Structuration microfluidique et suivi par fluorescence de la croissance bactérienne unicellulaire

Commencez par une culture bactérienne marquée par fluorescence ajoutée à un tampon sans carbone.

Centrifuger pour granuler les bactéries et jeter le surnageant.

Remettez le granulé en suspension dans un tampon frais sans carbone contenant un détergent doux.

L’absence de source de carbone arrête la croissance, tandis que le détergent empêche l’agglutination et maintient les cellules en suspension.

Chargez la suspension bactérienne dans une seringue et connectez-la à une pompe.

Injecter la suspension dans l’entrée d’une puce microfluidique contenant un canal avec des pièges encastrés dans le sol.

Retirez lentement le liquide de la sortie du canal.

Lorsque le liquide se retire, les forces capillaires guident les bactéries vers la sortie.

Dans ce processus, des cellules bactériennes uniques s’installent dans les pièges, ce qui entraîne un motif bactérien.

Rincez continuellement le canal avec un bouillon préchauffé et riche en nutriments.

Les bactéries reprennent leur croissance et forment des microcolonies à l’intérieur des pièges.

Utilisez la microscopie à fluorescence pour capturer des images en accéléré et analyser la croissance bactérienne dans un environnement contrôlé.

Pipetez un millilitre de milieu MOPS dans un flacon de centrifugeuse et ajoutez 10 microlitres de phosphate de potassium à 0,132 molaire.

Placez 100 microlitres de la culture de nuit dans le flacon de centrifugeuse et centrifugez la culture à 2 300 fois g pendant deux minutes. Jetez délicatement le surnageant pour remettre la pastille en suspension dans un millilitre de milieu MOPS frais avec 0,015 % de Tween 20 et 0,01 % de phosphate de potassium et chargez la suspension bactérienne dans une seringue d’un millilitre. Pour sécuriser la seringue et le raccord de la tubulure, insérez directement une aiguille dans la tubulure.

Montez maintenant la seringue sur la pompe à seringue et injectez la suspension dans la puce microfluidique par l’entrée située dans la partie amont du canal jusqu’à ce que la suspension recouvre la région du modèle avec des pièges. Réglez la pompe à seringue à un débit de 0,07 à 0,2 microlitre par minute pour retirer la suspension bactérienne et surveiller le processus de structuration à l’aide d’un logiciel de microscope. Une fois que le modèle a été structuré avec des cellules, augmentez le débit de prélèvement pour vider rapidement le canal microfluidique et rincez-le avec du LB frais qui a été préalablement dégazé pendant au moins 30 minutes et préchauffé à 30 degrés Celsius.

Réglez maintenant la pompe à seringue à un débit de deux microlitres par minute pour rincer doucement le canal. Une fois le canal rempli, augmentez à nouveau le débit. Acquérez des images de bactéries en croissance à la grosseur et à l’intervalle de temps souhaités.