du protocole par Rivero et collègues 4. format de la plaque à 96 puits peut également être utilisé.</li>
	<li>Préparer les documents nécessaires pour effectuer la stérilisation au gaz chlore.
	<ol><li>Obtenir l’eau de Javel et HCl de leurs emplacements de stockage.</li>
		<li>Couper une bande de paraffine grand film (voir la Table des matières) à utiliser à l’étape 3.5.3. pour sceller le conteneur stérilisation.</li>
		<li>Placer un récipient en plastique avec couvercle dans lequel la stérilisation aura lieu à l’intérieur d’une hotte aspirante. Ouvrir les bouchons sur tous les flacons de la graine et placent le support de toute semence à l’intérieur du conteneur en plastique.</li>
	</ol></li> <li>Effectuer la stérilisation au gaz chlore à température ambiante. 
	ATTENTION : Travailler avec eau de Javel et acide séparément. Ne laissez pas une bouteille non écrêtée afin de réduire les risques de déversements accidentels. Utilisation approprié équipement de protection individuelle (EPI) y compris des gants et une blouse de laboratoire. Si ni eau de Javel ou à l’acide éclabousse gants, changer avant de manipuler les autres matériaux. Retirez toujours les gants dans la hotte de laboratoire en cas de contamination d’eau de Javel ou à l’acide.
	<ol><li>Placer un bécher de 250 mL à l’intérieur du récipient et ajouter 100 mL d’eau de Javel. 
		Remarque : La réaction entre HCl et eau de Javel nécessite au moins 22 volumes excédent d’eau de Javel. La réaction consumera le HCl et eau de Javel en libérant des gaz 2 Cl à l’eau et de chlorure de sodium (NaCl) comme sous-produits. À l’aide d’un grand excès d’eau de Javel permet la consommation d’autres HCl durant la période de ventilation, ce qui diminue la quantité de bicarbonate de sodium (NaHCO 3) nécessaire pour neutraliser la solution pour l’élimination. 
		ATTENTION : Le bol doit être au moins deux fois le volume total de liquid de l’eau de Javel + HCl. Vous éviterez les éclaboussures échapper le bécher au cours de la prochaine étape, qui peuvent endommager les graines, eau de Javel vêtements ou brûler la peau exposée.</li>
		<li>Ajouter 3 mL d’HCl dans le bécher contenant l’eau de Javel. 
		ATTENTION : La réaction initiale va produire des bulles, en particulier à des concentrations de gaz supérieures à 6,1 %. Une blouse à manches longues est nécessaire pour cette étape.</li>
		<li>Fermer le récipient de stérilisation et scellez-la avec film de paraffine immédiatement.</li>
		<li>Surveiller le conteneur de stérilisation pendant le temps de stérilisation pour l’accumulation de gaz, de l’accumulation de gaz de chlore doit être visible comme une brume jaune pâle à l’intérieur du conteneur. 
		ATTENTION : Vérifier périodiquement le conteneur de stérilisation pour s’assurer que la pression à l’intérieur n’a pas détrôné le couvercle ou le film de paraffine. Si le couvercle est venu mal inséré ou le film de paraffine s’est desserré, fermer le couvercle et envelopper soigneusement le récipient avec une couche supplémentaire de film de paraffine.</li>
		<li>Après la 1 h-stérilisation, ouvrez le conteneur en retirant le film de paraffine et ouverture du couvercle dans un coin. Laisser le conteneur évacuer pendant 3 h achever la réaction et éliminer le chlore gazeux.</li>
		<li>Fermer les bouchons des tous les tubes de microcentrifuge dans le panier de la graine. 
		Remarque : Les graines stérilisées peuvent être entreposées jusqu’au moment de l’ensemencement tant ils sont stockés dans des conditions sèches.</li>
		<li>Enlever le panier de la graine et le placer dans une hotte à flux laminaire.</li>
		<li>Neutraliser la réaction de gaz chlore <ol><li>Ajouter 1,5 g poudre de NaHCO 3 lentement dans le bécher contenant la solution d’eau de Javel/HCl et agiter avec une baguette de verre pour dissoudre la NaHCO 3 en solution. Continuez à ajouter NaHCO 3 jusqu'à ce que les bulles de gaz carbonique (CO 2) n’ont cessé de former. 
			ATTENTION : Ajouter lentement pour éviter les éclaboussures. Utiliser des EPI approprié, y compris des gants et une blouse de laboratoire.</li>
			<li>Tester le pH de la solution à l’aide de bandelettes de pH ou un pH-mètre. Ajouter supplémentaires NaHCO 3 si nécessaire jusqu'à ce que le pH de la solution est neutre (pH 7,0). À ce stade la solution peut être retirée de la hotte et éliminée conformément à toutes les directives de la disposition applicable. 
			ATTENTION : Si toute odeur est constaté pendant l’élimination, puis la solution devrait immédiatement être reversée dans la hotte.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>Plaque les graines stérilisées sur plaques MS.
	<ol><li>Dans une hotte à flux laminaire, étiqueter le bas de la plaque de MS avec le nom de stock et la date du jour.</li>
		<li>Ajouter 500 µL d’eau distillée stérilisée dans chaque tube de microcentrifuge de suspendre les graines. Versez les graines sur la plaque de MS et de répandre les graines uniformément autour de la plaque à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, à usage unique ou un embout de la pipette stérile.</li>
		<li>Placer la plaque de MS à l’arrière de la de la hotte à flux laminaire avec le couvercle à moitié fermée. Permettre à l’excès d’eau s’évapore de la plaque MS.</li>
		<li>Placer le couvercle sur la plaque de MS. La flasque de MS en encapsulant la plaque avec ruban chirurgical de papier microporeux.</li>
	</ol></li></ol> 4. La croissance de l’Arabidopsis sur MS plaques <ol><li>poser les plaques avec le couvercle dessus pendant trois jours à 4 ° c et une humidité ambiante. 
	Remarque : Ce processus est appelé stratification et sert à synchroniser la germination des graines individuelles.</li>
	<li>Les plaques de transfert dans l’environnement de croissance.
	<ol><li>, Maintenir la température à 23 ° C et l’intensité lumineuse à 120-150 µmol/m 2 s avec 16 h de lumière / obscurité de 8 h de photopériode. Placer les plaques plates dans l’environnement de croissance avec le couvercle sur le dessus afin que les racines se développer dans le milieu.</li>
	</ol></li> <li>Let les semis sur des plaques poussent pendant 8 jours. 
	Remarque : Une période de croissance de 8 jour permet tard en germination de graines à germer. Plaques peuvent être marqués avant 8 jours si toutes les graines ont germé.</li>
	<li>Marquer le taux de germination.
	<ol><li>Record du nombre de graines qui ont germé et qui n’ont pas germé. Calculer le taux de germination en divisant le nombre de graines qui germent par le nombre total de graines sur la plaque. 
		Remarque : La Germination est comptée quand la radicule a projeté à l’extérieur les téguments de la graine et les deux cotylédons sont visibles.</li>
		<li>Aussi compter le nombre de graines touchés par le moule afin de déterminer l’efficacité des conditions stérilisation.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

<ol><li>Weigel, D., Glazebrook, J. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWeigel%2C+D+%22Arabidopsis%3A+a+laboratory+manual%22">Arabidopsis: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. Cold Spring Harbor, N.Y. (2002).</li>
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<li>The Arabidopsis Genome Initiative. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((+Analysis+of+the+genome+sequence+of+the+flowering+plant+Arabidopsis+thaliana%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)"> Analysis of the genome sequence of the flowering plant Arabidopsis thaliana.</a> Nature. 408 (6814), 796-815 (2000).</li>
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<li>Stepanova, A. N., Alonso, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((PCR-based+screening+for+insertional+mutants%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">PCR-based screening for insertional mutants.</a> Methods Mol Biol. 323, 163-172 (2006).</li>
<li>O'Malley, R. C., Alonso, J. M., Kim, C. J., Leisse, T. J., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+adapter+ligation-mediated+PCR+method+for+high-throughput+mapping+of+T-DNA+inserts+in+the+Arabidopsis+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">An adapter ligation-mediated PCR method for high-throughput mapping of T-DNA inserts in the Arabidopsis genome.</a> Nat Protoc. 2 (11), 2910-2917 (2007).</li>
<li>López-Ribera, I., Vicient, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+ultrasonication+to+increase+germination+rates+of+Arabidopsis+seeds%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Methods%22%5BJournal%5D)">Use of ultrasonication to increase germination rates of Arabidopsis seeds.</a> Plant Methods. 13 (31), (2017).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Quand semer des graines d’Arabidopsis sur milieu stérile, une forme de stérilisation doit être appliquée. Traitements de stérilisation de gaz eau de Javel et de chlore entraîner semblables germination taux et moule inhibition de la croissance. Aucune méthode de stérilisation entraîne une réduction significative des taux de germination des semences à germination haut potentiel ; Toutefois, stérilisation de l’eau de Javel est recommandée pour lignes avec potentiel de germination plus faible (20 à 70 %), en raison de la petite, quoique non significatif, amélioration des taux de germination par rapport à la stérilisation au gaz (Figure 3 a).
Graines d’Arabidopsis avec eau de Javel des concentrations de 40 à 100 % jusqu'à 10 min de stérilisation offre satisfaisante taux de germination et de la suppression de moule efficace. Bien que les concentrations d’eau de Javel au moins 40 % fournissent une stérilisation adéquate pour la plupart des lots de semences, en utilisant une concentration de 40 % ou plus élevées garanties stérilisation efficace même fortement contaminées des lots de semences. Il est important de ne pas dépasser 10 min de stérilisation lors de l’utilisation d’eau de Javel concentration égale ou supérieure à 80 % afin d’éviter la mortalité élevée de graines et défauts dans le développement de la plantule.
Le traitement des graines d’Arabidopsis avec des concentrations de gaz de chlore de 6,1 % ou 16,5 % pour les résultats de 1 h dans le taux de germination élevé et élimination de moule adéquat. Concentration de gaz chlore faible (2,1 %) peut être utilisée avec succès par l’augmentation de la durée de stérilisation à 3 h.
Lorsque quelques lignes doivent être stérilisés, il est recommandée de stérilisation liquide dans une solution d’eau de Javel de 50 % pendant 10 min. Pour un plus grand nombre de lignes, la stérilisation au gaz avec une concentration de gaz de 6,1 % pendant 1 h est une meilleure option puisque plusieurs lignes peuvent être stérilisés rapidement et facilement, avec moins de manipulation.
Nos résultats fournissent des conditions normalisées pour les grand nombre de graines de différents génotypes et les semences à germination plus faible potentiel de stérilisation. La seule limitation de ces techniques de stérilisation, c’est qu’elles ne peuvent pas s’appliquer aux graines avec un taux de germination moins de 20 % en raison de la mortalité des graines. Des méthodes alternatives, telles que la sonication17, d’augmenter le taux de germination en l’absence de stérilisation peuvent être bénéfiques dans ces cas.

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) est un organisme modèle privilégié pour la recherche fondamentale et appliquée en usine biologie1,2,3. Alors que des conditions normales de croissance Arabidopsis ont été bien établis4, l’effet de la stérilisation des semences sur la viabilité des graines n’a pas été rigoureusement testé. Les milieux solides dans des caisses ou des plaques sont régulièrement utilisée pour faciliter la croissance des semis d’Arabidopsis pour de nombreuses applications expérimentales, telles que l’identification des homozygotes mutants létaux dans une population en ségrégation, observation des pousses et des racines des phénotypes à tôt stades, isolement du tissu exempts de micro-organismes pathogènes, collecte de grandes quantités de tissus des plantules, sélection des transformants ou des plantes résistantes aux médicaments et l’évaluation de germination1,2,3,4 . Les graines récoltées de plantes cultivées en serre ou chambre de croissance sont parfois contaminés par des micro-organismes et de la poussière. La croissance des semis d’Arabidopsis sur différents types de médias stériles nécessite la stérilisation des semences préalable pour éliminer les contaminants microbiens tels que les champignons et les bactéries présentes à la surface de la graine. L’utilisation d’un régime de stérilisation des semences efficace est essentielle pour un solde de germination élevé, contamination minimale et la croissance des plantes vigoureuses.
Deux principales méthodes utilisées pour la stérilisation des semences Arabidopsis reposent sur l’eau de Javel commerciale (phase liquide) et le chlore gazeux (phase vapeur). Diverses méthodes ont été employées pour les deux phase liquide stérilisation1,4,5,6,7,8,9 , graines de stérilisation 10 et vapeur-phase d’Arabidopsis8,10,11,12,13,14,15 ,16. Cependant, alors que ces procédures ont été efficaces dans l’accomplissement de la stérilisation des semences des génotypes utilisées, une analyse détaillée de l’effet de stérilisation différents traitements sur les graines de différents génotypes n'a pas signalée. Par conséquent, l’optimisation de ces procédures de stérilisation est nécessaire pour définir les conditions dans lesquelles stérilisation efficace est combinée avec des taux de germination élevé.
L’Arabidopsis Biological Resource Center (ABRC) occupe une position unique pour un) tester la viabilité des semences d’une variété de génotypes différents dans la collection et b) Profitez des procédures de contrôle de la qualité appliqué en interne et en réponse aux commentaires des utilisateurs sur la germination des graines. Les expériences présentées ici visait à déterminer les effets des différentes méthodes de stérilisation sur la germination des graines d’une gamme d’Arabidopsis génotypes. Procédures de stérilisation optimisée qui entraînent des taux de germination de graines élevée tout en conservant la contamination par des pathogènes minime sont présentés pour la stérilisation au gaz eau de Javel et de chlore.

méthode normalisée pour la stérilisation à haut débit des graines d’arabidopsis

Standardized Method for High-throughput Sterilization of Arabidopsis Seeds

Arabidopsis thaliana Semis (Arabidopsis) a souvent besoin d’être cultivées sur des milieux stériles. Cela nécessite la stérilisation des semences préalable pour prévenir la croissance des contaminants microbiens présents sur la surface de la graine. Actuellement, les graines d’Arabidopsis sont stérilisés à l’aide de deux techniques de stérilisation distinctes dans des conditions qui diffèrent légèrement entre les laboratoires et ne sont pas normalisées, entraînant souvent la stérilisation seulement partiellement efficace ou mortalité excessive de semences. La plupart de ces méthodes n’est pas facilement évolutive pour un grand nombre de lignes de semences des divers génotypes. Que technologies d’analyse de haut-débit de Arabidopsis continuent de proliférer, techniques normalisées pour la stérilisation des grandes quantités de graines de différents génotypes deviennent essentielles pour ce type d’expériences. La réponse d’un certain nombre de lignes d’Arabidopsis à deux techniques différentes de stérilisation a été évaluée à l’issu des taux de germination des graines et le niveau de contamination des semences avec les microbes et autres agents pathogènes. Les traitements comprenant différentes concentrations de stérilisation des agents et des temps d’exposition, combinés pour déterminer les conditions optimales pour la stérilisation des semences Arabidopsis. Optimisé de protocoles ont été développé pour les deux méthodes de stérilisation différents : eau de Javel (phase liquide) et le gaz de chlore (Cl2) (phase vapeur), les deux donnant lieu à un taux de germination élevé en graines et une contamination microbienne minimale. L’utilité de ces protocoles a été illustrée par l’essai de type sauvage et graines mutantes avec une gamme des potentiels de la germination. Nos résultats montrent que les graines peuvent être efficacement stérilisés en utilisant les deux méthodes sans mortalité excessive de semences, mais les effets néfastes de la stérilisation ont été observés pour les graines avec le plus bas que le potentiel de germination optimale. En outre, une équation a été développée pour permettre aux chercheurs d’appliquer les conditions de stérilisation de gaz chlore normalisés aux récipients hermétiques de différentes tailles. Les protocoles décrits ici permettent la stérilisation des semences facile, efficace et peu coûteux pour un grand nombre de lignes d’Arabidopsis.

Graines d’Arabidopsis prélevés dans une chambre ouverte du champ, à effet de serre et la croissance sont parfois contaminés par divers micro-organismes comme les bactéries et champignons,1,4. Ainsi, germination des graines sur milieu stérile peut être particulièrement difficile en raison de la contamination des plaques, surtout si l’approvisionnement en semences est limité. Le protocole optimisé pour la stérilisation au gaz eau de Javel et de chlore, dont les résultats sont présentés ci-dessous, minimise ce problème et préserve la viabilité des semences requis pour des applications haut débit.
Effets de stérilisation d’eau de Javel sur la germination des graines d’Arabidopsis Col-0
Eau de Javel est l’agent le plus couramment utilisé pour la stérilisation des semences chez de nombreuses espèces de plantes. La concentration optimale de l’agent de stérilisation et de la durée d’exposition varie selon les espèces. Un certain nombre de protocoles ont été utilisé à l’aide d’eau de Javel pour la stérilisation des Arabidopsis graines1,4,5,6,7,8,9 , 10. quatre concentrations différentes d’eau de Javel avec cinq temps de pose différentes périodes ont été testés et les résultats sont présentées dans Figure 1. Les traitements ont été appliqués aux graines de Columbia sauvage (Col-0). L’effet de la concentration d’eau de Javel sur la germination des graines de Col-0 variée selon le temps de stérilisation, comme en témoigne une interaction significative entre la concentration de l’eau de Javel et le temps de stérilisation (Figure 1, P &lt; 0,001, ANOVA-analyse de la variance).
Dans les expériences avec des temps de stérilisation entre 5 et 10 min, les traitements à toutes les concentrations d’eau de Javel a entraîné également des taux de germination élevé de graines de Col-0 (Figure 1). Taux de germination élevé ont aussi été observés pour des concentrations d’eau de Javel domestique de 40 % et 50 % pour les temps de stérilisation. Traitements avec javellisant 80 % et 100 % pour les périodes supérieures à 10 min a entraîné une importante diminuent des taux de germination par rapport aux temps de trempage plus courts (P &lt; 0.01, ANOVA). En outre, pour les 80 % et 100 % d’eau de Javel traitements pendant 20 min, germination diminue significativement par rapport à la correspondante 40 % et 50 % eau de Javel traitements (P &lt; 0,001, ANOVA).
Graines affichent différents niveaux de blanchiment et ratatinement lors de l’utilisation d’eau de Javel haute concentration pendant 15 min ou plus. En plus de relativement élevée (jusqu'à 32 %) la mortalité de graines, graines germées stérilisés dans ces conditions a souvent montrées des défauts de croissance, traduits par un échec des cotylédons et des hypocotyles de se dérouler et s’allongent, aboutissant à l’arrêt du développement. La plupart des traitements (14 sur 20) étaient complètement exempt de moisissure, résultant en moule niveau moyenne globale de 0,21 % ± 0,003 (tableau 1).
Un traitement avec 50 % eau de Javel et une durée de trempage de 10 min a été choisi comme le meilleur régime de stérilisation car il combiné le pourcentage de germination élevé avec bonne inhibition de la croissance de la surface pathogène. Ce traitement a été sélectionné pour tester l’effet de la stérilisation d’eau de Javel sur différentes lignées mutantes comme décrit ci-dessous.
Effets de stérilisation au gaz chlore sur la germination des graines de Col-0
Pour optimiser les conditions de stérilisation pour le gaz chlore, trois différentes concentrations de chlore gazeux ont servi à stériliser les graines Col-0 pendant deux périodes de temps (tableau 2). La concentration de gaz a été calculée sur le volume de HCl concentré et le volume du conteneur stérilisation selon l’équation suivante :
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/56587/56587eq2.jpg">
Cette équation a été dérivée en utilisant la Loi des gaz parfaits en supposant que 12,3 M HCl, une température de 23 ° C et à pression atmosphérique normale de 101,3 kPa.
L’effet de la concentration du gaz chlore sur la germination des graines de Col-0 s’est avéré dépendent du temps de stérilisation indiquée par une interaction significative entre le temps et les facteurs de concentration (Figure 2 a, P &lt; 0.01, ANOVA) . Concentration de gaz de chlore a eu aucun effet significatif sur la germination des graines de Col-0 stérilisés à 1 h. Avec ce temps de stérilisation, toutes les concentrations de chlore gazeux promu de même des niveaux élevés de germination, plus de 85 % (P &gt; 0,05, ANOVA). En revanche, une stérilisation h-long 3 a entraîné une diminution significative du taux de germination pour la plus forte concentration de chlore gazeux, comparé avec les deux concentrations de gaz inférieures (P &lt; 0,05, ANOVA). Ces résultats indiquent que les traitements des graines d’Arabidopsis avec aucune des concentrations gaz chlore testé pendant 1 h, ou avec des concentrations de gaz inférieure à 16,5 % pour 3 h, sont également efficaces pour préserver la viabilité des graines puisque le taux de germination était toujours plus élevées à 82 %. Cependant, stériliser les graines pendant 3 h avec 16,5 % de gaz naturel a été préjudiciable à la germination des graines.
La fréquence de la pourriture était aussi dépendante de la concentration de gaz et de la durée d’exposition. La croissance de moisissures est inhibée efficacement avec les concentrations relativement élevées de 6,1 % et 16,5 % gaz de chlore pour 1 h de long traitement et toutes les concentrations de gaz pendant 3 h (Figure 2 b).
Selon ces résultats, un traitement avec une concentration de gaz de 6,1 % pendant 1 h (tableau 2) a été choisi comme la meilleure condition de stérilisation de vapeur-phase pour tester l’effet de la stérilisation au gaz sur différentes lignées mutantes, puisqu’il combine (taux de germination élevé 85 %) avec un très faible niveau de contamination par des moisissures (0,02 %).
Effets de l’eau de Javel et de chlore stérilisation au gaz sur les semences à germination différents potentiels
L’analyse statistique a montré que la réponse de germination pour les méthodes de stérilisation dépendait le potentiel de germination des lignes (Figure 3 a, P &lt; 0.01, ANOVA). Stérilisation au gaz ni eau de Javel ni chlore réduit le taux de germination des graines avec potentiel de germination élevé (groupes 4 et 5). Aucun traitement a eu un effet sur le taux de germination déjà faible du groupe avec la germination plus bassepotentiel (groupe 1). En revanche, stérilisation au gaz chlore a entraîné une réduction significative d’environ 12 à 18 % (P &lt; 0.01, ANOVA) dans la germination des graines avec un potentiel de germination intermédiaire (groupes 2 et 3). Stérilisation de l’eau de Javel a aussi diminué le taux de germination de 13 % du groupe 2, mais il ne diminue pas le taux de germination du groupe 3. Bien qu’il n’y avait aucune différence significative dans le taux de germination entre l’eau de Javel et de chlore dans n’importe quel groupe de germination, les traitements de gaz (Figure 3 a, P &gt; 0,442, ANOVA), graines stérilisées à l’aide d’eau de Javel a-t-il légèrement plus élevée taux de germination de graines stérilisées en gaz dans tous les groupes de germination.
Traitements de stérilisation modifiés de façon significative (P &lt; 0,001, ANOVA) le pourcentage de graines affectés par les moisissures (Figure 3 b). Les deux stérilisation de gaz et d’eau de Javel chlore a entraîné moins moisissure (P &lt; 0,05, ANOVA) par rapport à aucune stérilisation. Il n’y avait aucune différence de niveau de moisissure détectée entre le gaz et l’eau de Javel stérilisation dans n’importe quel groupe (Figure 3 b, P &gt; 0,4, ANOVA).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig1.jpg"> 
Figure 1 : effets du temps de concentration et de la stérilisation eau de Javel sur la germination des graines d’Arabidopsis Col-0. Les valeurs sont moyen ± SD provenant de 5 répétitions indépendantes de l’expérience. * indique des différences significatives par rapport à la 5 min de trempage de durée pour une gamme de concentrations de l’eau de Javel (P &lt; 0.01, ANOVA). #indique des différences significatives de 80 % et 100 % eau de Javel concentration par rapport à 40 % et 50 % pour une durée de 20 min période (P &lt; 0.01, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig2.jpg"> 
Figure 2 : effets du chlore gaz temps de concentration et de la stérilisation sur les graines d’Arabidopsis Col-0. (A) le taux de Germination et de niveau de moule (B). Barres d’erreur représentent moyen ± SD provenant de 5 biologiques et 5 répétitions techniques de l’expérience. Signifie que ne partage pas une lettre sont significativement différents (P &lt; 0,05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56587/56587fig3.jpg"> 
Figure 3 : effets de l’eau de Javel et de chlore stérilisation au gaz sur les semences à germination différents potentiels. (A) le taux de Germination et de niveau de moule (B). Les 100 lignes de SALK ADN-T ont été classées en cinq groupes selon leur potentiel de germination, définis comme le taux de germination en l’absence de tout agent de stérilisation. Les groupes basés sur le taux de germination sont les suivants : groupe 1 (0-20 %), groupe 2 (21-50 %), groupe 3 (51-70 %), groupe 4 (71-90 %) et groupe 5 (91-100 %). Les lignes ont été choisies au hasard et leur potentiel de germination ne dépendait pas de génotype. Les valeurs sont moyen ± SD provenant de trois répétitions indépendantes de l’expérience. Lettres (« a », « ab », « c », etc) au-dessus de chaque valeur indiquent les regroupements statistiques de catégorie moyens. Signifie que ne partage pas une lettre sont significativement différents (P &lt; 0,05, ANOVA). <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/56587fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td rowspan="2">Durée de stérilisation (min)</td>
			<td colspan="4">Concentration de l’eau de Javel (%)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>40</td>
			<td>50</td>
			<td>80</td>
			<td>100</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>5</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>2.13 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>8</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,50 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,36 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>15</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,68 %</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20</td>
			<td>0,19 %</td>
			<td>0,28 %</td>
			<td>0,00 %</td>
			<td>0,00 %</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 1 : Niveau de moule de graines stérilisées en eau de Javel de Col-0.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Eau de Javel</td>
			<td>HCl</td>
			<td>Temps</td>
			<td rowspan="2">% Chlore gazeux (mol gaz total Cl2/mole/sec)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>(mL)</td>
			<td>(mL)</td>
			<td>(h)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>25</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>2.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>100</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>6.1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>1</td>
			<td>16,5</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200</td>
			<td>9</td>
			<td>3</td>
			<td>16,5</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tableau 2 : Chlore (Cl2) gaz traitements de stérilisation sur les semences de type sauvage de Columbia à l’aide d’un conteneur de 7 L.
Supplémentaire tableau 1 : Une feuille de calcul programmé pour effectuer le calcul pour différents volumes de la Cl de conteneur et %2. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56587/Supplemental_Table%20_1.xlsx" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

L’objectif de cette étude était de déterminer les effets de l’eau de Javel et de chlore stérilisation au gaz sur la germination des graines d’une gamme d’Arabidopsis génotypes cultivés sur des milieux stériles. Stérilisation optimisé protocoles ont été développés pour prévenir la croissance des contaminants microbiens, tout en assurant la survie des graines satisfaisante.

Méthode normalisée pour la stérilisation à haut débit des graines d’Arabidopsis

Arabidopsis thaliana (Arabidopsis) seedlings often need to be grown on sterile media. This requires prior seed sterilization to prevent the growth of ...

L’objectif global de cette procédure est de fournir des conditions standardisées pour une stérilisation réussie des semences d’un grand nombre de génotypes d’Arabidopsis tout en empêchant la croissance microbienne. Cette méthode vous permet de stériliser des centaines d’échantillons de semences à la fois, simplifiant ainsi une étape critique de préparation du matériel végétal dans les domaines de la génomique, de la protéomique, de la métabolomique et d’autres études à haut débit. Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre des conditions dans lesquelles une stérilisation efficace est combinée à un taux de germination élevé pour un grand nombre d’échantillons de graines.Pour commencer, préparez une solution d’eau de Javel à 50 % avec de l’eau distillée. Pour chaque 200 millilitres de solution d’eau de Javel, ajoutez 50 microlitres de détergent TWEEN 20. La solution d’eau de Javel peut être conservée jusqu’à un mois, à condition qu’elle ne soit ouverte que dans des conditions stériles.Ensuite, aliquote 100 graines dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Cela peut être fait manuellement ou à l’aide d’un robot semencier sur mesure. Maintenant, dans une hotte à flux laminaire, ajoutez 500 microlitres de la solution d’eau de Javel à 50 % aux graines.Ensuite, transférez les tubes dans un rotateur et incubez les graines dans l’eau de Javel avec une légère agitation pendant 10 minutes. Après 10 minutes, aspirez la solution d’eau de Javel des tubes en enlevant autant que possible. Ensuite, ajoutez 500 microlitres d’eau distillée stérile et retournez les tubes pour mélanger.Laissez les graines se déposer, puis aspirez l’eau et remplacez-la par une autre aliquote pour laver à nouveau les graines. Effectuez un total de six lavages de ce type avec de l’eau distillée stérilisée. Une fois que les graines ont été soigneusement lavées à l’eau, suspendez-les dans un millilitre d’eau avant de les plaquer.Avant de commencer le processus de stérilisation, calculez les volumes d’eau de Javel et d’acide chlorhydrique nécessaires à la production de chlore gazeux. Utilisez l’équation fournie pour obtenir les 6 % de chlore gazeux recommandés. Assurez-vous de calculer avec précision le volume de HCl nécessaire pour assurer une stérilisation réussie et éviter les éclaboussures.Assurez-vous de porter des gants et une blouse de laboratoire pendant ce protocole et de changer les gants chaque fois qu’ils sont mouillés avec de l’acide ou de l’eau de Javel. Sous une hotte, transférez les flacons de graines dans une grille avec leurs couvercles ouverts. Ensuite, placez le support dans un récipient en plastique dans lequel la stérilisation peut avoir lieu et préparez des bandes de film de paraffine pour sceller le couvercle du récipient.Maintenant, chargez le bécher avec 100 millilitres d’eau de Javel, puis placez un bécher de 250 millilitres à l’intérieur. L’utilisation d’un excès d’eau de Javel est un élément de sécurité et le bécher doit avoir au moins deux fois le volume total de la solution qu’il contient. De plus, manipulez toujours l’eau de Javel et les acides séparément.Ensuite, ajoutez trois millilitres d’acide chlorhydrique dans le bécher, puis fermez immédiatement le récipient et scellez-le avec du parafilm. Surveillez le récipient pendant une heure pour vous assurer que le gaz s’accumule pendant la stérilisation. Le chlore gazeux doit être visible sous la forme d’une légère brume jaune à l’intérieur du récipient ou la solution peut être vérifiée pour ne pas jaunir.Vérifiez périodiquement l’étanchéité du récipient. Si le couvercle se détache ou si le joint de paraffine commence à se desserrer, refermez hermétiquement le couvercle avec une couche supplémentaire de film de paraffine. Après la stérilisation d’une heure, ouvrez un coin du récipient pour évacuer le gaz sur une période de trois heures.Après trois heures de ventilation, bouchez tous les tubes et stockez les graines stérilisées dans des conditions sèches jusqu’à ce qu’elles soient placées. Maintenant, neutralisez la réaction en ajoutant lentement 1,5 gramme de poudre de bicarbonate de sodium tout en remuant avec une tige de verre pour dissoudre les solides. Continuez à ajouter du bicarbonate de sodium jusqu’à ce que les bulles de dioxyde de carbone aient cessé de se former.Ensuite, mesurez le pH de la solution et, si nécessaire, ajoutez du bicarbonate de sodium supplémentaire jusqu’à ce que le pH soit neutre. À condition que la solution ne soit pas malodorante, elle peut être éliminée. Sinon, attendez que toutes les odeurs se dissipent.Ajoutez 500 microlitres d’eau distillée stérilisée dans chaque tube de graines stérilisées au gaz. Ensuite, versez les graines sur une plaque MS et étalez-les uniformément à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile à usage unique ou d’un embout de pipette stérile. Après trois jours de stratification des graines à quatre degrés Celsius, transférez les plaques à 23 degrés Celsius avec 16 heures d’exposition quotidienne à la lumière.Gardez les couvercles sur le dessus pour que les racines poussent dans le milieu. Après huit jours de croissance, marquez la fraction de graines qui ont germé. La germination est comptée lorsque le radical s’est projeté à l’extérieur du tégument de la graine et que les deux cotylédons sont visibles.Comptez également le nombre de graines affectées par la moisissure pour déterminer l’efficacité des conditions de stérilisation. Quatre concentrations différentes d’eau de Javel à cinq moments d’exposition différents ont été testées sur des graines de type sauvage du Columbia. Des concentrations élevées d’eau de Javel ont nui à la germination en cas d’exposition trop importante.Cependant, des taux de germination élevés ont été observés avec 40 et 50 % d’eau de Javel à tous les moments d’exposition. Les graines stérilisées avec de fortes concentrations d’eau de Javel avaient une mortalité élevée et présentaient souvent des défauts de croissance, mais étaient généralement complètement exemptes de moisissure. La stérilisation à 50 % d’eau de Javel pendant 10 minutes a permis d’obtenir un équilibre optimal entre l’inhibition de la moisissure et la germination saine.Afin d’optimiser les conditions de stérilisation au chlore gazeux, trois concentrations différentes de chlore gazeux ont été utilisées pour stériliser les graines de type sauvage Columbia sur deux durées différentes. Il y avait une interaction significative entre le temps et la concentration de gaz. Au bout d’une heure, il n’y avait aucun effet sur la germination, tandis que la concentration de gaz la plus élevée était préjudiciable au bout de trois heures.Ainsi, une période de stérilisation d’une heure a été choisie. La croissance de moisissures a été efficacement inhibée par des expositions au gaz de trois heures ou pour des expositions d’une heure avec six ou 17 % de gaz. Ainsi, une concentration de gaz de 6 % pendant une heure a été jugée optimale pour la germination et l’inhibition des moisissures.Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour stériliser avec succès des centaines de lignées de semences par jour si elle est effectuée correctement. Les graines stérilisées au gaz peuvent également être stockées pendant une période prolongée dans des conditions sèches. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser les équations fournies pour calculer les volumes requis de HCl et d’eau de Javel.Après cette procédure, d’autres méthodes, telles que des études d’association à l’échelle du génome, peuvent être effectuées afin de relier une variété de génotypes différents et les phénotypes d’intérêt. Bonne chance dans vos expériences.

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