Génération de type prosencéphale standardisées et reproductibles organoïdes cérébrale de l’homme induites par les cellules souches pluripotentes

L’objectif global de cette procédure est de générer des organoïdes de type cerveau antérieur hautement standardisés et reproductibles à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Cette méthode est un outil puissant pour modéliser les mécanismes des NTZ de nouveau développement. En particulier, il peut aider à résoudre des questions clés associées à la genèse corticale humaine précoce.

Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de générer de manière standardisée et rapide du tissu cortical humain avec peu de variations entre les organoïdes individuels et les lots d’organoïdes. La technologie des organoïdes peut donner un aperçu du développement, de la structure et du fonctionnement du cerveau humain, en particulier pour les aspects que l’on ne trouve pas dans les modèles de cerveau des espèces inférieures. Pour générer des agrégats de cellules souches pluripotentes, lorsque les cultures de cellules souches atteignent 70 à 90 % de confluence, ajoutez 500 microlitres de réactif de dissociation cellulaire à un puits de la plaque de culture à six puits pour détacher les cellules.

Les cellules souches pluripotentes induites, qui sont adaptées aux conditions de culture monocouche, sont un bon type de cellule pour générer des agrégats car elles sont moins sujettes à la mort cellulaire induite par le stress pendant la procédure de dissociation et d’agrégation. Après cinq à 10 minutes à 37 degrés Celsius, tapotez doucement la plaque et utilisez deux millilitres de DMEM/F-12 pour laver les cellules du fond du puits. Transférez la suspension cellulaire résultante dans un tube conique de 15 millilitres et portez le volume de la solution cellulaire à 10 millilitres avec plus de milieu DMEM/F-12.

Après le comptage, transférez 4,5 fois 10 aux troisièmes cellules par agrégat de cellules souches pluripotentes dans un nouveau tube de 15 millilitres, et collectez les cellules par centrifugation. Nous suspendons la pastille dans le volume approprié de milieu de cellules souches pluripotentes, complété par un inhibiteur de roche micromolaire de 50 pour obtenir une cellule de 4,5 fois 10 à la troisième cellule par 150 microlitres de concentration moyenne. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de cellules dans des puits individuels d’une plaque en U à faible fixation de 96 puits et placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.

Pour surveiller l’induction du neuroectoderme antérieur, utilisez un microscope de culture tissulaire pour observer de près les changements morphologiques des agrégats de cellules souches pluripotentes chaque jour sous faible grossissement. Le premier jour, des agrégats cellulaires avec des bordures claires doivent être observés. Le deuxième jour, aspirez soigneusement environ les deux tiers du milieu, sans perturber les agrégats cellulaires au fond de chaque puits, et remplacez le milieu jeté par 100 microlitres de milieu de cellules souches pluripotentes fraîches.

Entre quatre et six jours plus tard, lorsque les agrégats cellulaires atteignent 350 à 450 micromètres de diamètre et présentent des bords lisses, utilisez une pointe de pipette modifiée de 100 microlitres pour transférer jusqu’à 20 agrégats dans une seule plaque de culture de six centimètres contenant cinq millilitres de milieu d’induction corticale. Remplacer le milieu d’induction corticale par un milieu frais une fois tous les trois jours, en surveillant quotidiennement la morphologie des agrégats sous l’objectif 4X. Après quatre à cinq jours dans le milieu d’induction corticale, les bords des agrégats cellulaires devraient commencer à s’éclaircir à la surface, indiquant une différenciation neuroectodermique et l’organisation radiale d’un épithélium pseudostratifié devrait émerger.

Pour intégrer les agrégats neuroectodermiques dans un échafaudage matriciel, décongelez l’extraction de la membrane basale sur de la glace pendant deux à trois heures. Pendant que l’extrait décongèle, utilisez des ciseaux stériles pour couper le film de paraffine plastique en un carré de quatre centimètres sur quatre pour 16 organoïdes, et placez chaque morceau de film sur un plateau vide de 100 microlitres de pointe de micropipette. Appuyez sur le film de paraffine avec le bout d’un doigt ganté pour faire apparaître de petites fossettes et nettoyez le film avec de l’éthanol à 70 %.

Après avoir passé 30 minutes au rayonnement UV dans une enceinte de biosécurité fermée et stérile, utilisez une pointe de pipette modifiée de 100 microlitres avec une ouverture d’un millimètre et demi à deux millimètres pour transférer chaque agrégat cellulaire dans une fossette du film. Lorsque tous les agrégats ont été transférés, utilisez une pointe de pipette non coupée de 100 microlitres pour aspirer soigneusement le milieu de chaque fossette, et ajoutez 40 microlitres d’extrait de membrane basale non dilué à chaque agrégat cellulaire. Veillez à ne pas endommager les organoïdes par une manipulation brutale ou une aspiration dans la pointe de la pipette, car cela endommagerait le neuroépithélium en développement.

Utilisez la pointe de la pipette pour positionner les agrégats au milieu de chaque goutte et utilisez une pince stérile pour transférer soigneusement la feuille de film de paraffine en plastique dans une boîte de Pétri de 10 centimètres. Placez le plat dans l’incubateur pendant 15 à 20 minutes. Pendant que l’extrait se solidifie, ajoutez cinq millimètres de milieu d’induction corticale frais dans une boîte de culture à faible attachement de six centimètres.

À la fin de l’incubation, retournez la feuille de film de paraffine et utilisez une pince stérile pour presser doucement jusqu’à 16 gouttelettes polymérisées dans chaque plat de six centimètres. Ensuite, retournez les agrégats dans l’incubateur de culture cellulaire. Le lendemain, transférez les boîtes de culture organoïde sur un agitateur de culture cellulaire à bascule, incliné à un angle de cinq degrés à 14 tr/min à l’intérieur d’un incubateur de culture cellulaire, avec une surveillance quotidienne par microscopie optique, jusqu’à ce que les agrégats atteignent le stade de différenciation d’intérêt.

Le 20e jour, utilisez une pointe de pipette modifiée d’un millilitre avec une ouverture de trois à trois millilitres et demi pour prélever six organoïdes des cultures d’agrégats. Placez trois des organoïdes dans un puits d’une plaque de 24 puits contenant 500 microlitres de PBS, et utilisez une pipette de cinq millilitres pour laver les organoïdes deux fois avec 500 microlitres de PBS frais par lavage. Après le deuxième lavage, fixez les organoïdes dans du paraformaldéhyde froid à 4 % pendant 15 minutes, suivi de trois lavages de 10 minutes dans du PBS à température ambiante et d’une dernière déshydratation pendant la nuit dans une solution à 30 % de saccharose à quatre degrés Celsius.

Le lendemain, pré-colorez les organoïdes déshydratés avec une dilution de un à 50 Trypan Blue pendant 10 minutes pour permettre la visualisation des organoïdes pendant la procédure de cryosection, et remplacez le saccharose par un milieu d’enrobage fraîchement préparé. Chauffez la plaque sur un coussin chauffant à 60 degrés Celsius pendant 15 minutes pour équilibrer les organoïdes dans le milieu d’enrobage, et couvrez le fond d’un moule d’enrobage par organoïde avec un milieu d’enrobage frais. Placez le moule sur de la glace pour solidifier le milieu d’enrobage, transférez les organoïdes dans les moules d’enrobage et ajoutez du milieu d’enrobage frais jusqu’à ce que chaque organoïde soit recouvert.

Ensuite, congelez les organoïdes dans un bain de congélation cryogénique à 100 % d’éthanol pendant au moins une minute, et utilisez un cryostat pour obtenir des sections de 20 micromètres d’épaisseur de chaque organoïde pour l’analyse immunocytochimique. Pour générer des organoïdes de type cerveau antérieur, utilisez uniquement des cultures IPSC qui se présentent comme une monocouche homogène de cellules indifférenciées dans la population de départ. Le deuxième jour, les agrégats devraient avoir formé des bourgeons cellulaires compacts aux bords lisses.

Les agrégats du jour 10 doivent montrer des tissus lisses et optiquement lisses et optiquement translucides sur la surface externe, représentant l’induction du neuroectoderme. Si le protocole a été suivi de près, des lots d’organoïdes hautement normalisés qui démontrent une homogénéité supérieure ou égale à 90 % dans la formation de neuroectodermes polarisés à l’intérieur et entre les lots seront générés. L’analyse immunocytochimique des organoïdes du jour 20 révèle des boucles neuroépithéliales stratifiées qui expriment le marqueur de cellules souches neurales Sox2, les marqueurs du cerveau antérieur Pax6 et Otx2 et le marqueur cortical dorsal Emx1.

Ces anses corticales sont en outre caractérisées par une localisation apicale de la N-cadhérine et du ZO-1, un microtubule dérivé des cellules gliales radiales de la zone ventriculaire, qui s’étend de la face apicale à la face basale des structures, et des cellules en division apicales qui se colorent positivement pour la vimentine phosphorylée. Pour analyser le plan de division des cellules gliales radiales apicales, la double coloration pour la vimentine et Tpx2, une protéine associée aux microtubules qui peut être utilisée pour visualiser le fuseau mitotique et les processus apicaux pendant la migration nucléaire interkinétique peut être effectuée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des organoïdes de type cerveau antérieur hautement standardisés et homogènes à partir de cellules souches pluripotentes humaines.

Cette technique facilite l’étude des aspects spécifiques à l’homme des troubles neurodéveloppementaux à l’aide d’un modèle cellulaire 3D complexe disposé de manière spécifique aux tissus neuronaux. Une fois la technique maîtrisée, ces organoïdes corticaux peuvent être utilisés pour diverses applications, telles que les études neurodéveloppementales, évolutives ou de fonction génique, y compris la modélisation de maladies et potentiellement des tests de médicaments ou de thérapie.