Méthode normalisée pour la stérilisation à haut débit des graines d’Arabidopsis

L’objectif global de cette procédure est de fournir des conditions standardisées pour une stérilisation réussie des semences d’un grand nombre de génotypes d’Arabidopsis tout en empêchant la croissance microbienne. Cette méthode vous permet de stériliser des centaines d’échantillons de semences à la fois, simplifiant ainsi une étape critique de préparation du matériel végétal dans les domaines de la génomique, de la protéomique, de la métabolomique et d’autres études à haut débit. Le principal avantage de cette technique est qu’elle offre des conditions dans lesquelles une stérilisation efficace est combinée à un taux de germination élevé pour un grand nombre d’échantillons de graines.

Pour commencer, préparez une solution d’eau de Javel à 50 % avec de l’eau distillée. Pour chaque 200 millilitres de solution d’eau de Javel, ajoutez 50 microlitres de détergent TWEEN 20. La solution d’eau de Javel peut être conservée jusqu’à un mois, à condition qu’elle ne soit ouverte que dans des conditions stériles.

Ensuite, aliquote 100 graines dans un tube de microcentrifugation de 1,5 millilitre. Cela peut être fait manuellement ou à l’aide d’un robot semencier sur mesure. Maintenant, dans une hotte à flux laminaire, ajoutez 500 microlitres de la solution d’eau de Javel à 50 % aux graines.

Ensuite, transférez les tubes dans un rotateur et incubez les graines dans l’eau de Javel avec une légère agitation pendant 10 minutes. Après 10 minutes, aspirez la solution d’eau de Javel des tubes en enlevant autant que possible. Ensuite, ajoutez 500 microlitres d’eau distillée stérile et retournez les tubes pour mélanger.

Laissez les graines se déposer, puis aspirez l’eau et remplacez-la par une autre aliquote pour laver à nouveau les graines. Effectuez un total de six lavages de ce type avec de l’eau distillée stérilisée. Une fois que les graines ont été soigneusement lavées à l’eau, suspendez-les dans un millilitre d’eau avant de les plaquer.

Avant de commencer le processus de stérilisation, calculez les volumes d’eau de Javel et d’acide chlorhydrique nécessaires à la production de chlore gazeux. Utilisez l’équation fournie pour obtenir les 6 % de chlore gazeux recommandés. Assurez-vous de calculer avec précision le volume de HCl nécessaire pour assurer une stérilisation réussie et éviter les éclaboussures.

Assurez-vous de porter des gants et une blouse de laboratoire pendant ce protocole et de changer les gants chaque fois qu’ils sont mouillés avec de l’acide ou de l’eau de Javel. Sous une hotte, transférez les flacons de graines dans une grille avec leurs couvercles ouverts. Ensuite, placez le support dans un récipient en plastique dans lequel la stérilisation peut avoir lieu et préparez des bandes de film de paraffine pour sceller le couvercle du récipient.

Maintenant, chargez le bécher avec 100 millilitres d’eau de Javel, puis placez un bécher de 250 millilitres à l’intérieur. L’utilisation d’un excès d’eau de Javel est un élément de sécurité et le bécher doit avoir au moins deux fois le volume total de la solution qu’il contient. De plus, manipulez toujours l’eau de Javel et les acides séparément.

Ensuite, ajoutez trois millilitres d’acide chlorhydrique dans le bécher, puis fermez immédiatement le récipient et scellez-le avec du parafilm. Surveillez le récipient pendant une heure pour vous assurer que le gaz s’accumule pendant la stérilisation. Le chlore gazeux doit être visible sous la forme d’une légère brume jaune à l’intérieur du récipient ou la solution peut être vérifiée pour ne pas jaunir.

Vérifiez périodiquement l’étanchéité du récipient. Si le couvercle se détache ou si le joint de paraffine commence à se desserrer, refermez hermétiquement le couvercle avec une couche supplémentaire de film de paraffine. Après la stérilisation d’une heure, ouvrez un coin du récipient pour évacuer le gaz sur une période de trois heures.

Après trois heures de ventilation, bouchez tous les tubes et stockez les graines stérilisées dans des conditions sèches jusqu’à ce qu’elles soient placées. Maintenant, neutralisez la réaction en ajoutant lentement 1,5 gramme de poudre de bicarbonate de sodium tout en remuant avec une tige de verre pour dissoudre les solides. Continuez à ajouter du bicarbonate de sodium jusqu’à ce que les bulles de dioxyde de carbone aient cessé de se former.

Ensuite, mesurez le pH de la solution et, si nécessaire, ajoutez du bicarbonate de sodium supplémentaire jusqu’à ce que le pH soit neutre. À condition que la solution ne soit pas malodorante, elle peut être éliminée. Sinon, attendez que toutes les odeurs se dissipent.

Ajoutez 500 microlitres d’eau distillée stérilisée dans chaque tube de graines stérilisées au gaz. Ensuite, versez les graines sur une plaque MS et étalez-les uniformément à l’aide d’une boucle d’inoculation stérile à usage unique ou d’un embout de pipette stérile. Après trois jours de stratification des graines à quatre degrés Celsius, transférez les plaques à 23 degrés Celsius avec 16 heures d’exposition quotidienne à la lumière.

Gardez les couvercles sur le dessus pour que les racines poussent dans le milieu. Après huit jours de croissance, marquez la fraction de graines qui ont germé. La germination est comptée lorsque le radical s’est projeté à l’extérieur du tégument de la graine et que les deux cotylédons sont visibles.

Comptez également le nombre de graines affectées par la moisissure pour déterminer l’efficacité des conditions de stérilisation. Quatre concentrations différentes d’eau de Javel à cinq moments d’exposition différents ont été testées sur des graines de type sauvage du Columbia. Des concentrations élevées d’eau de Javel ont nui à la germination en cas d’exposition trop importante.

Cependant, des taux de germination élevés ont été observés avec 40 et 50 % d’eau de Javel à tous les moments d’exposition. Les graines stérilisées avec de fortes concentrations d’eau de Javel avaient une mortalité élevée et présentaient souvent des défauts de croissance, mais étaient généralement complètement exemptes de moisissure. La stérilisation à 50 % d’eau de Javel pendant 10 minutes a permis d’obtenir un équilibre optimal entre l’inhibition de la moisissure et la germination saine.

Afin d’optimiser les conditions de stérilisation au chlore gazeux, trois concentrations différentes de chlore gazeux ont été utilisées pour stériliser les graines de type sauvage Columbia sur deux durées différentes. Il y avait une interaction significative entre le temps et la concentration de gaz. Au bout d’une heure, il n’y avait aucun effet sur la germination, tandis que la concentration de gaz la plus élevée était préjudiciable au bout de trois heures.

Ainsi, une période de stérilisation d’une heure a été choisie. La croissance de moisissures a été efficacement inhibée par des expositions au gaz de trois heures ou pour des expositions d’une heure avec six ou 17 % de gaz. Ainsi, une concentration de gaz de 6 % pendant une heure a été jugée optimale pour la germination et l’inhibition des moisissures.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour stériliser avec succès des centaines de lignées de semences par jour si elle est effectuée correctement. Les graines stérilisées au gaz peuvent également être stockées pendant une période prolongée dans des conditions sèches. Lors de cette procédure, il est important de se rappeler d’utiliser les équations fournies pour calculer les volumes requis de HCl et d’eau de Javel.

Après cette procédure, d’autres méthodes, telles que des études d’association à l’échelle du génome, peuvent être effectuées afin de relier une variété de génotypes différents et les phénotypes d’intérêt. Bonne chance dans vos expériences.