Méthode à haut débit, robuste et très flexible dans le temps pour la stérilisation de surface des graines d’Arabidopsis

Un protocole à haut débit pour la stérilisation de surface des graines d’Arabidopsisthaliana (Arabidopsis) est fourni, optimisant les étapes de manipulation des liquides avec un simple dispositif d’aspiration construit avec une pompe à vide. Des centaines d’échantillons de semences peuvent être stérilisés en surface en une journée.

Ce protocole améliore la stérilisation de la surface des semences, une étape fondamentale de la génomique fonctionnelle de l’espèce modèle Arabidopsisthaliana. Les principaux avantages de cette technique sont la facilité et le débit élevé, permettant le traitement de centaines d’échantillons par jour. Avec quelques modifications simples, cette méthode peut être appliquée à de nombreuses autres espèces végétales modèles et non modèles.

Pour les nouveaux utilisateurs, veuillez faire attention à la température du milieu et à la vitesse de centrifugation, car elles sont toutes deux essentielles à la survie des graines. Pour commencer, préparez de l’éthanol à 70 % en ajoutant de l’éthanol technique à 95 % à l’eau distillée et en mélangeant soigneusement. Ensuite, préparez une solution d’eau de Javel à 5% en ajoutant cinq millilitres d’eau de Javel domestique à 95 millilitres d’eau distillée stérile.

Ensuite, ajoutez quelques gouttes de détergent non ionique à la solution d’eau de Javel et mélangez bien. Ensuite, préparez le milieu Murashige et Skoog demi-fort en ajoutant 2,2 grammes de poudre moyenne MS, y compris des vitamines et 10 grammes de saccharose dans 800 millilitres d’eau distillée. Ajustez le pH du milieu à 5,7 à l’aide d’un hydroxyde de potassium molaire, puis portez le volume à un litre en utilisant de l’eau distillée.

Aliquote 500 millilitres du milieu dans une bouteille d’un litre et ajouter quatre grammes de gélose pour préparer un milieu solide. Après l’autoclavage, laissez le milieu refroidir à 50 à 53 degrés Celsius au bain-marie. Ensuite, versez-le dans des boîtes de Petri sous la hotte à flux laminaire.

Pour préparer un milieu sélectif, ajoutez de la kanamycine au milieu et versez-le dans des boîtes de Pétri comme démontré précédemment. Pour installer l’aspirateur, connectez l’entrée de la pompe à vide à une extrémité d’un tube en polyéthylène d’une taille appropriée. Ensuite, connectez l’autre extrémité du tube à la sortie du couvercle bidirectionnel de la bouteille de décantation.

Enveloppez hermétiquement la jonction du tube avec un film d’étanchéité pour assurer une connexion étanche à l’air. Ensuite, connectez un deuxième tube en polyéthylène à l’entrée du bouchon à vis de la bouteille de décantation. Ensuite, connectez l’autre côté du tube à la sortie d’une vanne d’aquarium équipée d’un mince tube en polyéthylène.

Si nécessaire, enveloppez la jonction avec le film d’étanchéité pour éliminer les fuites d’air. Après avoir étiqueté deux lots de 48 tubes de microcentrifugation de 1,5 millilitre avec des nombres progressifs, ajoutez 100 à 200 graines d’Arabidopsis à chacun des 96 tubes de microcentrifugation stériles, à environ un à deux millimètres au-dessus du fond de l’extrémité conique du tube. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique stérile de 10 millilitres, ajoutez environ un millilitre d’éthanol à 70% dans chaque tube et fermez soigneusement les couvercles.

Agiter les tubes à une fréquence d’oscillation de huit hertz pendant trois minutes dans un agitateur. Retirez ensuite les adaptateurs du shaker et transférez-les dans le panier d’une microcentrifugeuse de paillasse pour faire tourner les graines à l’aide de la fonction d’impulsion. Après avoir transféré les tubes dans un rack, ouvrez tous les tubes sous la hotte à écoulement laminaire.

Ne touchez pas la partie des couvercles qui s’insère dans les tubes pour éviter toute contamination. Ensuite, sous la hotte à flux laminaire, installez une pointe jaune stérile de 200 microlitres sur l’entrée de la vanne d’aquarium de l’aspirateur fait maison et allumez la pompe. Insérez la pointe juste au-dessus du niveau des graines pour éviter de toucher les graines lors de la succion du liquide.

Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique stérile de 10 millilitres, aliquotez un millilitre de solution d’eau de Javel à 5% dans chaque tube. Fermez les couvercles avant de replacer les tubes dans les adaptateurs de secoueur, puis secouez les tubes comme démontré précédemment. Après avoir fait tourner les graines à l’aide de la fonction d’impulsion d’une centrifugeuse de paillasse, installez une nouvelle pointe jaune stérile de 200 microlitres sur la valve de l’aquarium et allumez la pompe.

Insérez la pointe au-dessus du niveau des graines pour éviter de toucher les graines lors de l’aspiration de la solution d’eau de Javel. Ensuite, à l’aide d’une pipette sérologique stérile de 10 millilitres, aliquotez un millilitre d’eau stérilisée dans chaque tube. Après avoir installé une nouvelle pointe jaune stérile de 200 microlitres sur la vanne de l’aquarium, allumez la pompe.

Insérez la pointe juste au-dessus du niveau des graines pour éviter de toucher les graines lors de l’aspiration de l’eau. Enfin, aliquotez 500 microlitres d’eau stérilisée dans chaque tube et fermez tous les couvercles de la hotte à écoulement laminaire. Les graines sont maintenant prêtes à être semées.

Si nécessaire, maintenez les tubes à température ambiante jusqu’à quelques heures ou à quatre degrés Celsius pendant la nuit. À l’aide d’une pipette d’un millilitre, transférer les graines avec 300 à 400 microlitres d’eau stérile dans une boîte de Pétri. Après avoir transféré 10 tubes, versez 1,5 à deux millilitres de milieu Murashige et Skoog à demi-force fondu sans antibiotiques dans chaque plaque.

Faites tourbillonner rapidement la plaque pour répartir les graines et collez les plaques sur les côtés opposés. Enveloppez les assiettes dans du plastique ou du papier d’aluminium et placez-les au réfrigérateur pendant trois jours dans l’obscurité pour obtenir une germination uniforme. Les analyses de germination effectuées aux jours deux, trois, quatre et sept n’ont indiqué aucune différence significative entre 10 à 40 minutes de temps de stérilisation avec de l’éthanol à 70%.

Cependant, lorsque le temps de stérilisation dépassait 40 minutes, les taux de germination diminuaient. En conséquence, les taux d’émergence du cotylédon vert ont également diminué. Sur la base de l’étude, trois minutes pour l’éthanol à 70% et trois minutes pour l’eau de Javel à 5% ont été sélectionnées comme temps minimum pour stériliser les graines.

Pour démontrer que les graines utilisées à l’origine étaient contaminées par des micro-organismes, des graines non stériles ont été semées directement sur les plaques. Par rapport aux graines stériles, les graines non stériles ont montré un aspect fongique après deux jours, qui se sont répandus dans toutes les plaques après une germination de sept jours. Un test de contamination croisée effectué à l’aide d’une seule pointe de pipette stérile pour traiter différents échantillons de graines a montré qu’aucun cotylédon vert n’a été observé dans les graines de génotype Columbia-0 semées dans des plaques avec de la kanamycine.

En parallèle, dans les graines de Columbia-0 semées dans des assiettes sans kanamycine, tous les cotylédons sont apparus verts après la germination. Ces résultats indiquent qu’il n’y a pas de transfert de contamination entre les échantillons malgré l’utilisation d’une seule pointe de pipette pour éliminer la solution stérile. Cette procédure est à la base de nombreuses autres méthodes de génomique fonctionnelle telles que la surexpression de gènes, l’édition du génome, la localisation subcellulaire, l’activité du promoteur et les interactions protéine-protéine et protéine-ADN.