Un Flexible Low Cost système hydroponique, évaluer les réactions des plantes à petites molécules dans des Conditions stériles

Un système hydroponique simple, polyvalent et économique le in vitro a été optimisé avec succès, permettant à des expériences à grande échelle dans des conditions stériles. Ce système facilite l’application de produits chimiques dans une solution et leur absorption efficace par les racines pour les études moléculaires, biochimiques et physiologiques.

Un système hydroponique in vitro simple, polyvalent et peu coûteux a été optimisé avec succès, permettant des expériences à grande échelle dans des conditions stériles. Ce système facilite l’application de produits chimiques en solution et leur absorption efficace par les racines pour les études moléculaires, biochimiques et physiologiques. Nous avons démontré que ce système était très efficace pour obtenir des plantules homogènes tout au long du développement initial, ainsi que pour séparer les racines et les pousses à l’aide de graines d’arabidopsis thaliana.

Les éléments suivants sont nécessaires pour construire le système hydroponique et cultiver des plantes dans des conditions stériles et contrôlées. 7 % d’éthanol, 10 % de solution d’eau de Javel, polysorbate 20, milieu MS y compris des vitamines. MES monohydraté, agar, hydroxyde de potassium.

Hotte à flux laminaire, plaque chauffante, chambre de croissance. Boîtes en plastique jetables, boîtes de Pétri en verre stériles, ruban adhésif, pointes de pipette stériles de 200 et 300 microlitres, ciseaux, pipette multicanaux de 300 microlitres, pipette de 200 microlitres, lame de scalpel, pince à épiler et supports d’embouts de pipette de 200 microlitres. Il est crucial que la pointe de la pipette à plat ait une zone à remplir avec le milieu solide.

Stérilisez les pointes de pipette sans couvercles qui seront utilisées comme mini-réservoirs dans l’autoclave à 121 degrés pendant 20 minutes. Afin d’éviter toute contamination, tous les matériaux mentionnés ci-dessus ont été stérilisés dans l’autoclave. Lorsque cela n’était pas possible, comme dans le cas des boîtes en plastique jetables, les matériaux étaient nettoyés avec de l’éthanol à 7 % avant d’entrer dans la hotte à flux laminaire.

Si la hotte le permet, la lumière UV peut être allumée pendant 10 minutes avant l’assemblage du système hydroponique. Scellez la surface supérieure de la pointe de la pipette à plat avec le ruban adhésif. Si possible, laissez-les sous la lumière UV pendant 10 minutes.

Ensuite, ajoutez 108 microlitres de milieu solide fondu dans chaque puits à l’aide d’une pipette multicanaux. Si vous préparez de nombreux réservoirs, utilisez une plaque chauffante pour éviter que le fluide MS ne se solidifie. Laisser le milieu se solidifier complètement, environ 30 minutes.

Pendant la période de solidification, la lumière UV peut être allumée. Remplissez complètement la boîte d’embouts avec du milieu de culture liquide. Garantir une compacte étroite entre les fluides solides et liquides.

Retirez les rubans adhésifs de la surface supérieure de la pointe de la pipette à plat et installez-la avec précaution sur le support. Le système hydroponique est maintenant prêt à recevoir les graines stérilisées. La stérilisation à l’eau de Javel liquide décrite ici est une méthode pratique pour stériliser les graines.

D’abord, placez 500 graines d’arabidopsis dans un microtube de 1,5 ml. Utilisez autant de microtubes que nécessaire en fonction du nombre de plantes nécessaires à l’expérience. Lavez les graines avec de l’éthanol à 7 % pendant deux minutes en agissant.

Retirez l’éthanol avec précaution. Ajouter un ml de solution d’eau de Javel à 10 % contenant deux microlitres de détergent polysorbate 20. Agitez pendant cinq minutes.

Retirez la solution avec précaution. Enfin, rincez les graines avec de l’eau distillée stérilisée jusqu’à ce que tous les résidus d’eau de Javel soient complètement éliminés, environ cinq fois. Ce protocole est réalisable pour les arabidopsis, cependant, ce système peut également être utilisé pour d’autres espèces végétales.

À cette fin, cette procédure de stérilisation doit être modifiée en fonction des besoins de l’espèce. Après la stérilisation de surface, les graines ont été immergées dans de l’eau distillée stérile et stratifiées à quatre degrés dans l’obscurité pendant cinq jours pour synchroniser la germination. Coupez légèrement l’extrémité de l’extrémité de la pointe de la pipette de 200 microlitres à l’aide d’un scalpel stérile.

Pipetez les graines d’arabidopsis dans le milieu de culture solide sur la face supérieure de la pointe de la pipette à plat. Veillez à ce que le milieu ne se détache pas de l’appartement, sinon les graines seront à l’ombre et les plants ne pousseront pas correctement. Stockez autant de mini-réservoirs que possible dans une boîte en plastique jetable pour maintenir une humidité élevée et un environnement exempt de micro-organismes.

Fermez la boîte en plastique jetable à l’aide de ruban adhésif. Les systèmes hydroponiques sont maintenant prêts à entrer dans la chambre de croissance. Ce système hydroponique a été initialement développé pour faciliter l’administration de produits chimiques aux plantes, tels que les composés marqués aux isotopes, qui sont en général très coûteux à appliquer dans des expériences à grande échelle.

Comme preuve de concept, nous avons utilisé l’inhibiteur compétitif de l’ATP AZD8055, qui cible spécifiquement le site de liaison à l’ATP de la protéine kinase cible de la rapamycine. La kinase TOR est un régulateur majeur intégrant la détection des nutriments et la signalisation de l’énergie pour favoriser la prolifération et la croissance cellulaires. Afin d’évaluer les réponses primaires de l’inhibition de TOR médiée par l’AZD, les graines d’arabidopsis ont été cultivées en hydroponie jusqu’au stade de développement souhaité sous la photopériode de 12 heures.

Un milieu frais contenant deux micromolaires AZD ou 0,05 % de DMSO comme contrôle a été remplacé dans les réservoirs hydroponiques à la fin de la nuit. Les semis ont été récoltés à différents moments après le traitement, séparés en racines et pousses congelées dans de l’azote liquide, broyées en une fine poudre et stockées à moins 80 degrés jusqu’à l’utilisation. Le modèle de phosphorylation de la protéine ribosomique S6 kinase, RPS6, l’une des cibles bien connues de la voie TOR.

L’immunoblotting montre la quantité de RPS6 total et phosphorylé dans les racines, graphique A, et les pousses, graphique B.La répression de la phosphorylation en présence d’ADZ855 s’est produite dès 30 minutes après le traitement médicamenteux dans les racines et les pousses, démontrant que dans les conditions expérimentales utilisées, ADZ s’est également avéré être un puissant inhibiteur de TOR qui réprime rapidement son activité kinase. Les lignées d’arabidopsis transgéniques avec une expression réduite du gène TOR ou des composants du complexe TOR présentent un phénotype clair d’excès d’amidon. L’analyse qualitative de l’amidon à l’aide de la solution de Lugol révèle le modèle attendu d’accumulation et de dégradation de l’amidon au cours du cycle.

Les plantules qui n’ont pas reçu l’application du MSO ou de l’AZD855 n’ont pas montré une accumulation plus importante d’amidon dans leurs feuilles à la fin de la nuit, et l’accumulation d’amidon chez les plantes témoins, le MSO, était conforme à la littérature. De plus, les plantes traitées avec l’AZD présentaient une plus grande quantité d’amidon restant à la fin de la nuit par rapport aux semis témoins. Ces résultats indiquent l’utilité du système hydroponique proposé dans la culture de semis imitant les conditions physiologiques.

L’amidon s’accumule dans les feuilles pendant la journée et est remobilisé pendant la nuit pour soutenir les activités métaboliques. Dans des conditions normales, seule une petite fraction d’amidon, entre 5 et 10 % de la quantité totale après la fin de la journée, reste à la fin de la nuit. Ces résultats sont testés que le phénotype de l’amidon observé sous répression TOR se produit tout au long du cycle.

Des plantes cultivées en hydroponie ont été comparées à des semis cultivant un substrat horticole dans des conditions climatiques très similaires concernant le niveau d’expression de l’acide abscissique et le troisième facteur de liaison aux éléments réactifs, le gène ABF3, illustré à la figure 5-A. L’expression d’ABF3 est directement corrélée aux niveaux internes d’ABA, une classe d’hormones largement connue comme un marqueur en raison de son rôle dans de multiples réponses abiotiques au stress. Bien que les plantes cultivées en hydroponie aient présenté une augmentation significative de l’expression d’ABF3 par rapport aux plantes cultivées en terre, les niveaux d’expression de l’asparagine synthétase one ASN1 n’ont pas été affectés par les traitements MSO ou AZD illustrés à la figure 5-B.

Cependant, l’expression de la tréhalose phosphate synthase cinq, TPS5, plus une augmentation significative après huit heures de répression de TOR. ASN1 et TPS5 répondent respectivement à des niveaux de sucre faibles et élevés, ce qui suggère que ces plantes n’ont pas subi de stress génétique. Nous avons réussi, en utilisant ce système, à évaluer l’application de petites molécules dans les plantes.

En résumé, ce système hydroponique possède de nombreux avantages car il est très rapide et facile à assembler, et a un faible coût, car les principaux composants sont bon marché et peuvent être largement réutilisés. De plus, ce système est polyvalent, permettant l’étude de semis intacts ou de distinctions tout au long du développement des plantes, et il est hautement évolutif, permettant la culture d’un grand nombre de plantes dans une très petite zone.