Name: Un Flexible Low Cost système hydroponique, évaluer les réactions des plantes à petites molécules dans des Conditions stériles (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-25T13:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Découvrez un système hydroponique in vitro simple et peu coûteux pour étudier l'absorption de petites molécules par les racines d'Arabidopsis thaliana. Cette méthode permet des expériences à grande échelle en conditions stériles.

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Ce travail a été soutenu par la Fondation de recherche de São Paulo (FAPESP ; Accorder 12/19561-0) et la Société Max Planck. Elias F. Araújo (FAPEMIG 14/30594), Caroline C. Monte-Bello (FAPESP ; Grant 10407-14/3), Valéria Mafra (FAPESP ; Grant 14/07918-6), et Viviane C. H. da Silva (CAPES/CNPEM 24/2013) sommes reconnaissants pour les bourses. Les auteurs remercient Christian Meyer de l’Institut Jean Pierre Bourgin (INRA, Versailles, France) pour offrir généreusement anticorps contre RPS6. Les auteurs remercient RTV UNICAMP et Manoel Ed Paulo Aparecido de Souza pour leur soutien technique au cours de l’audio d’enregistrement.

1. préparation des milieux de Culture liquides et solides
<ol><li>Préparer un milieu liquide à l’aide de milieu de Murashige et Skoog (MS) de force avec les vitamines [0,0125 mg/L de cobalt (II) chlorure pentahydraté, 0,0125 mg/L de sulfate de cuivre (II) pentahydraté, 18,35 mg/L de sodium ferrique de tétrasodium, 3,10 mg/L de l’acide borique, 0,415 mg/L d’iodure de potassium, 8,45 mg/L de manganèse sulfate monohydrate, 0,125 mg/L de sodium molybdate dihydraté, 4,30 mg/L de sulfate de zinc heptahydraté, 166,01 mg/L de chlorure de calcium, 85 mg/L de phosphate monopotassique, 950 mg/L de nitrate de potassium, 90,27 mg/L de sulfate de magnésium, 825 mg/L de nitrate d’ammonium, 1 mg/L de la glycine, 50 mg/L de myo-inositol, 0,25 mg/L d’acide nicotinique, 0,25 mg/L de chlorhydrate de pyridoxine et 0,05 mg/L de chlorhydrate de thiamine] additionné de 0,25 g/L de MES et ajuster le pH à 5,8 avec 10 M KOH.</li>
	<li>Ajouter 10 g/L d’agar pour créer un milieu MS-solide de force. Stériliser le milieu à 121 ° C pendant 20 min avant de l’utiliser.</li>
</ol>2. hydroponique système de montage
Remarque : Ces étapes doivent être suivies méticuleusement pour construire le système hydroponique.
<ol><li>
Stérilisation de matériel
	<ol>
<li>Emballer dans le sac de l’autoclave l’embout de la pipette racks (sans cache) qui servira de minitanks. Autoclave les grilles à 121 ° C pendant 20 min, 15 lb/po2. Remarque : Le panier de pointe de pipette en polypropylène, nous avons utilisé a les dimensions suivantes : 120 mm (longueur) x 89 mm (largeur) x 55 mm (hauteur). La surface plane de pointe de pipette doit avoir un espace pour l’ajout de milieu de culture. Autres supports de pointe peuvent être utilisés (voir Table des matières). Remarque : Tout au long de la procédure de montage du système hydroponique, il est nécessaire d’utiliser une hotte à flux laminaire, qui doit être nettoyée et désinfectée avec avant l’utilisation d’éthanol à 70 %. L’expérimentateur doit porter une blouse de laboratoire, se laver les mains et toute exposées de la peau et les désinfecter avec l’éthanol à 70 %. Gants sont facultatifs, à l’exception de la demande de drogue.</li>
		<li>Nettoyez tous les accessoires décrits ci-dessus (boîtes en plastique jetables, ruban adhésif, pipettes, ciseaux et pinces à épiler) avec l’éthanol à 70 % avant d’entrer dans la hotte à flux laminaire. Si la hotte permet, allumez la lumière UV pendant 10 min avant l’assemblage du système hydroponique afin de maintenir la zone de travail décontaminée.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
Minitank assemblage
	<ol>
<li>Sceller la surface supérieure de l’embout de la pipette plat avec du ruban adhésif (Figure 1 b). Si possible, laisser sous exposition aux UV lumière pendant 10 min.</li>
		<li>Ajouter 180 µL fondu solid MS du milieu de culture (tiède) pour chaque bien en utilisant une pipette multicanaux (Figure 1). Remarque : Lors de la préparation de nombreux chars, utiliser une plaque chauffante pour empêcher le milieu MS de solidification.</li>
		<li>Laisser le milieu solidifier complètement (pour environ 30 min). Remarque : Au cours de la période de la solidification, la lumière UV peut être allumée.</li>
		<li>Remplir le panier de pointe de pipette complètement avec milieu de culture liquide MS (Figure 1) et s’assurer il y a un contact étroit entre le solide et le milieu liquide.</li>
		<li>Retirez les bandes adhésives de l’extrados de l’embout de la pipette plat et montez-la sur le rack avec soin. Le système hydroponique est maintenant prêt à recevoir les graines stérilisées.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. la stérilisation des semences
<ol><li>Placer 500 graines d’Arabidopsis dans un microtube 1,5 mL. Servir de microtubes nécessaires selon le nombre de plants nécessaires à l’expérience.</li>
	<li>Laver les graines avec de l’éthanol 70 % pendant 2 min avec une agitation douce. Laisser les graines s’installent, puis retirer l’éthanol avec précaution.</li>
	<li>Ajouter 1 mL d’une solution d’hypochlorite de sodium 10 % contenant 2 µL de détergent polysorbate 20. Agiter la solution pendant 5 min. Retirer la solution avec précaution.</li>
	<li>Rincer les graines à l’eau distillée stérile jusqu'à ce que tous les résidus d’eau de Javel sont complètement retirés (environ 5 x). NOTE : Après la stérilisation en surface, les graines ont été immergés dans l’eau distillée stérile et stratifiées à 4 ° C dans l’obscurité pour 5D synchroniser la germination. NOTE : Graines de Setaria viridis (adhésion A10.1) sont préincubés dans l’acide sulfurique concentré pendant 15 min (briser la dormance physique), lavés dans l’eau distillée stérile et puis désinfectées avec une solution d’hypochlorite de sodium 5 % contenant 0,1 % de polysorbate 20 pendant 5 min avec une agitation douce21. Les étapes restantes de stérilisation étaient identiques à celles décrites pour les graines d’Arabidopsis .</li>
</ol>4. Application de semences
<ol><li>Couper légèrement l’extrémité d’une pointe µL 200 à l’aide d’un scalpel stérile.</li>
	<li>Pipetter les graines d’Arabidopsis dans le milieu de culture solid sur la surface supérieure du plat de la pipette. Veiller à ce que le milieu ne pas desserrer de l’appartement ; Sinon, les graines sont ombrées et les plants ne seront développera pas correctement (Figure 1E). Remarque : Utilisez une pince stérile pour graines Setaria (avec l’embryon positionné vers le haut).</li>
	<li>Stocker minitanks autant que possible à l’intérieur d’une boîte en plastique jetable pour maintenir une humidité élevée et de garder l’environnement exempt de micro-organismes (Figure 1F).</li>
	<li>Scellez la boîte en plastique jetable soigneusement à l’aide de ruban adhésif pour éviter toute contamination.</li>
	<li>Placer les systèmes hydroponiques dans une chambre de culture avec les conditions de croissance approprié pour l’usine d’intérêt. Remarque : Dans ce travail, les conditions suivantes ont été utilisées : 75 % d’humidité et 150 µmol m-2 s-1 d’éclairement et de conditions équinoxiales de 12 h de lumière (21 ° C) / 12 h d’obscurité (19 ° C) d’Arabidopsis, ou 300 µmol m-2 s-1 de irradiance et 12 h de lumière (28 ° C) / 12 h d’obscurité (25 ° C) pour Setaria (Figure 1 et 1 H).</li>
</ol>5. valider l’utilisation de ce système hydroponique pour inhiber la cible de la rapamycine Kinase
Remarque : Ce système hydroponique a été initialement développé pour faciliter l’administration de substances chimiques aux plantes, qui, en général, sont très chers à appliquer dans les expériences à grande échelle. Comme une preuve de concept, l’inhibiteur compétitif ATP AZD-8055, qui est connu pour cibler spécifiquement le site de liaison ATP du TOR protéine kinase22, a été utilisé pour suivre la répression de l’activité chez les plantules d’a. thaliana Columbia-0 (TOR Le Centre de Nottingham Arabidopsis Stock, NASC ID : N22681). Ici, le protocole utilisé est brièvement décrit.
<ol><li>Hydroponique graines jusqu'à ce stade 1.04 selon le BBCH échelle23 (pour environ 11 jours) dans les conditions climatiques décrites ci-dessus. Remplacer la solution nutritive, soit avec frais moyen contenant 0,05 % DMSO (contrôle), 2 µM AZD-8055 (inhibiteur de la TOR) dilué dans le DMSO ou sans traitement (mock), à la fin de la nuit (fr).</li>
	<li>Récolter des semis à des moments différents après le traitement et séparez-les dans les racines et les pousses. Congeler les échantillons dans l’azote liquide, broyer en une poudre fine dans un broyeur de robotique (voir Table des matières) et conserver la poudre à-80 ° C jusqu'à l’utilisation.</li>
	<li>Immunoblot contre formes phosphorylées et non-phosphorylés de 40 s protéine ribosomale S6 (RPS6) selon Dobrenel et al. 24.</li>
	<li>Semis intacts pour dépigmentation de l’échantillon d’eau de Javel, lavez-les à l’eau distillée, les plonger dans une solution d’iode pour 5 min25et photographier les semis dans un stéréomicroscope (0,63 X 7,5 grandeur x objectif et rapprochement de x 20) pour un évaluation qualitative de l’amidon.</li>
	<li>Quantifier l’amidon suite à la dégradation enzymatique et la mesure du glucose libéré par spectrophotométrie par couplant à la réduction du PNDA+ à NADPH26,27.</li>
	<li>Effectuer une extraction d’ARN totale, une synthèse de cDNA et dosages quantitatifs de RT-PCR comme décrit par Caldana et al. 28 pour évaluer le niveau d’expression des gènes liés à différentes sortes de contraintes.</li>
	<li>Éventuellement, cultiver des semis sur un substrat horticole dans des pots en plastique d’une contenance de 0,1 L sous des conditions climatiques similaires [60 % d’humidité, 150 µmol m-2 s-1 de l’éclairement énergétique et équinoxiales conditions de 12 h de lumière (21 ° C) / 12 h d’obscurité (19 ° C )] afin de les comparer avec les plantules cultivées hydroponically. Remarque : Les gènes cibles utilisées pour les essais d’expression de gène ont été ABF3 (At4g34000), ASN1 (At3g47340), et TPS5 (At4g17770) et leurs niveaux d’expression ont été normalisées qui emploient la méthode delta-Ct29 à l’aide de Act2 (At3g18780) ou PDF2 (At4g04890) comme les gènes de référence interne, en supposant que 100 % de l’efficacité de l’amplification PCR dans l’ensemble de tous les échantillons. Les paires d’oligonucléotide utilisés pour la PCR quantitative ont été : ABF3 (GTTCTCAACCTGCAACACAGTGC ; TCCAGGAGATACTGCTGCAACC), ASN1 (AGGTGCGGACGAGATCTTTG ; GTGAAGAGCCTTGATCTTGC), TPS5 (CTGCTCTGATGCTCCTTCTTCC ; AAGCTGGTTTCCAACGATGATG), ACT2 (CGTACAACCGGTATTGTGCTGG ; CTCTCTCTGTAAGGATCTTCATG) et PDF2 (TAACGTGGCCAAAATGATGC ; GTTCTCCACAACCGCTTGGT).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cette structure hydroponique optimisée permet la culture réussie in vitro de plantes. Les graines germent bien sur le milieu solide à la surface plane de pointe de pipette, un gain considérable par rapport aux systèmes où les graines sont trempées avec la solution nutritive. Un grand avantage de ce système est que, pendant le développement de la plantule, racines obtenir directement en contact avec le milieu liquide sans avoir besoin du transfert. En outre, traitement chimique peut être facilement appliqué dans ...

Les avantages de la croissance des plantes à l’aide de culture hydroponique ont été largement reconnus dans la production des plantes grandes et uniformes, permettant des expériences reproductibles1,2,3. Dans ce système, la composition de la solution nutritive peut être correctement contrôlée et recyclée le long de toutes les étapes de la croissance des plantes et le développement. En outre, racines ne sont pas soumis aux stress abiotiques, comme cela peut arriver dans les plantes en terre, tels que des éléments nutritifs famine et eau carence en4. Comme plantes cultivées hydroponically présents caractéristiques morphologiques et physiologiques assez semblables à celles cultivées dans le sol, ce système a été largement employé dans la recherche car elle permet la surveillance de la croissance de la racine/tige et leur récolte sans blessures2,5.
En raison de la possibilité de modifier la composition et la concentration de la solution nutritive, la plupart des recherches à l’aide de conditions de culture hydroponiques a été effectuée pour caractériser les fonctions du micro et macronutriments1,3 ,6,7,8. Cependant, ce système s’est avéré pour être très utile pour un large éventail d’applications en biologie végétale, de nature à élucider les fonctions des hormones et de produits chimiques dans les usines. Par exemple, la découverte des strigolactones comme une nouvelle classe d’hormones9 et le phénotype d’une croissance accélérée déclenchée par brassinostéroïde demande10 ont été effectuées dans des conditions de culture hydroponiques. En outre, ce système permet des expériences avec des isotopes marqués (par exemple, 14N /15N et 13CO2)11,12 pour évaluer leur incorporation dans les protéines et de métabolites par spectrométrie de masse.
Compte tenu de l’importance de ce système en recherche sur les plantes, un grand nombre de cultures hydroponiques a été conçu dans les années précédentes, y compris les systèmes qui utilisent (i) le transfert des semis de plaques à conteneurs hydroponique3, 13; (ii) laine de roche qui limite l’accès aux premiers stades de la racine développement2,14,15; (iii) granulés de polyéthylène comme le corps flottant, ce qui rend l’application homogène des petites molécules/traitements difficiles16; ou (iv) un réduit nombre de plantes9,17. Le volume des réservoirs hydroponiques décrit dans plusieurs de ces protocoles sont généralement volumineux (petits volumes allant de 1 à 5 L, jusqu'à 32 L)18, ce qui rend l’application de produits chimiques extrêmement coûteux. Bien que peu d’études décrivent une culture hydroponique sous conditions aseptiques8,19, l’Assemblée du système est généralement très laborieux, consistant en l’ajustement parfait des mailles de nylon en plastique ou en verre conteneurs5,8,17,20.
En raison de l’importance de l’Arabidopsis thaliana comme une plante modèle, la majorité des systèmes de culture hydroponique ont été conçue pour cette espèce1,2,8,14,18, 19 , 20. Néanmoins, il existe quelques études présentant les caractéristiques de la culture hydroponique d’autres espèces végétales avec un prétraitement des semences pour améliorer leur germination et synchronisation des taux in vitro8,16 . Afin de travailler sur une grande échelle, nous avons développé un protocole pour la mise en place d’un système hydroponique de maintenance simple et peu coûteuse qui permet des conditions stériles pour la culture de plantes, dont a. thaliana et autres espèces, comme l’herbe Setaria viridis. La méthode décrite ici est adaptée aux différentes expériences, comme la croissance des semis peut être maximisée, synchronisée et facilement contrôlée. En outre, ce système présente de nombreux avantages comme : (i) son montage est simple et ses composants peuvent être réutilisés ; (ii) elle permet l’application facile des différents produits chimiques dans le milieu liquide ; (iii) les semis germent et poussent directement dans le milieu de culture sans la nécessité du transfert vers le système de culture hydroponique ; (iv) la développement/croissance caulinaire et racinaire peut être étroitement surveillée et les semis sont récoltées sans dommages-intérêts ; et (v) elle permet de travailler sur une grande échelle, maintenir des conditions physiologiques.

<table><tbody><tr><td>Éthanol</td><td>Merck</td><td>100983</td><td></td></tr><tr><td>Solution d’hypochlorite de sodium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>425044</td><td></td></tr><tr><td>Polysorbate 20&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P2287</td><td></td></tr><tr><td>Murashige et Skoog (MS) milieu avec vitamines&nbsp ;</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M0222</td><td></td></tr><tr><td>2-(N-morpholino)acide éthanesulfonique (MES) monohydraté</td><td>Duchefa Biochemie</td><td>M1503</td><td></td></tr><tr><td>Agar&nbsp ;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7921</td><td></td></tr><tr><td>Hydroxyde de potassium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>484016</td><td></td></tr><tr><td>Hotte à flux laminaire</td><td>Telstar</td><td>BH-100</td><td></td></tr><tr><td>Plaque chauffante</td><td>AREC</td><td>F20510011</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de croissance</td><td>Weiss Technik</td><td>HGC 1514</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de Pétri en verre (150 mm x 25 mm)</td><td>Uniglass</td><td>189.006</td><td></td></tr><tr><td>200 & mu; Supports de pointes de pipette L&nbsp ;</td><td>Kasvi</td><td>K8-200-5 *</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu ; L pipette multicanaux</td><td>Eppendorf</td><td>3122000060</td><td></td></tr><tr><td>300 &mu ; Pointes de pipette L</td><td>Eppendorf</td><td>30073088</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu ; Pipette L&nbsp ;</td><td>Eppendorf</td><td>3120000054</td><td></td></tr><tr><td>200 &mu ; Pointes de pipette L</td><td>Eppendorf</td><td>30000870</td><td></td></tr><tr><td>Ciseaux</td><td>Tramontina</td><td>25912/108</td><td></td></tr><tr><td>Pince à épiler</td><td>ABC Instrumentos</td><td>702915</td><td></td></tr><tr><td>Lame de scalpel</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2771</td><td></td></tr><tr><td>Ruban adhésif transparent (45mm x 50m)</td><td>Scotch 3M</td><td>5803</td><td></td></tr><tr><td>Boîtes en plastique jetables, dimensions extérieures : 353 mm (L)x 178 mm (L) x 121mm ( H)</td><td>Maxipac</td><td>32771</td><td></td></tr></tbody></table>

un flexible low cost système hydroponique, évaluer les réactions des plantes à petites molécules dans des conditions stériles

A Flexible Low Cost Hydroponic System for Assessing Plant Responses to Small Molecules in Sterile Conditions

Une large gamme d’études en biologie végétale sont effectuées à l’aide de cultures hydroponiques. Dans ce travail, un système hydroponique croissance in vitro conçu pour évaluer les réactions des plantes aux produits chimiques et autres substances d’intérêt est présenté. Ce système est très efficace pour obtenir des semis homogènes et saines des C3 C4 espèces de modèle Arabidopsis thaliana et Setaria viridis, respectivement. La culture stérile évite les algues et la contamination du micro-organisme, qui sont connus des facteurs limitants pour la croissance normale des plantes et le développement en culture hydroponique. En outre, ce système est évolutif, permettant la récolte de matériel végétal à grande échelle avec des dommages mécaniques mineurs, ainsi que la récolte des différentes parties d’une plante, si vous le souhaitez. Un protocole détaillé démontrant que ce système a un assemblage facile et peu coûteuse, puisqu’elle utilise les grilles de la pipette comme plate-forme principale pour cultiver des plantes, est fourni. La faisabilité de ce système a été validée à l’aide de Arabidopsis semis pour évaluer l’effet de la drogue AZD-8055, un inhibiteur chimique de la cible de la rapamycine (TOR) kinase. L’inhibition de TOR a été efficacement détectée dès 30 min après un traitement de AZD-8055 dans les racines et les pousses. En outre, les plantes traitées AZD-8055 affichent le phénotype d’amidon-excédent prévu. Nous avons proposé ce système hydroponique comme une méthode idéale pour les chercheurs de plantes visant à surveiller l’action des plantes inducteurs ou inhibiteurs, ainsi quant à évaluer les flux métaboliques à l’aide de composés de marquage isotopique qui, en général, nécessite l’utilisation du cher réactifs.

La kinase TOR est un régulateur majeur qui intègre des éléments nutritifs et l’énergie de signalisation promouvoir la prolifération cellulaire et la croissance chez tous les eucaryotes. Efforts pour élucider les fonctions de TOR chez les plantes incluent la génération d’Arabidopsis lignées transgéniques contenant répression conditionnelle TOR via l’interférence ARN ou des micro-ARN artificiels28,30,<sup class="...

Un système hydroponique simple, polyvalent et économique le in vitro a été optimisé avec succès, permettant à des expériences à grande échelle dans des conditions stériles. Ce système facilite l’application de produits chimiques dans une solution et leur absorption efficace par les racines pour les études moléculaires, biochimiques et physiologiques.

Un Flexible Low Cost système hydroponique, évaluer les réactions des plantes à petites molécules dans des Conditions stériles

A wide range of studies in plant biology are performed using hydroponic cultures. In this work, an in vitro hydroponic growth system designed for ...

Un système hydroponique in vitro simple, polyvalent et peu coûteux a été optimisé avec succès, permettant des expériences à grande échelle dans des conditions stériles. Ce système facilite l’application de produits chimiques en solution et leur absorption efficace par les racines pour les études moléculaires, biochimiques et physiologiques. Nous avons démontré que ce système était très efficace pour obtenir des plantules homogènes tout au long du développement initial, ainsi que pour séparer les racines et les pousses à l’aide de graines d’arabidopsis thaliana.Les éléments suivants sont nécessaires pour construire le système hydroponique et cultiver des plantes dans des conditions stériles et contrôlées. 7 % d’éthanol, 10 % de solution d’eau de Javel, polysorbate 20, milieu MS y compris des vitamines. MES monohydraté, agar, hydroxyde de potassium.Hotte à flux laminaire, plaque chauffante, chambre de croissance. Boîtes en plastique jetables, boîtes de Pétri en verre stériles, ruban adhésif, pointes de pipette stériles de 200 et 300 microlitres, ciseaux, pipette multicanaux de 300 microlitres, pipette de 200 microlitres, lame de scalpel, pince à épiler et supports d’embouts de pipette de 200 microlitres. Il est crucial que la pointe de la pipette à plat ait une zone à remplir avec le milieu solide.Stérilisez les pointes de pipette sans couvercles qui seront utilisées comme mini-réservoirs dans l’autoclave à 121 degrés pendant 20 minutes. Afin d’éviter toute contamination, tous les matériaux mentionnés ci-dessus ont été stérilisés dans l’autoclave. Lorsque cela n’était pas possible, comme dans le cas des boîtes en plastique jetables, les matériaux étaient nettoyés avec de l’éthanol à 7 % avant d’entrer dans la hotte à flux laminaire.Si la hotte le permet, la lumière UV peut être allumée pendant 10 minutes avant l’assemblage du système hydroponique. Scellez la surface supérieure de la pointe de la pipette à plat avec le ruban adhésif. Si possible, laissez-les sous la lumière UV pendant 10 minutes.Ensuite, ajoutez 108 microlitres de milieu solide fondu dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Si vous préparez de nombreux réservoirs, utilisez une plaque chauffante pour éviter que le fluide MS ne se solidifie. Laisser le milieu se solidifier complètement, environ 30 minutes.Pendant la période de solidification, la lumière UV peut être allumée. Remplissez complètement la boîte d’embouts avec du milieu de culture liquide. Garantir une compacte étroite entre les fluides solides et liquides.Retirez les rubans adhésifs de la surface supérieure de la pointe de la pipette à plat et installez-la avec précaution sur le support. Le système hydroponique est maintenant prêt à recevoir les graines stérilisées. La stérilisation à l’eau de Javel liquide décrite ici est une méthode pratique pour stériliser les graines.D’abord, placez 500 graines d’arabidopsis dans un microtube de 1,5 ml. Utilisez autant de microtubes que nécessaire en fonction du nombre de plantes nécessaires à l’expérience. Lavez les graines avec de l’éthanol à 7 % pendant deux minutes en agissant.Retirez l’éthanol avec précaution. Ajouter un ml de solution d’eau de Javel à 10 % contenant deux microlitres de détergent polysorbate 20. Agitez pendant cinq minutes.Retirez la solution avec précaution. Enfin, rincez les graines avec de l’eau distillée stérilisée jusqu’à ce que tous les résidus d’eau de Javel soient complètement éliminés, environ cinq fois. Ce protocole est réalisable pour les arabidopsis, cependant, ce système peut également être utilisé pour d’autres espèces végétales.À cette fin, cette procédure de stérilisation doit être modifiée en fonction des besoins de l’espèce. Après la stérilisation de surface, les graines ont été immergées dans de l’eau distillée stérile et stratifiées à quatre degrés dans l’obscurité pendant cinq jours pour synchroniser la germination. Coupez légèrement l’extrémité de l’extrémité de la pointe de la pipette de 200 microlitres à l’aide d’un scalpel stérile.Pipetez les graines d’arabidopsis dans le milieu de culture solide sur la face supérieure de la pointe de la pipette à plat. Veillez à ce que le milieu ne se détache pas de l’appartement, sinon les graines seront à l’ombre et les plants ne pousseront pas correctement. Stockez autant de mini-réservoirs que possible dans une boîte en plastique jetable pour maintenir une humidité élevée et un environnement exempt de micro-organismes.Fermez la boîte en plastique jetable à l’aide de ruban adhésif. Les systèmes hydroponiques sont maintenant prêts à entrer dans la chambre de croissance. Ce système hydroponique a été initialement développé pour faciliter l’administration de produits chimiques aux plantes, tels que les composés marqués aux isotopes, qui sont en général très coûteux à appliquer dans des expériences à grande échelle.Comme preuve de concept, nous avons utilisé l’inhibiteur compétitif de l’ATP AZD8055, qui cible spécifiquement le site de liaison à l’ATP de la protéine kinase cible de la rapamycine. La kinase TOR est un régulateur majeur intégrant la détection des nutriments et la signalisation de l’énergie pour favoriser la prolifération et la croissance cellulaires. Afin d’évaluer les réponses primaires de l’inhibition de TOR médiée par l’AZD, les graines d’arabidopsis ont été cultivées en hydroponie jusqu’au stade de développement souhaité sous la photopériode de 12 heures.Un milieu frais contenant deux micromolaires AZD ou 0,05 % de DMSO comme contrôle a été remplacé dans les réservoirs hydroponiques à la fin de la nuit. Les semis ont été récoltés à différents moments après le traitement, séparés en racines et pousses congelées dans de l’azote liquide, broyées en une fine poudre et stockées à moins 80 degrés jusqu’à l’utilisation. Le modèle de phosphorylation de la protéine ribosomique S6 kinase, RPS6, l’une des cibles bien connues de la voie TOR.L’immunoblotting montre la quantité de RPS6 total et phosphorylé dans les racines, graphique A, et les pousses, graphique B.La répression de la phosphorylation en présence d’ADZ855 s’est produite dès 30 minutes après le traitement médicamenteux dans les racines et les pousses, démontrant que dans les conditions expérimentales utilisées, ADZ s’est également avéré être un puissant inhibiteur de TOR qui réprime rapidement son activité kinase. Les lignées d’arabidopsis transgéniques avec une expression réduite du gène TOR ou des composants du complexe TOR présentent un phénotype clair d’excès d’amidon. L’analyse qualitative de l’amidon à l’aide de la solution de Lugol révèle le modèle attendu d’accumulation et de dégradation de l’amidon au cours du cycle.Les plantules qui n’ont pas reçu l’application du MSO ou de l’AZD855 n’ont pas montré une accumulation plus importante d’amidon dans leurs feuilles à la fin de la nuit, et l’accumulation d’amidon chez les plantes témoins, le MSO, était conforme à la littérature. De plus, les plantes traitées avec l’AZD présentaient une plus grande quantité d’amidon restant à la fin de la nuit par rapport aux semis témoins. Ces résultats indiquent l’utilité du système hydroponique proposé dans la culture de semis imitant les conditions physiologiques.L’amidon s’accumule dans les feuilles pendant la journée et est remobilisé pendant la nuit pour soutenir les activités métaboliques. Dans des conditions normales, seule une petite fraction d’amidon, entre 5 et 10 % de la quantité totale après la fin de la journée, reste à la fin de la nuit. Ces résultats sont testés que le phénotype de l’amidon observé sous répression TOR se produit tout au long du cycle.Des plantes cultivées en hydroponie ont été comparées à des semis cultivant un substrat horticole dans des conditions climatiques très similaires concernant le niveau d’expression de l’acide abscissique et le troisième facteur de liaison aux éléments réactifs, le gène ABF3, illustré à la figure 5-A. L’expression d’ABF3 est directement corrélée aux niveaux internes d’ABA, une classe d’hormones largement connue comme un marqueur en raison de son rôle dans de multiples réponses abiotiques au stress. Bien que les plantes cultivées en hydroponie aient présenté une augmentation significative de l’expression d’ABF3 par rapport aux plantes cultivées en terre, les niveaux d’expression de l’asparagine synthétase one ASN1 n’ont pas été affectés par les traitements MSO ou AZD illustrés à la figure 5-B.Cependant, l’expression de la tréhalose phosphate synthase cinq, TPS5, plus une augmentation significative après huit heures de répression de TOR. ASN1 et TPS5 répondent respectivement à des niveaux de sucre faibles et élevés, ce qui suggère que ces plantes n’ont pas subi de stress génétique. Nous avons réussi, en utilisant ce système, à évaluer l’application de petites molécules dans les plantes.En résumé, ce système hydroponique possède de nombreux avantages car il est très rapide et facile à assembler, et a un faible coût, car les principaux composants sont bon marché et peuvent être largement réutilisés. De plus, ce système est polyvalent, permettant l’étude de semis intacts ou de distinctions tout au long du développement des plantes, et il est hautement évolutif, permettant la culture d’un grand nombre de plantes dans une très petite zone.

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Une méthode simple est fourni qui permet l'extraction rapide et l'analyse des hormones végétales multiples à partir de petits échantillons de tissu. La procédure utilise l'extraction en phase vapeur comme l'étape de purification solennelle. Les échantillons sont analysés par des ions + GC / MS avec ionisation chimique qui produit principalement des (M +1).

Surveillance des hormones végétales Durant les réponses au stress

Source : Nathoo, N., et al. Un système de co-culture hydroponique pour l’analyse simultanée et systématique des interactions moléculaires et de la signalisation plantes/microbes. J. Vis. Exp. (2017).Cette vidéo fait la démonstration d’un système de co-culture hydroponique pour étudier les interactions plantes-bactéries dans des conditions stériles. Les semis sont transférés dans un milieu de croissance stérile et acide, incubés et inspectés pour détecter toute contamination avant d’être...

Un système de co-culture pour étudier les réponses moléculaires des plantes hôtes et des bactéries en interaction

Ici, nous présentons un protocole facile à suivre pour établir un système hydroponique réussi pour les études de nutrition des plantes. Ce protocole a été largement testé chez Arabidopsis et peut facilement être adapté à d’autres espèces végétales pour étudier des besoins nutritionnels spécifiques ou l’effet d’éléments non essentiels sur la croissance et le développement des plantes.

Hydroponique: un système polyvalent pour étudier et répartition des plantes Réponses des éléments nutritifs à la disponibilité des éléments nutritifs et l&#39;exposition aux éléments toxiques

Présenté ici, il s'agit d'une technique simple pour l'imagerie confocale temporelle à haute résolution du développement de la racine et de l'hypocotylie pendant jusqu'à 3 jours en utilisant des objectifs d'ouverture numérique élevée et la perfluorodécaline comme milieu d'immersion.

Une chambre simple pour l&#39;imagerie confocale à long terme du développement racinaire et hypocotylique

Le système de cocultivation hydroponique décrit supporte des plantes intactes avec des écrans en mèches métalliques et les cocultive avec des bactéries. Les tissus végétaux, les bactéries et les molécules sécrétées peuvent ensuite être récoltées séparément pour des analyses en aval, permettant simultanément d'étudier les réponses moléculaires des hôtes de la plante et des microbes ou microbiomes en interaction.

Un système de co-culture hydroponique pour l&#39;analyse simultanée et systématique des interactions et signalisation moléculaire des plantes / microbes

Cet article montre comment la culture de semis de Arabidopsis thaliana en une plate-forme microfluidique de deux couches qui confine la racine principale et les poils absorbants pour un seul plan optique. Cette plate-forme peut être utilisée pour l’imagerie optique en temps réel de la morphologie de racines fines aussi bien en ce qui concerne l’imagerie haute résolution par d’autres moyens.

La morphologie de poils absorbants d’Arabidopsis semis dans une bicouche Microfluidic plateforme d’imagerie

Ici, nous décrivons un analyse de croissance des plantes hydroponiques pour quantifier la présence des espèces et visualiser la répartition spatiale des bactéries lors de la colonisation initiale des racines des plantes et après leur transfert dans différents environnements de croissance.

Surveillance de la colonisation bactérienne et de l'entretien des racines d'Arabidopsis thaliana dans un système hydroponique flottant

Nous fournissons une méthode pour identifier les modulateurs de la transpiration foliaire par le criblage à grande échelle d'une bibliothèque composée.

Identification de nouveaux régulateurs de la transpiration végétale par le dépistage thermique à grande échelle à Helianthus Annuus

Nous utilisons des outils de laboratoire simples pour examiner l’architecture du système racinaire (RSA) d’Arabidopsis et de Medicago. Les plantules sont cultivées en hydroponie sur des mailles et étalées à l’aide d’un pinceau d’art pour révéler le RSA. Les images sont prises à l’aide d’un balayage ou d’une caméra haute résolution, puis analysées avec ImageJ pour cartographier les traits.

Un protocole simple pour cartographier les caractéristiques de l’architecture du système racinaire végétal

Nous présentons un protocole pour un système expérimental semi-hydroponique à base de verre supportant la croissance d’une variété de plantes phylogénétiquement distinctes avec ou sans microbes. Le système est compatible avec différents milieux de culture et permet un échantillonnage non destructif de l’exsudat racinaire pour une analyse en aval.

Un système de bocal en verre polyvalent pour le profilage de l’exsudat racinaire semi-hydroponique

Découvrez un système hydroponique in vitro simple et peu coûteux pour étudier l'absorption de petites molécules par les racines d'Arabidopsis thaliana. Cette méthode permet des expériences à grande échelle en conditions stériles.

Un Flexible Low Cost système hydroponique, évaluer les réactions des plantes à petites molécules dans des Conditions stériles

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