Isolement de cellules cibles à base de fil fonctionnalisé : une technique ex vivo pour isoler des cellules cancéreuses à partir de sang périphérique enrichi

0 vues4:08 min • April 30th, 2023

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Les molécules d’adhésion des cellules épithéliales, ou EpCAM, sont des glycoprotéines transmembranaires de surface surexprimées dans les cellules épithéliales à prolifération rapide dans les cancers de la prostate. Pour isoler les cellules exprimant EpCAM, commencez par un fil de qualité médicale portant une pointe fonctionnalisée recouverte d’or. La fonctionnalisation recouvre un gel polymère contenant des anticorps spécifiques à l’EpCAM liés de manière covalente.

Immergez le fil dans une suspension de sang périphérique contenant des cellules cancéreuses marquées par fluorescence. S’assurer que la partie fonctionnalisée reste trempée dans la suspension sanguine. Les EpCAM sur les cellules cancéreuses reconnaissent et se lient à leurs anticorps spécifiques fonctionnalisés sur le fil.

Laver avec un tampon pour éliminer toutes les cellules non liées de la surface du fil. Pliez le fil et montez-le sur une lame de verre contenant un tampon, avec la partie fonctionnalisée immergée dans le tampon. Utilisez un microscope à fluorescence pour vérifier la fluorescence brillante du cytoplasme et des noyaux des cellules et confirmer la présence de cellules capturées sur le fil.

Traitez le fil avec un tampon de démoulage. Les enzymes protéolytiques du tampon clivent le gel polymère, libérant les complexes anticorps-cellules cancéreuses dans le tampon. Centrifuger l’ensemble de fils pour recueillir les complexes anticorps-cellules libérés dans la pastille. Retirez le fil et le surnageant contenant des enzymes. Remettre en suspension la pastille contenant la cellule cible dans un milieu approprié.

Dans 5 millilitres de sang périphérique, ajoutez environ 500 à 500 000 cellules puis mélangez en inversant le tube. Après avoir retiré le fil du compartiment de rangement, retirez le capuchon en caoutchouc qui maintient le fil et lavez le fil dans 1x solution saline tamponnée au phosphate et montez-le dans le capuchon du tube. Ensuite, incubez le tube sur un mélangeur à rouleaux inclinés à 5 rotations par minute pendant 30 minutes à température ambiante. Après l’incubation, rincez trois fois le fil dans une solution saline tamponnée au phosphate. Ensuite, stockez le fil dans un tube de 15 millilitres contenant 1x solution saline tamponnée au phosphate dans l’obscurité.

Dessinez une zone rectangulaire sur une lame de verre à l’aide d’un stylo à graisse et ajoutez-y 500 microlitres de solution saline tamponnée au phosphate. Pour immerger la partie fonctionnelle du fil dans une solution saline tamponnée au phosphate, pliez la partie non fonctionnelle du fil et placez-la sur la lame de verre. Pour compter le nombre de cellules capturées, inspectez visuellement les deux côtés du fil. Après l’inspection, transférez le fil dans le tube de 15 millilitres avec 1 solution saline tamponnée au phosphate et conservez-le dans l’obscurité.

Dans 1 millilitre de solution saline tamponnée 1x phosphate, dissoudre 4 milligrammes du composant du tampon de déversement. Ensuite, filtrez la solution à travers un filtre stérile de 0,2 micromètre pour obtenir le tampon prêt à l’emploi. Ensuite, réchauffez le tampon de libération à 37 degrés Celsius pendant 5 minutes. Une fois réchauffé, transférez 1,6 millilitre de tampon de libération pour remplir complètement un tube de réaction de 1,5 millilitre. Ensuite, incubez la partie fonctionnelle du fil dans le tampon de libération à 37 degrés Celsius dans un bain-marie pendant 20 minutes.

Après l’incubation, placez le fil sur un agitateur à 500 rotations par minute pendant 15 minutes. Ensuite, centrifugez le fil à 300 x g pendant 10 minutes. Une fois la centrifugation terminée, déplacez le fil du tube, fermez le capuchon et centrifugez à nouveau le tube à 300 x g pendant 10 minutes.

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Dernière mise à jour : 1 août 2026