Caractérisation des cellules tumorales à l’aide d’un fil médical pour capturer des cellules tumorales circulantes : une approche 3D basée sur Immunofluorescence et ADN poisson

L’objectif global de ce protocole est de combiner la coloration par immunofluorescence avec l’hybridation in situ fluorescente de l’ADN sur un fil fonctionnalisé en 3D et d’identifier les signaux d’immunophénotype et de FISH sur le support à l’aide d’un microscope à fluorescence grand champ conventionnel. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la caractérisation des cellules tumorales sécrétrices, telles que l’identification de cibles liées au traitement sur les cellules cancéreuses du poumon non à petites cellules circulantes. Le principal avantage de ce protocole est de permettre l’identification simultanée de paramètres phénotypiques tels que la positivité d’EpCAM et d’altérations cytosomatiques telles que le statut du gène ARC pour détecter les CTC présumés.

Bien que cette méthode ait été conçue de manière unique pour fournir des caractéristiques CTC in situ du cancer de l’insuline, elle peut également être appliquée à l’étude d’autres cancers comme le cancer du sein. Nous avons développé ce protocole tout en manipulant le fil pour l’immunophénotypage direct et la détection des CTC. Pour obtenir plus de données, nous avons associé un protocole d’immunophénotypage à un protocole d’hybridation in situ par fluorescence d’ADN.

La manipulation du fil n’est pas facile, principalement parce que la pointe fonctionnalisée est fragile. Une démonstration visuelle permettra aux lecteurs de reproduire les étapes. Pour commencer l’expérience, mettez en suspension tout le contenu d’une fiole T75 qui est à 80 % de confluence dans un flacon de cinq millilitres en utilisant quatre millilitres de milieu complet.

Ensuite, retirez le fil de son emballage en verre. Trempez la partie dorée fonctionnalisée du fil dans le flacon, en vous assurant que le bouchon du fil est bien ajusté pour un flacon de cinq millilitres. Scellez le fil avec un film de laboratoire.

Ensuite, incubez le fil dans un rotateur de tube pendant 30 minutes à température ambiante. Après la rotation, rincez le fil trois fois dans une solution PBS à un pli à l’aide de trois flacons propres différents et attendez que le fil sèche. Après avoir séché le fil à l’air libre pendant 10 minutes dans une hotte, fixez les cellules en trempant le fil dans une solution 100 % acétone dans un tube de cinq millilitres pendant 10 minutes à température ambiante.

Assurez-vous qu’il n’y a aucune trace d’acétone sur l’embout fonctionnalisé. Faites sécher le fil à l’air libre pendant cinq minutes à température ambiante. Ensuite, dans un tube de cinq millilitres, lavez le fil deux fois dans du PBS à plis.

Incuber le fil dans un tampon de dilution d’anticorps. Préparez 150 microlitres de mélange d’anticorps avec une dilution d’anticorps primaire monoclonal conjugué à du fluorochrome et un tampon de dilution d’anticorps spécifié dans la fiche technique. Ensuite, utilisez une pointe P200 pour extraire le fil du bouchon de fil et insérez doucement le fil dans le plus grand trou de la pointe.

Insérez d’abord l’extrémité non fonctionnalisée et tirez lentement le fil à travers le plus petit trou jusqu’à ce que la partie dorée soit juste au-delà du plus grand trou. Ajoutez délicatement 150 microlitres du mélange d’anticorps dans l’embout. Pour éviter le risque de formation de bulles, faites tourner doucement le fil jusqu’à ce que l’extrémité fonctionnalisée soit complètement plongée.

Scellez le trou de l’embout et enroulez un film de laboratoire autour du trou. Incuber le fil verticalement pendant la nuit dans l’obscurité à quatre degrés Celsius. Le deuxième jour, bloquez l’incubation de l’anticorps en lavant le fil deux fois dans du PBS à plis.

Réinsérez le fil dans son bouchon de fil. Trois heures avant le protocole DNA-FISH, réglez le four d’hybridation à 75 degrés Celsius et réglez le four à chaleur sèche à 37 degrés Celsius. Refroidissez la solution SSC 0,4 fois à quatre degrés Celsius.

Lavez le fil trois fois dans une solution SSC glacée à 0,4 fois. Faites sécher le fil dans l’obscurité sous le placard de la hotte pendant 10 minutes. Après 10 minutes, faites tourner la sonde pendant cinq secondes.

Déposez 10 microlitres de la sonde dans des microtubes de verre, puis couvrez-les d’un film de laboratoire. Enveloppez les microtubes dans du papier absorbant sec. Placez-les dans un tube de 50 millilitres et faites-les tourner brièvement.

Placez délicatement le fil séché dans le microtube et insérez le bouchon de fil. Ensuite, scellez le bouchon de fil avec de la colle en caoutchouc. Placez le fil dans une chambre sombre et humide dans le four d’hybridation pendant huit minutes à 75 degrés Celsius pour obtenir une dénaturation complète de l’ADN.

Après huit minutes, déplacez la chambre humide dans un four à chaleur sèche à 37 degrés Celsius pendant la nuit. Placez le pot de coloration de diapositive avec une solution SSC 0,4 fois dans un bain-marie réglé à 72 degrés Celsius. Vérifiez la température de la solution SSC multipliée par 0,4 jusqu’à ce qu’elle atteigne 72 plus ou moins un degré Celsius.

Ensuite, préparez deux béchers en verre. L’un avec deux SSC plus 0,05 % de solution d’entre-entre, et le second avec de l’eau distillée. Retirez la chambre humide du four à chaleur sèche.

À l’aide d’une pince à épiler, retirez délicatement le ciment en caoutchouc du bouchon de fil et tirez l’extrémité non revêtue du fil à travers le bouchon d’extrémité, en faisant attention de ne pas endommager la pointe fonctionnalisée. Trempez le fil dans la solution SSC 0,4 fois pendant deux minutes à 72 degrés Celsius. Lavez le fil dans une solution SSC double plus 0,05 % Tween pendant 30 secondes à température ambiante.

Ensuite, lavez le fil dans de l’eau distillée à température ambiante. Faites sécher le fil sous la hotte pendant 10 minutes dans l’obscurité. Incuber l’extrémité fonctionnalisée du fil avec une solution DAPI préalablement préparée dans un flacon de deux millilitres.

Rincez le fil deux fois dans du PBS pli et séchez-le à l’air. Positionnez le fil dans le support de fil et insérez soigneusement l’embout fonctionnalisé à travers le point d’entrée du support spécial jusqu’à ce que l’embout corresponde au point d’accouplement. Placez le support spécial sur la platine du microscope.

Ajustez la mise au point du microscope à l’aide d’un objectif 20x. Tout d’abord, concentrez-vous grossièrement sur le support spécial, puis ajustez finement sur les cellules qui apparaissent lumineuses dans le canal DAPI. Concentrez uniquement les cellules centrales de l’objectif et acquérez des images à l’aide d’un appareil photo numérique 12 bits avec des objectifs 20x et 40x avec des filtres appropriés pour les sondes rouges, vertes et bleues.

Enfin, préparez le fil pour un stockage à long terme en emballant le fil à côté de l’embout fonctionnalisé et en insérant soigneusement le fil dans un tube de verre. Rangez le fil verticalement ou horizontalement à moins 20 degrés Celsius. La coloration par immunofluorescence n’a pas interféré avec les signaux DNA-FISH.

Lorsque le test immuno-DNA-FISH a été réalisé sur le fil fonctionnalisé du support 3D, la coloration EpCam était clairement visible. La sonde ALK a révélé la délétion du gène. La lignée cellulaire NCI-H3122 a montré un statut aberrant du gène LAK contrairement à la lignée NCI-H1975 avec un ALKG de type sauvage.

Une fois maîtrisé, ce protocole peut être réalisé en neuf heures de travail au total sur trois jours. Lors de cette procédure, il est important de ne pas toucher la partie fonctionnalisée du fil pour éviter tout dommage. Différents anticorps et sondes FISH peuvent être utilisés selon ce protocole pour répondre à des questions supplémentaires telles que l’identification de cellules avec d’autres marqueurs phénotypiques et d’autres altérations cytogénétiques telles que l’amplification du gène NAT ou HAR2.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’identifier simultanément les CTC putatifs à l’aide de paramètres phénotypiques tels que la positivité EpCAM et de détecter les altérations cytogénétiques telles que le statut du gène ARC. N’oubliez pas que travailler avec de l’acétone et au four peut être extrêmement dangereux. Des précautions telles que l’acétone de poignée dans la cagoule et le port de gants de protection doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.