Name: Génération de type prosencéphale standardisées et reproductibles organoïdes cérébrale de l’homme induites par les cellules souches pluripotentes (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Découvrez une méthode standardisée pour générer des organoïdes cérébraux de type prosencéphale à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Cette technique permet d'étudier le développement cortical précoce avec une reproductibilité élevée.

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Le travaux ont été subventionnés par le ministère de la Science de l’Innovation et la recherche du Nord-Westphalie (Junior Research Group) et ERA-NET NEURON, troubles du développement neurologique JTC 2015, tige-MCD.

1. génération des agrégats de l’iPSC
<ol><li>Génération des cultures monocouches de cellules individuelles des colonies de l’iPSC<ol>
<li>Préparer une plaque de 6 puits d’extrait (BME) enduit de membrane basale. Décongeler les Afro-Caribéens sur glace à 4 ° C pendant 2-3 h, diluez-la avec Modified Eagle Medium F12 de Dulbecco froid (DMEM-F12 ; 01:50 dilution), couvrir la plaque avec 1 mL/puits de la solution diluée d’afro-caribéens et conservez la plaque pendant une nuit à 4 ° C.</li>
		<li>Aspirez le milieu et laver les colonies iPSC intacte d’au moins 2 puits d’une plaque de 6 puits avec 0,5 mM EDTA dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) deux fois avant l’incubation des colonies avec 0,5 mM l’acide éthylènediaminetétraacétique (EDTA) dans du PBS pendant 4 min à température ambiante (RT). Aspirer la solution d’EDTA et détacher délicatement les colonies en les lavant au dessus du fond du plat avec 5 mL de milieu DMEM-F12. Leur rassemblement dans un tube de 15 mL et les pellets par centrifugation (4 min à 1 200 g à la droite). Remarque : CISP reprogrammé de fibroblastes disponibles dans le commerce a été utilisé avec succès10.</li>
		<li>Aspirer le surnageant et incuber les colonies iPSC avec 500 µL de réactif de dissociation cellulaire pendant 6 min à 37 ° C.</li>
		<li>Pipette de la suspension cellulaire plusieurs fois doucement vers le haut et vers le bas avec une pipette de 1 mL pour briser les grappes de cellules restantes en cellules individuelles.</li>
		<li>Ajouter 4 mL de DMEM-F12 à la suspension de cellules pour diluer le réactif de dissociation cellulaire.</li>
		<li>Faire tourner les cellules vers le bas à 1 200 x g pendant 4 min à température ambiante.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules dans 2 mL d’iPSC additionné de 5 µM Y-27632 et graine de cellules dans un puits d’une plaque de 6 puits BME enduit. Remarque : Utiliser le support de l’iPSC spécifié dans la Table des matières pour un iPSC des cultures monocouches de cellules individuelles.</li>
		<li>Le jour suivant, remplacez le milieu frais iPSC milieu dépourvu de Y-27632. De là, continuer à la culture des cellules, changer le support de tous les jours jusqu'à ce que le CISP est 100 % anastomosé. Selon la lignée cellulaire et la confluence des puits de départ, cela va prendre entre 2 à 4 jours.</li>
		<li>Une fois confluente, passage le CISP. Aspirer le support et appliquez 500 µL de réactif de dissociation cellulaire sur les cellules.</li>
		<li>Incuber les cellules pendant 5-10 min à 37 ° C. En faisant doucement tourner la plaque pour détacher les cellules.</li>
		<li>Laver les cellules du puits à l’aide de 2 mL de DMEM-F12 et à leur rassemblement dans un tube de 15 mL. Ajouter DMEM-F12 pour un volume total de 5 mL.</li>
		<li>Tournez en bas des cellules à 1 200 g pendant 4 min à RT et aspirer le surnageant.</li>
		<li>Les cellules des graines dans iPSC additionné de 5 µM Y-27632 en 2:1 ratio de 1:4 sur un BME enduit plaque 6 puits (2 mL/puits de moyenne).</li>
		<li>Continuer de culture des cellules pour 2 à 5 jours et changer l’iPSC milieu dépourvu de Y-27632 tous les jours. Une fois confluentes, passage CISP (mesures 1.1.4-1.1.8). Remarque : Le CISP au moins 2 passages de la culture comme une monocouche dans le milieu de l’iPSC spécifié dans la Table des matières avant de les utiliser pour la génération des agrégats iPSC pour permettre les cellules de s’adapter à des conditions de culture.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Utiliser des cultures monocouches iPSC lorsqu’ils sont confluents de 70 à 90 % pour la génération des agrégats de l’iPSC. Remarque : iPSC adapté pour les conditions de culture comme cellules individuelles sont moins sujettes au stress qui mène à la mort cellulaire lors de la procédure de la dissociation et l’agrégation. Des cultures monocouches iPSC souhaitent afficher la morphologie typique pluripotentes qui ne présentaient pas de différenciation. Tester les cultures sur une base régulière pour contamination par mycoplasmes. Travailler uniquement avec des cultures iPSC exempt de mycoplasmes.<ol>
<li>Aspirer le milieu de culture, d’un puits d’une plaque de 6 puits et appliquer 500 µL de réactif de dissociation cellulaire sur les cellules.</li>
		<li>Incuber les cellules pendant 5-10 min à 37 ° C. En faisant doucement tourner la plaque pour détacher les cellules.</li>
		<li>Laver les cellules du puits à l’aide de 2 mL de DMEM-F12 et à leur rassemblement dans un tube de 15 mL. Ajouter DMEM-F12 pour un volume total de 10 mL.</li>
		<li>Pour le comptage des cellules, prendre 25 µL de la suspension cellulaire et mélangez-le avec 25 µL de trypan bleu pour marquer les cellules mortes. Compter les cellules vivantes à l’aide d’une chambre de comptage.</li>
		<li>Recueillir suffisamment de cellules (4 500 cellules / iPSC agrégation) de la suspension de cellules dans un tube de 15 mL.</li>
		<li>Tournez en bas des cellules à 1 200 g pendant 4 min à RT et aspirer le surnageant.</li>
		<li>Remettre en suspension les cellules dans un volume approprié de l’iPSC additionné de 50 µM Y-27632 d’obtenir 4 500 cellules vivantes par 150 µL. Remarque : À l’aide d’une forte concentration de Y-27632 (50 µM) est essentiel à la survie de la CISP.</li>
		<li>Plaque 150 µL à chaque puits de basse-attachment 96 puits U fond plat et placez-le dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2. Remarque : Lors de la génération des agrégats de l’iPSC, considérer qu’organoïdes au moins 6 sont nécessaires pour contrôler la qualité au jour 20 (voir la Section 5).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. l’induction du neuroectoderme antérieur
<ol><li>Suivre de près les changements de morphologie des agrégats iPSC chaque jour au microscope de la culture de tissus à l’aide d’un 4 X ou 10 X lentille de puissance. Observer au jour 1, agrégats de cellules avec des frontières claires. Continuer d’agrégats iPSC culture dans l’incubateur à 37 ° C et 5 % de CO2. Remarque : Un certain nombre de cellules/puits mort est normal et n’affectera pas la génération organoïde.</li>
	<li>Les agrégats de l’iPSC à partir de jour 2 et en continuant avec chaque autre jour en aspirant doucement environ 2/3 du milieu sans déranger les agrégats de cellules au fond de l’alimentation. Ajouter une supplémentaire 100 µL de milieu iPSC dépourvu de Y-27632. Remarque : Dans les 4-6 jours les agrégats de cellules seront 350-450 µm de diamètre et présentent des bords lisses.</li>
	<li>À ce stade, piscine la cellule regroupe avec une pointe de pipette de coupe 100 µL dans un plat de fixation basse 6 cm (maximum 20 agrégats/plat) dans un milieu d’induction corticale contenant DMEM-F12 avec supplément de N2 (1 : 200), Supplément de B27 (1/100), glucose (0,2 mg/mL), cyclique l’adénosine monophosphate cyclique (cAMP ; 0,15 µg/mL), de 0,5 % non essentiels des acides aminés (NEAA), 1 % L-alanyl-L-glutamine, héparine (10 µg/mL) et les composés LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM) et inhibiteur de la voie Wnt réponse-1 (IWR-1) (10 µg/mL). Nourrir les agrégats de cellules en changeant le milieu corticale induction 3 jours après les transférer sur le plat de 6 cm.</li>
	<li>Suivre de près les changements morphologiques durant l’induction corticale au microscope de la culture de tissus à l’aide d’une lentille de puissance X 4. Remarque : Après 4-5 jours en milieu inducteur corticale, bords des agrégats cellulaires devraient commencer à éclaircir à la surface, ce qui indique la différenciation neuroectodermique. À ce stade, une organisation radiale d’un épithélium pseudostratifié émerge. Passez à la Section 3 pour incorporer les agrégats de cellules dans une matrice BME.</li>
</ol>3. incorporation de neuroectodermique regroupe en un échafaudage de matrice
<ol><li>Décongelez les Afro-Caribéens sur glace à 4 ° C pendant 2-3 h. Aliquot BME non dilué dans une quantité suffisante.</li>
	<li>Préparer une feuille de film plastique paraffine pour la procédure d’incorporation. Couper le film plastique paraffine à l’aide de ciseaux stériles en 4 cm x 4 cm de large morceaux, mettre un morceau de plastique film de paraffine sur un bac vide 100 µL de pointe pour 100 conseils µL et appuyez avec un doigt ganté pour que les petites fossettes dans la feuille de film plastique paraffine sont créés (1 di mple/cellule agrégation nécessaire). Nettoyer le film plastique paraffine avec l’éthanol à 70 % et irradient de lumière UV (puissance : 15 watts, longueur d’onde : 435 nm) sous le banc stérile fermé pendant 30 min.</li>
	<li>Transférer chaque agrégat de cellules dans un petit renfoncement de la feuille de film plastique paraffine en utilisant un embout de coupe 100 µL avec 1,5 à 2 mm de diamètre d’ouverture. Dans le cas que de deux agrégats de cellules sont fusionnées, ne se séparent pas eux, mais transférer ensemble sur une fossette.</li>
	<li>Aspirer doucement le milieu entourant les agrégats de cellules à l’aide d’un non circoncis 100 µL de pipette. Remarque : Veillez à ne pas à sucer les agrégats de cellules dans la pointe, car cela endommagerait les agrégats.</li>
	<li>Ajouter 40 µL de BME non dilué à chaque agrégat de cellules.</li>
	<li>Position de chaque cellule agrégée dans le milieu de la BME drop à l’aide d’une pointe de pipette 100 µL non circoncis. Remarque : Être très attention à ne pas endommager le neuroépithélium en développement avec l’embout de la pipette.</li>
	<li>Avec précaution, transférer la feuille de film plastique paraffine à l’aide d’une pince stérile dans une boîte de Pétri de 10 cm (ou un autre plat de culture cellulaire suffisant) et placer la capsule dans l’étuve pendant 15-20 min permettre les afro-caribéens se solidifier.</li>
	<li>Pendant ce temps, préparer un plat de fixation basse 6 cm contenant 5 mL de milieu inducteur corticale.</li>
	<li>Après la polymérisation de l’afro-caribéens, enlever les gouttelettes contenant des agrégats de cellules de la feuille de film plastique paraffine. Retournez le film plastique paraffine à l’aide de la pince stérile et appuyer doucement sur les agrégats de cellules dans le légèrement incliné (30 ° environ) basse-fixation 6 cm plat jusqu'à ce que les gouttelettes tombent en bas de la feuille de film plastique paraffine. Transférer un maximum de 16 agrégats cellulaires dans un plat de 6 cm.</li>
	<li>Continuer à incuber les agrégats de cellules à 37 ° C.</li>
</ol>4. génération du prosencéphale-type organoïdes d’agrégats neuroectodermique
<ol><li>Un jour après l’incorporation dans une matrice BME, placer organoïde Pétri sur un agitateur basculant de culture cellulaire avec un angle d’inclinaison de 5 ° et 14 tr/min, installé dans un incubateur de culture cellulaire.</li>
	<li>Moniteur organoids tous les jours. Structures neuroépithéliales homogène en boucle se développent progressivement après incorporation dans une matrice BME.</li>
	<li>Lorsque les structures de boucle neuroépithéliales sont visibles, changer le support au moyen de différenciation organoïde contenant DMEM-F12 avec supplément de N2 (1 : 200), Supplément de B27 (1/100), glucose (0,2 mg/mL), cAMP (0,15 µg/mL), 0,5 % NEAA, 1 % L-alanyl-L-glutamine, insuline (2,5 µg/mL)</li>
	<li>Remplacer le moyen de différenciation organoïde tous les 3-4 jours jusqu'à ce que le point de temps de différenciation souhaitée est atteinte. Fixer ensuite l’organoïdes (voir la Section 5). Remarque : Parfois, les tissus peuvent présenter des bourgeons du tissu translucide optiquement sans structures de boucle. Bien que ce n’est pas idéal, c’est sans incidence sur le développement des structures corticales. Les organoids peuvent être cultivées dans un milieu de différenciation organoïde jusqu'à 40 jours. Pour des périodes de culture prolongée (40 à 100 jours) le moyen de différenciation organoïde peut être complété par 01:50 BME pour augmenter la complexité du tissu et avec le BDNF GDNF permettre neuronale survie et maturation14,15.</li>
</ol>5. fixation et Validation du prosencéphale-type organoïdes
<ol><li>Pour la validation, percevoir 6 organoïdes au 20e jour. Utiliser 3 organoïdes pour l’isolement de l’ARNm et analyses PCR. Transférer les 3 organoïdes supplémentaires à une plaque de 24 puits contenant du PBS à l’aide d’une pointe de pipette de coupe de 1 mL avec une ouverture de 3 à 3,5 mm pour fixation et analyses immunocytochimiques séquentielle.</li>
	<li>Lavez l’organoïdes deux fois en aspirant le PBS avec soin et son remplacement par PBS frais à l’aide d’une pipette de 5 mL. Fixer l’organoïdes pendant 15 minutes au froid 4 % paraformaldéhyde (PFA) (pH 7,4). Mise en garde : Méfiez-vous que PFA est un carcinogène humain connu. Tout travail doit se faire sous une hotte chimique portant des gants en nitrile. Il est recommandé de porter des lunettes de sécurité. Formaldéhyde peut causer des dommages irréversibles à la cornée.</li>
	<li>Aspirer la PFA soigneusement et laver trois fois à l’aide de PBS de la température ambiante pendant 10 min.</li>
	<li>Remplacer le PBS avec une solution de saccharose 30 % (wt/vol, axée sur les PBS) et stocker les échantillons à 4 ° C pour permettre organoïdes déshydrater. Organoïdes peut être conservée pendant 7 jours jusqu'à ce que la poursuite de la procédure.</li>
	<li>Un jour après la fixation, tache avant l’organoïdes déshydratée en ajoutant le bleu trypan à environ 01:50 pendant 10 min permettre la visualisation de l’organoids au cours de la procédure de cryosectioning.</li>
	<li>Préparer le milieu d’enrobage contenant 10 % de saccharose, gélatine de 7,5 % wt/vol dans du PBS et elle chauffé à 75 ° C jusqu'à ce qu’il est liquide.</li>
	<li>Remplacer 30 % solution sucrée avec le milieu d’inclusion et transférer la plaque 24 puits sur une plaque chauffante (60 ° C) pendant 15 min équilibrer l’organoïdes.</li>
	<li>Couvrir le fond des moules avec une couche de médias incorporation incorporation et placez-les sur la glace à se polymériser.</li>
	<li>Transférer l’organoïdes de la plaque 24 puits à l’enrobage moule contenant le milieu d’enrobage polymérisé, ajouter un milieu d’enrobage supplémentaire sur le dessus afin que les organoïdes sont couverts et placer le moule rapidement dans un 100 % éthanol/neige carbonique gel bain ( température doit être comprise entre -30 à-50 ° C) pendant au moins 1 min à choc-gel.</li>
	<li>Placer le moule avec pinces sur glace carbonique temporairement et soit conserver que les à-80 ° C ou directement procéder à cryosectioning.</li>
	<li>Cryosection organoïdes à 20 µm d’épaisseur et de percevoir les sections sur les lames de microscope, gardant suivre l’ordre des sections sur les diapositives (absorption séquentielle). Permettre aux sections à sécher sur des lames pendant plusieurs heures, avant leur stockage à-80 ° C ou d’effectuer directement la coloration immunocytochimique.</li>
</ol>

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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Cerveau organoïdes représentent un outil puissant pour l’étude de développement de cerveau humain in vitro car elles fournissent le contexte de l’espèce concernée et l’arrangement 3D complexe de cellules dans un contexte de tissu. Avec cela, ils combler le fossé entre les modèles animaux non humains et techniques de culture cellulaire réductionniste humaine monocouche à deux dimensions. Leurs applications sont, cependant, entravées par un manque de reproductibilité9. Nous avons développé un protocole organoïde prosencéphale-type, qui surmonte la grande variabilité de l’échantillon à l’autre en combinant la capacité d’auto-organisation d’iPSC avec leur susceptibilité de structuration des facteurs. Plus précisément, le CISP ont été regroupés pour promouvoir l’auto-organisation et inhibent subséquemment des TGF-ß/SMAD signalisation promouvoir la différenciation du cortex dorsal en exposant les cultures à un BMP (LDN-193189) et un TGF-β (A83-01), inhibiteur du récepteur de type I. En outre, un composé inhibant la signalisation Wnt (IWR) afin d’éviter posteriorization a été appliqué. Contrairement à organoïde cérébrale « intrinsèque » protocoles19, qui se fondent sur l’auto-assemblage sans contrôle externe donnant lieu à organoïdes de cerveau assez hétérogènes et présentant des variations de lot important (mesurée par l’efficacité de polarisation l’ectoderme neural formation15), le protocole décrit ici de façon reproductible génère homogène du prosencéphale spécifiques organoïdes de CISP humaine.
Ces organoïdes du prosencéphale-type peuvent être utilisés pour une variété d’applications telles que les études sur le développement neurologique, études évolutives, y compris les études de fonction de gènes, modélisation de la maladie et, éventuellement, des fins de test et thérapeutiques de médicaments. Cependant, le protocole est plus approprié d’examiner les aspects précoces du développement cortical. Nous avons par exemple utilisé le prosencéphale-type organoïdes pour examiner des aspects propres à l’homme du comportement vRGC. Plus précisément, des changements pathophysiologiques associés à une forme sévère de lissencéphalie, une malformation corticale humaine caractérisée par une absence quasi totale de pliage corticale, a été adressée. Que certains aspects de cette maladie peuvent être modélisés chez la souris, comme le cerveau de souris est naturellement lissencephalic. Lorsque vous appliquez le système organoïde à lissencéphalie dérivé de patient CISP, nous pourrions sûrement récapituler les aspects propres à l’homme de la maladie et identifier les mécanismes sous-jacents. Plus précisément, nous pourrions démontrer qu’organoïdes dérivé de patient montrent une réduction significative de taille provoquée par un commutateur de symétrique à la division cellulaire asymétrique des vRGCs. Ce commutateur a été associé à des modifications dans l’organisation du réseau de microtubules des vRGCs, une perturbation de l’architecture de la niche VZ et altération de l’expression des molécules d’adhérence cellulaire, conduisant à une activation altérée de la N-cadhérine/β-caténine signalisation d’axe de10. Note : règlement de β-caténine-dependent des modes de division vRGC a été suggéré d’être spécifiques à l’homme comme la surexpression de la β-caténine chez la souris conduit à l’expansion du cortex tangentielle et par la suite corticales pliant20. Ainsi, nos résultats mettent en évidence que le système d’organoïde prosencéphale-type représente un outil prometteur pour étudier de manière quantifiable, les aspects spécifiques à l’humain du développement cortical début in vitro.
Un défi majeur pour l’avenir est de maintenir l’homogénéité de l’organoïdes à travers des périodes prolongées afin d’atteindre les phénotypes neurones plus matures. Cela pourrait être réalisé par une ou plusieurs des éléments suivants : mise en culture l’organoïdes dans un bioréacteur système14, appliquant flottant échafaudages15, complétant le milieu de différenciation avec la croissance neurale ou facteurs de survie neuronale. Enfin, une augmentation maîtrisée dans la complexité du cerveau pourrait être obtenue en fusionnant l’organoïdes du prosencéphale-type avec organoïdes cérébrale de l’identité régionale différente21,22.
Pris ensemble, protocole organoïde prosencéphale-type présenté ici offre un outil fiable et facilement applicable pour la génération de premières structures sous-corticales in vitro. Le protocole donne lieu à du tissu cortical début très homogène sur plusieurs lignes de l’iPSC et peut être utilisé pour générer efficacement individu spécifique du tissu cortical. Ainsi, le système est particulièrement adapté aux applications nécessitant un haut degré d’homogénéité et de la reproductibilité telles que la modélisation de la maladie.

Le cerveau humain est clairement un des organes les plus complexes et est responsable de toutes les capacités intellectuelles humaines. Ainsi, une meilleure compréhension du développement du cerveau de l’homme spécifiques est un préalable essentiel à la compréhension des capacités cognitives humaines. Traditionnellement, les animaux transgéniques servaient comme organismes modèles pour étudier le développement du cerveau. Ces modèles fournis perspicacité fondamentale dans les principes du développement du cerveau. Nous savons maintenant qu’une caractéristique commune du développement du cerveau chez tous les mammifères est une chorégraphie précise de la prolifération des progéniteurs, neurogenèse et la migration neuronale. Il y a, cependant, des différences structurales significatives entre le cerveau des organismes modèles, comme les rongeurs et les humains, en particulier dans le néocortex. Les principaux mécanismes qui ont été proposés pour contribuer à l’évolution des primates corticales sont une prolifération accrue des cellules souches et progénitrices, ainsi que la génération de cellules gliales radiales externes (oRGCs), que l'on retrouve très rarement chez les rongeurs1 ,2,3.
Les méthodes de développement du cortex cérébral humain modèle incluent la génération de cellules progénitrices télencéphaliques dérivé de la CFP et les neurones de projection de cortex cérébral comme des cultures monocouches. Ces normalisés différenciation protocoles relire certains aspects du développement cortical humain tels que l’ordre temporel stéréotypée de la neurogenèse corticale4. Ils, cependant, relèvent du courts lorsqu’il s’agit de la récapitulation des processus de développement de l’organogenèse comme structuration spatiale et morphogenèse. Plus récents développements en biologie des cellules souches a conduit à la mise en place de cultures organoïde 3D du CSP, qui est en train de révolutionner la recherche in vitro humain organogenèse. Grâce à la capacité des entreprises de sécurité privées à s’organiser en structures organotypique, organoïdes différents, qui reflètent les principales propriétés structurales et fonctionnelles des organes, y compris celles du rein, tube digestif, le œil et le cerveau ont été établi5. Ces organoïdes contiennent plusieurs sous-types cellulaires spécifiques d’organes, qui regroupent et organisent dans l’espace très similaire pour les organes en développement in vivo5,6. En outre, la composition cellulaire, lignée relation et études de réseau de gènes unicellulaires RNA séquençage a révélé qu’organoïdes cérébrales humaines récapitulent fidèlement les aspects majeurs du développement du néocortex foetale humaine tels que les programmes d’expression de gène 7 , 8. Toutefois, un inconvénient majeur, qui a empêché leur application générale jusqu'à présent, était le grosses lot de variations et hétérogénéité organoïde-à-organoïde9.
Ici, nous fournissons un protocole détaillé pour un système de culture organoïde prosencéphale-types simples et standardisées. La principale caractéristique de ce système est qu’il génère efficacement et de façon reproductible organoïdes CFP-dérivé d’identité télencéphaliques dorsale presque exclusive. Le protocole est basé sur les méthodes utilisées dans nos récents Rapports cellule papier10. Il allie la capacité d’auto-organisation de CISP induction sélective du neuroépithélium corticale et robuste peut générer des cultures homogènes de tissu télencéphaliques dorsal début dans les 3 semaines. Le protocole s’appuie sur la stratégie de l’inhibition de Wnt qui guide la différenciation des CFP vers l’antérieur neuroectodermique lignée11,12 en combinaison avec la matrice incorporation, qui et de signalisation des SMAD rapportées antérieurement favorise la formation de structures neuroépithéliales grande et continue13. Nous avons utilisé avec succès la méthode décrite sur différentes lignes d’iPSC, avec plusieurs clones par individu. Nous avons montré que ce système est adapté pour des applications en aval, dans lequel la reproductibilité et l’homogénéité sont d’importance majeure comme la modélisation de la maladie. Lorsqu’elle applique le protocole de CISP dérivé de patients souffrant d’une grave malformation corticale, nous pouvions récapituler les caractéristiques pathologiques de la maladie en vitro et identifier de nouveaux mécanismes moléculaires conduisant à la phénotypique change de10. Nous suggérons que le protocole organoïde décrites peut être utilisé pour combler le fossé entre les cultures dérivées CFP corticale monocouche réductionniste et études in vivo , et qu’il s’agit d’un système fiable et stable de modèle basé sur la cellule pour simuler au début développement cortical humain sain ou malade en dehors du corps humain.

<table><tbody><tr><td>A83-01</td><td>StemGent</td><td>130-106-274</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27 Supplément</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>1 à 100</td></tr><tr><td>Extrait de membrane basale (par exemple Geltrex)</td><td>Gibco</td><td>A14132-02</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine monophosphate cyclique (AMPc)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td>0.15 &micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Réactif de dissociation cellulaire (TrypLE Express)</td><td>Gibco</td><td>12605028</td><td></td></tr><tr><td>Chambre de comptage, par exemple Fuchs-Rosenthal</td><td>Karl Hecht</td><td>40449001</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Carl Roth</td><td>HN06.3</td><td>0,2 mg/mL</td></tr><tr><td>DMEM-F12 L-Glutamin</td><td>Gibco</td> 11320033 Moules <td>d’enrobage</td><td></td></tr><tr><td>(Tissue-Tek Cryomold)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>Acide éthylènediaminetétraacétique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6511</td><td>0,5 mM&nbsp ;</td></tr><tr><td>Gelantin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Héparine</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-25KU</td><td>10 ug/mL</td></tr><tr><td>Inhibiteur de la réponse WNT (IWR-1)</td><td>Enzo Life Science</td><td>BML-WN103-0005</td><td>10 ug/mL</td></tr><tr><td>Insuline</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td>2.5 &micro ; g/mL</td></tr><tr><td>Milieu IPSC pour cultures monocouches (Pluripro)</td><td>Cell Guidance Systems</td><td>MK01</td><td></td></tr><tr><td>L-alanyl-L-glutamine (GlutaMax)</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>1 %</td></tr><tr><td>Plaques de 6 cm à faible adhérence</td><td>Labomedic</td><td>2081646L</td><td></td></tr><tr><td>Plaques de 10 cm à faible adhérence</td><td>Labomedic</td><td>2081646O</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-171</td><td>180 nM</td></tr><tr><td>N2 Supplément</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>1 à 200</td></tr><tr><td>acides aminés non essentiels</td><td>Gibco</td><td>11140035</td><td>0,50</td></tr> %<tr><td>Paraformaldéhyde</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>4,00</td></tr> %<tr><td>Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)</td><td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Film plastique de paraffine (Parafilm)</td><td>MARQUE GMBH + CO KG</td><td>701606</td><td></td></tr><tr><td>Inhibiteur de ROCK Y-27632</td><td>Systèmes de guidage cellulaire</td><td>SM02-100</td><td>5 & micro ; M ou 50 & micro ; M</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tubes 15 mL</td><td>Corning Life Sciences</td><td>734-0451&nbsp ;</td><td></td></tr><tr><td>Lames de microscope, par exemple Superfrost Plus Lames de microscope</td><td>Thermo Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr><tr><td>Culture tissulaire Plaque à 6 puits</td><td>Falcon</td><td>734-0019</td><td></td></tr><tr><td>Culture tissulaire à 24 puits</td><td>Falcon</td><td>734-0949</td><td></td></tr><tr><td>Coloration bleue trypan</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Plaque à couche lipidique à 96 puits à liaison ultra-faible A-U96</td><td>Amsbio</td><td>AMS.51011610</td><td></td></tr><tr><td>Anticorps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sox2</td><td>R& D Systems</td><td>MAB2018</td><td></td></tr><tr><td>Pax6</td><td>Covance</td><td>PRB-278P-100</td><td></td></tr><tr><td>Otx2</td><td>R& D Systems</td><td>ab9566</td><td></td></tr><tr><td>Emx1</td><td>Sigma</td><td>HPA006421</td><td></td></tr><tr><td>N-cadhérine</td><td>BD</td><td>610921</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Life Tech</td><td>61-7300</td><td></td></tr><tr><td>P-Vimentin</td><td>Biozol</td><td>D076-3</td><td></td></tr><tr><td>Tpx2</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB500-179</td><td></td></tr><tr><td>Acétylé &alpha ;-tubuline&nbsp ;</td><td>NEB/CS</td><td>5335</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 anti ms</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 anti rb</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555 anti ms</td><td>Invitrogen</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555 anti rb</td><td>Invitrogen</td><td>A21429</td><td></td></tr></tbody></table>

génération de type prosencéphale standardisées et reproductibles organoïdes cérébrale de l’homme induites par les cellules souches pluripotentes

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

Le cortex humain est hautement développé et présente une structure complexe avec des domaines fonctionnels spécifiques, fournissant des fonctions cérébrales supérieures, comme la cognition. Efforts pour étudier le développement du cortex cérébral humain ont été limités par la disponibilité de systèmes modèles. Traduire les résultats des études sur les rongeurs pour le système humain est limitée par les différences entre les espèces et les études sur les tissus humains primaires sont entravés par le manque de disponibilité de tissus mais aussi des préoccupations d’ordre éthique. Mise au point récente dans la technologie (CFP) les cellules souches pluripotentes humaines incluent la génération des trois dimensions (3D) self-organizing organotypique systèmes de culture, qui ressemblent à un certaine mesure spécifiques à l’humain cerveau développement in vitro. Actuellement, différents protocoles sont disponibles pour la génération de cerveau entier ou région du cerveau spécifique organoïdes. La méthode pour la génération de type homogène et reproductible du prosencéphale organoïdes d’induite par la CFP (iPSC), qui nous a été établies et décrire ici, combine la capacité intrinsèque de la CFP à s’organiser avec différenciation guidée vers le neuroectodermique antérieure lignée et la matrice incorporation à soutenir la formation d’un neuroépithélium continue. Plus précisément, ce protocole implique : (1) la production d’agrégats de l’iPSC, y compris la conversion de l’iPSC colonies à une culture de monocouches confluentes ; (2) l’induction du neuroectoderme antérieur ; (3) l’incorporation des agrégats neuroectodermique dans un échafaudage de matrice ; (4) la génération du prosencéphale-type organoïdes de neuroectodermique agrégats ; et (5) la fixation et la validation du prosencéphale de type organoïdes. À ce titre, ce protocole prévoit un système facilement applicable pour la génération du tissu cortical dérivés iPSC standardisée et reproductible des structures in vitro.

Protocolede organoïde prosencéphale-type normalisé décrit ici typiquement génère très homogène organoïde cultures quasi-exclusivement dorsale identité corticale de CISP humaine dans les 20 jours de culture (protocole décrit à la Figure 1 A). il est recommandé d’effectuer plusieurs étapes de contrôle de la qualité au cours de l’évolution temporelle du protocole, défini ici comme : « aller » (poursuivre le processus de différenciation) et « no-Go » (cultures sous-optimal, il est recommandé d’interrompre le traitement par lots) (Figure 1 ). Il est également conseillé de documenter chaque étape de contrôle de la qualité bien en prenant des images et des notes.
La première étape critique dans la production du cerveau de type organoïdes est de commencer avec des cultures de qualité iPSC. Il est important que le CISP ne contiennent pas des fractions plus de cellules différenciées. Utilisez uniquement des cultures iPSC qui présentent comme une monocouche homogène de cellules indifférenciées à la population de départ (figure 1 b, C). En outre, il est essentiel de commencer par le nombre de cellule donnée pour l’agrégation de l’iPSC. La première inspection détaillée des agrégats iPSC doit être effectuée au jour 2. À ce stade, les agrégats devraient ont formé bourgeons cellule compacte avec bords lisses (« go ») tandis que les agrégats qui apparaît irréguliers ou agrégats avec cavités devraient être mis au rebut (« no-Go ») (Figures 1, E). La prochaine étape de contrôle de la qualité doit être effectuée au jour 10 du protocole. À ce moment, les agrégats de cellules devraient montrer tissu lisse et translucide optiquement sur la surface extérieure représentant induction du neuroectoderme (« go »), alors que l’absence de tels tissus indique sous-optimale induction neurale (« interdites ») (chiffres 1F, G ). Seulement ces agrégats qui présentent une surface translucide (Figure 1F) doivent être intégrés dans la matrice de BME. Une fois incorporé, l’organoïdes corticale développeront structures ressemblant à boucle continue neuroépithéliales, qui seront développera rapidement. Analyser l’efficacité de l’induction corticale au jour 15 et 20 en examinant si les organoïdes ont développés l’ectoderme neural polarisée comme illustré dans la Figure 1H, J (« aller »). Dans le cas qu’organoïdes n’ont pas développé ces bourgeons neuroépithéliales (« no-Go » comme illustré dans la Figure 1,I, K), critique, réviser les mesures de contrôle de la qualité effectuées pour le dépannage. Quand étroitement conformément au protocole, hautement standardisés organoïde lots sera généré (Figures 2 a, B), qui montrera l’homogénéité ≥ 90 % polarisé de formation de l’ectoderme neural dans et entre les lots (Figure 2C). Une erreur commune menant à l’efficacité variable de formation de l’ectoderme neural polarisée est d’augmenter le nombre de cellules de départ pour l’agrégation de l’iPSC ou iPSC de basse qualité à commencer par certaines cultures comme mycoplasma contaminées des cultures ou des cultures qui contiennent les cellules différenciées.
Une validation détaillée de l’identité télencéphaliques dorsale de l’organoïdes généré doit être exécutée au 20e jour. À cette fin, 3 organoïdes devraient être fixés et utilisées pour les analyses de l’immunofluorescence. Stratifié neuroépithéliales boucles (Figure 3A) expriment le marqueur de cellules souches neurales Sox2 (Figure 3B, D), les marqueurs du prosencéphale Pax6 et Otx2 (Figures 3, E As EventArgs) et le marqueur de cortex dorsal Emx1 (Figure 3 F). ces boucles corticales se caractérisent également par une localisation apicale de la N-cadhérine et ZO-1 (Figures 3, H), cellules gliales radiales de zone ventriculaire (vRGC)-dérivé de microtubules, qui s’étend de l’apical à la partie basale de la (structures Figure 3 j’ai), et apical situé divisant les cellules qui colorent positives pour la vimentine phosphorylée (p-vimentine, Figure 3J). La mort cellulaire peut être présente à l’intérieur des structures organoïde. L’apoptose central est normal et n’affecte pas le développement du tissu cortical. En outre, 3 organoïdes devraient être utilisés pour évaluer l’homogénéité du protocole par analyses d’expression génique. Organoïdes du cerveau de type montrent l’expression des marqueurs du prosencéphale dorsale (FoxG1, Otx2, Emx1), tandis que l’expression du mésencéphale (FoxA2, Pax5) et les marqueurs de cerveau postérieur (HoxA4, HoxB2, HoxB6, HoxB4) n’est pas détectable (Figure 3K).
Lots d’organoids contrôle de la qualité peuvent être utilisés pour diverses applications comme les analyses de l’avion de la division des cellules gliales radiales apicales. À cette fin, nous vous suggérons d’effectuer la double coloration à l’aide d’anticorps anti-vimentine-p et Tpx2 (Figure 3-J). P-vimentine est phosphorylé par CDK1 durant la mitose et se trouve dans le noyau, marquant ainsi tous les noyaux dans la phase mitotique16. Tpx2 est une protéine de microtubules associés qui peut visualiser le fuseau mitotique et les processus apicales au cours de la migration nucléaire interkinetic17,18. En utilisant ces marqueurs, trois aspects de la vRGC division peuvent en principe être analysées : (I) si cell division a lieu du côté apical, (II) si le plan de division est aligné vertical (indicateur symétrique la division cellulaire), horizontale ou oblique () indiquant la division cellulaire asymétrique) à la surface apicale et (III) si les centres d’Organisation des microtubules se forment normalement.
Organoïdes peuvent être également plus différenciés dans des structures plus complexes de tissu cortical organisée et stratifié. Structures sous-corticales dans jour 35 ± 2 organoïdes sont composés d’une zone ventriculaire (VZ)-, une zone sous-ventriculaire (SVZ) intérieure et extérieure, ainsi qu’une plaque corticale (CP) - comme la zone. Au sein de la VZ et la SVZ intérieur et extérieur, vRGCs, progéniteurs intermédiaires (IPs) et des cellules qui rappelle oRGCs peuvent être identifiés. En outre, la formation initiale d’un cortex couches peut être observée dans la zone de CP-comme avec les neurones corticaux profonds exprimant Tbr1 et Ctip2 à l’intérieur et les neurones corticaux supérieurs exprimant Satb2, ainsi que de cellules exprimant reeline dans les régions externes10.
<img alt="Diagramme de formation des organoïdes corticaux, agrégation iPSC, induction neuronale, résultats de microscopie." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56768/56768fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figure 1 : Un aperçu schématique du protocole organoïde et illustration de « go » et « interdites » critères. (A) aperçu schématique du protocole. Support de CI : support induction corticales ; CD : moyen de différenciation corticale. B–(C) Image d’une culture monocouche confluente iPSC de 90 % optimale (B) et une culture de non-indiqué iPSC présentant la différenciation (C). (D–E) Un agrégat de l’iPSC optimal à la taille, la densité des cellules et aspect de surface (D) et deux agrégats de cellules « interdites » exposer chaque cellule spares cavités (E, agrégat supérieure) ou irrégulier (E, agrégat inférieur) les bords deux jours après l’agrégation cellulaire. (F–G) Agrégats de cellules présentant des bords lisses et translucides (F) et des agrégats cellulaires défaut optique de compensation (G). La ligne jaune est visualiser la zone d’intérêt. (H–K) Un organoïde optimale avec boucles continues neuroépithéliales (H, J) et un organoïde qui n’a pas pu développer radialement organisé neuroectoderme (I, K) photographié au jour 15 et 20, respectivement. Barreaux de l’échelle, B-C 500 µm ; D-K 200 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56768/56768fig1large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Stades de croissance des organoïdes neuraux et comparaison des graphiques à barres ; Etude sur la radialisation du neuroépithélium." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56768/56768fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figure 2 : Homogénéité et la reproductibilité du protocole du prosencéphale-type organoïde. (A–B) Images représentatives de lumineux-zone d’organoïdes d’un lot au jour 15 (A) et 26 (B). (C) des analyses quantitatives des organoïdes au jour 20. Organoïdes qui présentent à la surface externe d’un neuroépithélium, reconnaissable dans le vif des champs comme tissu superficiel optiquement clair avec une frontière claire et une preuve de l’architecture cellulaire radial ont été quantifiés (n = 3 par ligne iPSC avec au moins 16 organoïdes par Experiment). Barres d’échelle, A-b : 500 µm. erreur bars ± SD. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56768/56768fig2large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Diagramme de différenciation neuronale avec immunomarquage ; Marqueurs Sox2, Pax6, DAPI en sections organoïdes." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56768/56768fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figure 3 : Validation du prosencéphale-type organoïdes au 20e jour. (A–J) Caractérisation immunocytochimique d’organoïdes. Organoïdes organisent dans plusieurs boucles neuroépithéliales (A, Eosine au DAPI). Stratifié de cellules organisées au sein de l’express de boucles neuroépithéliales le marqueur de cellules souches neurales Sox2 (B, D), les marqueurs du prosencéphale Pax6 (C, D) et Otx2 (E), ainsi que le marqueur du prosencéphale dorsale Emx1 (F). Les structures de boucle corticale expose une ceinture fine jonction adhérentes côté apicale au maximum avec l’accumulation de la N-cadhérine (G) et zona occludens protein 1 (ZO-1 ; H). microtubule des ventriculaire CGR réseaux (colorées par acétylés α-tubuline, Ac-Tub) s’étendent de l’apicale de la partie basale des structures de boucle (j’ai). Les cellules en prolifération exprimant p-vimentine (p-Vim) sont trouvent à la surface apicale. Les fuseaux mitotiques sont colorées par Tpx2. supérieur grossissement image représentative d’une verticale et un plan de division horizontale sont affichés sur la droite (J). (K) analyse de RT-PCR pour les facteurs de transcription spécifiques à une région au 20e jour de deux séries indépendantes d’organoïdes dérivé de 2 lignes différentes iPSC. FB : contrôle cerveau foetal ; AB : contrôle cerveau adulte. Barreaux de l’échelle, A-D 200 µm ; E-j’ai 10 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56768/56768fig3large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Épitope</td>
			<td>Dilution</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sox2</td>
			<td>1 - 300</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pax6</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Otx2</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Emx1</td>
			<td>1 - 50</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-cadhérine</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZO-1</td>
			<td>1 - 100</td>
		</tr>
<tr>
<td>P-vimentine</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tpx2</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Α-tubuline acétylée</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa488 anti ms</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa488 anti-rb</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa555 anti ms</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa555 anti-rb</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 1 : Anticorps pour le contrôle de la qualité d’organoïdes au 20e jour.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Apprêt</td>
			<td>Séquence</td>
		</tr>
<tr>
<td>Otx2 vers l’avant</td>
			<td>tgcaggggttcttctgtgat</td>
		</tr>
<tr>
<td>Otx2 inverse</td>
			<td>agggtcagagcaattgacca</td>
		</tr>
<tr>
<td>FoxG1 avant</td>
			<td>ccctcccatttctgtacgttt</td>
		</tr>
<tr>
<td>FoxG1 inverse</td>
			<td>ctggcggctcttagagat</td>
		</tr>
<tr>
<td>Emx1 avant</td>
			<td>agacgcaggtgaaggtgtgg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Emx1 inverse</td>
			<td>caggcaggcaggctctcc</td>
		</tr>
<tr>
<td>FoxA2 vers l’avant</td>
			<td>ccaccaccaaccccacaaaatg</td>
		</tr>
<tr>
<td>FoxA2 inverse</td>
			<td>tgcaacaccgtctccccaaagt</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pax5 avant</td>
			<td>aggatgccgctgatggagtac</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pax5 inverse</td>
			<td>tggaggagtgaatcagcttgg</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB2 avant</td>
			<td>tttagccgttcgcttagagg</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB2 inverse</td>
			<td>cggatagctggagacaggag</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxA4 avant</td>
			<td>ttcagcaaaatgccctctct</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxA4 inverse</td>
			<td>taggccagctccacagttct</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB4 avant</td>
			<td>acacccgctaacaaatgagg</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB4 inverse</td>
			<td>gcacgaaagatgagggagag</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB6 avant</td>
			<td>gaactgaggagcggactcac</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB6 inverse</td>
			<td>ctgggatcagggagtcttca</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 s avec impatience</td>
			<td>ttccttggaccggcgcaag</td>
		</tr>
<tr>
<td>inverse de 18 ans</td>
			<td>gccgcatcgccggtcgg</td>
		</tr>
</tbody></table>Tableau 2 : Primer et séquences d’amorces pour le profil d’expression génique.

Organoïdes cérébrales représentent un nouveau système modèle pour étudier au début cerveau humain développement in vitro. Cet article présente la méthodologie détaillée pour générer efficacement homogène du prosencéphale dorsale de type organoïdes à partir des cellules souches humaines pluripotentes induites notamment les étapes cruciales de caractérisation et validation.

Génération de type prosencéphale standardisées et reproductibles organoïdes cérébrale de l’homme induites par les cellules souches pluripotentes

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

L’objectif global de cette procédure est de générer des organoïdes de type cerveau antérieur hautement standardisés et reproductibles à partir de cellules souches pluripotentes humaines. Cette méthode est un outil puissant pour modéliser les mécanismes des NTZ de nouveau développement. En particulier, il peut aider à résoudre des questions clés associées à la genèse corticale humaine précoce.Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet de générer de manière standardisée et rapide du tissu cortical humain avec peu de variations entre les organoïdes individuels et les lots d’organoïdes. La technologie des organoïdes peut donner un aperçu du développement, de la structure et du fonctionnement du cerveau humain, en particulier pour les aspects que l’on ne trouve pas dans les modèles de cerveau des espèces inférieures. Pour générer des agrégats de cellules souches pluripotentes, lorsque les cultures de cellules souches atteignent 70 à 90 % de confluence, ajoutez 500 microlitres de réactif de dissociation cellulaire à un puits de la plaque de culture à six puits pour détacher les cellules.Les cellules souches pluripotentes induites, qui sont adaptées aux conditions de culture monocouche, sont un bon type de cellule pour générer des agrégats car elles sont moins sujettes à la mort cellulaire induite par le stress pendant la procédure de dissociation et d’agrégation. Après cinq à 10 minutes à 37 degrés Celsius, tapotez doucement la plaque et utilisez deux millilitres de DMEM/F-12 pour laver les cellules du fond du puits. Transférez la suspension cellulaire résultante dans un tube conique de 15 millilitres et portez le volume de la solution cellulaire à 10 millilitres avec plus de milieu DMEM/F-12.Après le comptage, transférez 4,5 fois 10 aux troisièmes cellules par agrégat de cellules souches pluripotentes dans un nouveau tube de 15 millilitres, et collectez les cellules par centrifugation. Nous suspendons la pastille dans le volume approprié de milieu de cellules souches pluripotentes, complété par un inhibiteur de roche micromolaire de 50 pour obtenir une cellule de 4,5 fois 10 à la troisième cellule par 150 microlitres de concentration moyenne. Ensuite, ajoutez 150 microlitres de cellules dans des puits individuels d’une plaque en U à faible fixation de 96 puits et placez la plaque dans un incubateur à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone.Pour surveiller l’induction du neuroectoderme antérieur, utilisez un microscope de culture tissulaire pour observer de près les changements morphologiques des agrégats de cellules souches pluripotentes chaque jour sous faible grossissement. Le premier jour, des agrégats cellulaires avec des bordures claires doivent être observés. Le deuxième jour, aspirez soigneusement environ les deux tiers du milieu, sans perturber les agrégats cellulaires au fond de chaque puits, et remplacez le milieu jeté par 100 microlitres de milieu de cellules souches pluripotentes fraîches.Entre quatre et six jours plus tard, lorsque les agrégats cellulaires atteignent 350 à 450 micromètres de diamètre et présentent des bords lisses, utilisez une pointe de pipette modifiée de 100 microlitres pour transférer jusqu’à 20 agrégats dans une seule plaque de culture de six centimètres contenant cinq millilitres de milieu d’induction corticale. Remplacer le milieu d’induction corticale par un milieu frais une fois tous les trois jours, en surveillant quotidiennement la morphologie des agrégats sous l’objectif 4X. Après quatre à cinq jours dans le milieu d’induction corticale, les bords des agrégats cellulaires devraient commencer à s’éclaircir à la surface, indiquant une différenciation neuroectodermique et l’organisation radiale d’un épithélium pseudostratifié devrait émerger.Pour intégrer les agrégats neuroectodermiques dans un échafaudage matriciel, décongelez l’extraction de la membrane basale sur de la glace pendant deux à trois heures. Pendant que l’extrait décongèle, utilisez des ciseaux stériles pour couper le film de paraffine plastique en un carré de quatre centimètres sur quatre pour 16 organoïdes, et placez chaque morceau de film sur un plateau vide de 100 microlitres de pointe de micropipette. Appuyez sur le film de paraffine avec le bout d’un doigt ganté pour faire apparaître de petites fossettes et nettoyez le film avec de l’éthanol à 70 %.Après avoir passé 30 minutes au rayonnement UV dans une enceinte de biosécurité fermée et stérile, utilisez une pointe de pipette modifiée de 100 microlitres avec une ouverture d’un millimètre et demi à deux millimètres pour transférer chaque agrégat cellulaire dans une fossette du film. Lorsque tous les agrégats ont été transférés, utilisez une pointe de pipette non coupée de 100 microlitres pour aspirer soigneusement le milieu de chaque fossette, et ajoutez 40 microlitres d’extrait de membrane basale non dilué à chaque agrégat cellulaire. Veillez à ne pas endommager les organoïdes par une manipulation brutale ou une aspiration dans la pointe de la pipette, car cela endommagerait le neuroépithélium en développement.Utilisez la pointe de la pipette pour positionner les agrégats au milieu de chaque goutte et utilisez une pince stérile pour transférer soigneusement la feuille de film de paraffine en plastique dans une boîte de Pétri de 10 centimètres. Placez le plat dans l’incubateur pendant 15 à 20 minutes. Pendant que l’extrait se solidifie, ajoutez cinq millimètres de milieu d’induction corticale frais dans une boîte de culture à faible attachement de six centimètres.À la fin de l’incubation, retournez la feuille de film de paraffine et utilisez une pince stérile pour presser doucement jusqu’à 16 gouttelettes polymérisées dans chaque plat de six centimètres. Ensuite, retournez les agrégats dans l’incubateur de culture cellulaire. Le lendemain, transférez les boîtes de culture organoïde sur un agitateur de culture cellulaire à bascule, incliné à un angle de cinq degrés à 14 tr/min à l’intérieur d’un incubateur de culture cellulaire, avec une surveillance quotidienne par microscopie optique, jusqu’à ce que les agrégats atteignent le stade de différenciation d’intérêt.Le 20e jour, utilisez une pointe de pipette modifiée d’un millilitre avec une ouverture de trois à trois millilitres et demi pour prélever six organoïdes des cultures d’agrégats. Placez trois des organoïdes dans un puits d’une plaque de 24 puits contenant 500 microlitres de PBS, et utilisez une pipette de cinq millilitres pour laver les organoïdes deux fois avec 500 microlitres de PBS frais par lavage. Après le deuxième lavage, fixez les organoïdes dans du paraformaldéhyde froid à 4 % pendant 15 minutes, suivi de trois lavages de 10 minutes dans du PBS à température ambiante et d’une dernière déshydratation pendant la nuit dans une solution à 30 % de saccharose à quatre degrés Celsius.Le lendemain, pré-colorez les organoïdes déshydratés avec une dilution de un à 50 Trypan Blue pendant 10 minutes pour permettre la visualisation des organoïdes pendant la procédure de cryosection, et remplacez le saccharose par un milieu d’enrobage fraîchement préparé. Chauffez la plaque sur un coussin chauffant à 60 degrés Celsius pendant 15 minutes pour équilibrer les organoïdes dans le milieu d’enrobage, et couvrez le fond d’un moule d’enrobage par organoïde avec un milieu d’enrobage frais. Placez le moule sur de la glace pour solidifier le milieu d’enrobage, transférez les organoïdes dans les moules d’enrobage et ajoutez du milieu d’enrobage frais jusqu’à ce que chaque organoïde soit recouvert.Ensuite, congelez les organoïdes dans un bain de congélation cryogénique à 100 % d’éthanol pendant au moins une minute, et utilisez un cryostat pour obtenir des sections de 20 micromètres d’épaisseur de chaque organoïde pour l’analyse immunocytochimique. Pour générer des organoïdes de type cerveau antérieur, utilisez uniquement des cultures IPSC qui se présentent comme une monocouche homogène de cellules indifférenciées dans la population de départ. Le deuxième jour, les agrégats devraient avoir formé des bourgeons cellulaires compacts aux bords lisses.Les agrégats du jour 10 doivent montrer des tissus lisses et optiquement lisses et optiquement translucides sur la surface externe, représentant l’induction du neuroectoderme. Si le protocole a été suivi de près, des lots d’organoïdes hautement normalisés qui démontrent une homogénéité supérieure ou égale à 90 % dans la formation de neuroectodermes polarisés à l’intérieur et entre les lots seront générés. L’analyse immunocytochimique des organoïdes du jour 20 révèle des boucles neuroépithéliales stratifiées qui expriment le marqueur de cellules souches neurales Sox2, les marqueurs du cerveau antérieur Pax6 et Otx2 et le marqueur cortical dorsal Emx1.Ces anses corticales sont en outre caractérisées par une localisation apicale de la N-cadhérine et du ZO-1, un microtubule dérivé des cellules gliales radiales de la zone ventriculaire, qui s’étend de la face apicale à la face basale des structures, et des cellules en division apicales qui se colorent positivement pour la vimentine phosphorylée. Pour analyser le plan de division des cellules gliales radiales apicales, la double coloration pour la vimentine et Tpx2, une protéine associée aux microtubules qui peut être utilisée pour visualiser le fuseau mitotique et les processus apicaux pendant la migration nucléaire interkinétique peut être effectuée. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des organoïdes de type cerveau antérieur hautement standardisés et homogènes à partir de cellules souches pluripotentes humaines.Cette technique facilite l’étude des aspects spécifiques à l’homme des troubles neurodéveloppementaux à l’aide d’un modèle cellulaire 3D complexe disposé de manière spécifique aux tissus neuronaux. Une fois la technique maîtrisée, ces organoïdes corticaux peuvent être utilisés pour diverses applications, telles que les études neurodéveloppementales, évolutives ou de fonction génique, y compris la modélisation de maladies et potentiellement des tests de médicaments ou de thérapie.

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Recherche

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologie du développement

La vidéo montre une méthode de génération d’organoïdes cérébraux humains à partir de cellules souches pluripotentes induites. Il montre comment la neurosphère forme une couche neuroectodermique, qui supprime la formation d’autres couches germinales. Les neurosphères sont intégrées dans une matrice de gel 3D et forment des bourgeons neuroépithéliaux. Lorsqu’ils sont incubés avec des organes organoïdes, ces bourgeons neuroépithéliaux se différencient en régions cérébrales spécifiques, ce qui...

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Génération de type prosencéphale standardisées et reproductibles organoïdes cérébrale de l’homme induites par les cellules souches pluripotentes (Vidéo) | JoVE Journal

Génération de type prosencéphale standardisées et reproductibles organoïdes cérébrale de l’homme induites par les cellules souches pluripotentes

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