Isolement de cellules cibles à base de fil fonctionnalisé : une technique ex vivo pour isoler des cellules cancéreuses à partir de sang périphérique enrichi

Les molécules d’adhésion des cellules épithéliales, ou EpCAM, sont des glycoprotéines transmembranaires de surface surexprimées dans les cellules épithéliales à prolifération rapide dans les cancers de la prostate. Pour isoler les cellules exprimant EpCAM, commencez par un fil de qualité médicale portant une pointe fonctionnalisée recouverte d’or. La fonctionnalisation recouvre un gel polymère contenant des anticorps spécifiques à l’EpCAM liés de manière covalente.

Immergez le fil dans une suspension de sang périphérique contenant des cellules cancéreuses marquées par fluorescence. S’assurer que la partie fonctionnalisée reste trempée dans la suspension sanguine. Les EpCAM sur les cellules cancéreuses reconnaissent et se lient à leurs anticorps spécifiques fonctionnalisés sur le fil.

Laver avec un tampon pour éliminer toutes les cellules non liées de la surface du fil. Pliez le fil et montez-le sur une lame de verre contenant un tampon, avec la partie fonctionnalisée immergée dans le tampon. Utilisez un microscope à fluorescence pour vérifier la fluorescence brillante du cytoplasme et des noyaux des cellules et confirmer la présence de cellules capturées sur le fil.

Traitez le fil avec un tampon de démoulage. Les enzymes protéolytiques du tampon clivent le gel polymère, libérant les complexes anticorps-cellules cancéreuses dans le tampon. Centrifuger l’ensemble de fils pour recueillir les complexes anticorps-cellules libérés dans la pastille. Retirez le fil et le surnageant contenant des enzymes. Remettre en suspension la pastille contenant la cellule cible dans un milieu approprié.

Dans 5 millilitres de sang périphérique, ajoutez environ 500 à 500 000 cellules puis mélangez en inversant le tube. Après avoir retiré le fil du compartiment de rangement, retirez le capuchon en caoutchouc qui maintient le fil et lavez le fil dans 1x solution saline tamponnée au phosphate et montez-le dans le capuchon du tube. Ensuite, incubez le tube sur un mélangeur à rouleaux inclinés à 5 rotations par minute pendant 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation, rincez trois fois le fil dans une solution saline tamponnée au phosphate. Ensuite, stockez le fil dans un tube de 15 millilitres contenant 1x solution saline tamponnée au phosphate dans l’obscurité.

Dessinez une zone rectangulaire sur une lame de verre à l’aide d’un stylo à graisse et ajoutez-y 500 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate. Pour immerger la partie fonctionnelle du fil dans une solution saline tamponnée au phosphate, pliez la partie non fonctionnelle du fil et placez-la sur la lame de verre. Pour compter le nombre de cellules capturées, inspectez visuellement les deux côtés du fil. Après l’inspection, transférez le fil dans le tube de 15 millilitres avec 1 solution saline tamponnée au phosphate et conservez-le dans l’obscurité.

Dans 1 millilitre de solution saline tamponnée 1x phosphate, dissoudre 4 milligrammes du composant du tampon de déversement. Ensuite, filtrez la solution à travers un filtre stérile de 0,2 micromètre pour obtenir le tampon prêt à l’emploi. Ensuite, réchauffez le tampon de libération à 37 degrés Celsius pendant 5 minutes. Une fois réchauffé, transférez 1,6 millilitre de tampon de libération pour remplir complètement un tube de réaction de 1,5 millilitre. Ensuite, incubez la partie fonctionnelle du fil dans le tampon de libération à 37 degrés Celsius dans un bain-marie pendant 20 minutes.

Après l’incubation, placez le fil sur un agitateur à 500 rotations par minute pendant 15 minutes. Ensuite, centrifugez le fil à 300 x g pendant 10 minutes. Une fois la centrifugation terminée, déplacez le fil du tube, fermez le capuchon et centrifugez à nouveau le tube à 300 x g pendant 10 minutes.

• Epithelial Cell Adhesion Molecules (EpCAMs) – Overexpressed in rapidly proliferating cells in prostate cancers.
• Free Floating Cancer Cells – Malignant cells in blood that have detached from a primary tumor.
• Cytocentrifugation Method – A procedure used to concentrate cells from a fluid sample.
• Functionalization – Process of equipping the wire with EpCAM-specific antibodies.
• Mccoy's 5a Medium Modified – A commercially available solution for culturing human cells.

• The EpCAMs are surface transmembrane glycoproteins overexpressed in rapidly proliferating epithelial cells (e.g., prostate cancer).
• These molecules bind to specific antibodies bound to a functionalized wire in a fluid suspension (e.g., cytocentrifugation method).
• A washing step removes unattached cells, leaving only the target cells bound to the wire (e.g., free floating cancer cells).
• The immersing and release process allows for the focus on the captured cells on the wire, and their subsequent collection.

• What is an EpCAM and how does it relate to prostate cancer and the isolation process?
• How does cytocentrifugation assist in concentrating the target cells?
• How does the wire's functionalization and release process work in terms of capturing and collecting cells?

• Isolating EpCAM-expressing cells for study can lead to advancements in cancer research (e.g., free floating cancer cells).
• Techniques like cytocentrifugation have numerous applications in cell biology and medical diagnostics (e.g., cytocentrifugation method).
• The process provides greater insights into the nature and behavior of cancers cells, potentially leading to more effective treatments (e.g., EpCAMs).
• Focused studies of such nature often lead to significant scientific advancements in cancer research and treatment.