Name: Une Production efficace et généré par l’Identification de CRISPR/Cas9 les débouchures de gène dans le modèle système Danio rerio (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-08-28T12:30:00.000+00:00
Duration: 11 min 27 s
Description: Apprenez à générer des allèles non-sens CRISPR dans Danio rerio par microinjection d'embryons et séquençage. Cette méthode accessible permet d'étudier les fonctions géniques en biologie du développement.

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Ce travail a été soutenu par le National Institutes of Health (R21CA182197 aux J.O.), le W. Ralph et Grace M. Showalter Research Trust et de la Science agronomique de Purdue et l’Extension pour le programme de développement économique (AgSEED). Les données de séquençage Sanger ont été acquises par l’installation de Purdue Genomics Core pris en charge par P30 CA023168. Mary Witucki a été soutenu par la Purdue University Center for Cancer Research Summer Undergraduate Research Program pris en charge par l’Association Cancer du comté de Carroll. Les bailleurs de fonds n’avaient aucun rôle dans la conception de l’étude, la collecte de données et analyse, décision de publier ou préparation du manuscrit. Nous remercions Benjamin Carter, Ellen Denning et Taylor Sabato pour fournir des commentaires critiques sur le manuscrit. Nous remercions le département de la biochimie à l’appui de ce travail et le centre de recherche de poisson-zèbre à l’Université de Purdue pour leur dévouement dans les soins et le bien-être de notre colonie de poisson-zèbre. Enfin, nous remercions le laboratoire central de Purdue génomique, et contributions de Phillip San Miguel en ce qui concerne les services de la NGS.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce protocole décrit la production de débouchures de gène dans le système de vertébrés modèle poisson zèbre utilisant la technologie CRISPR-Cas9. Un certain nombre de protocoles ont été décrits précédemment pour entreprendre le génie de génome induite par CRISPR zebrafish15,25,26,50,51,52. Ce protocole s’appuie sur des efforts antérieurs en combinant un certain nombre de techniques expérimentales simples mais reproductible cohérentes, en particulier HMA et NGS de multiples poissons hétérozygotes, pour créer un simple, économique et protocole expérimentalement robuste pour la mutagénèse induite par le CRISPR chez le poisson zèbre qui est appropriée pour les laboratoires disposant d’employés avec une gamme de formation et expérience, ainsi que des laboratoires d’enseignement.
Recommandations pour la conception et la synthèse du guide que RNAs sont inclus dans le présent protocole. Une considération importante dans le guide de conception de RNA est la minimisation des effets hors cible. Plusieurs algorithmes de prévision ont été développées pour permettre CRISPR-utilisateurs d’accéder aux outils de calcul avec des interfaces graphiques conviviales qui permettent de prédire tant l’activité du guide sur la cible et la possibilité d’effets hors cible34, 35,,36. Un avantage spécifique du système poisson zèbre est taux réduits des effets hors cible car le Cas9 est injecté dans les embryons et par conséquent l’expression est transitoire, qui a été démontré chez la souris, se traduire par une diminution des effets hors cible53. Néanmoins, les effets hors cible ont été démontrées chez le poisson zèbre54. Contrôle des effets hors cible consiste à phénotype fondateur poisson zèbre qui ont été générées par les deux ARN guide indépendant qui ciblent le même gène, comme ces guides seraient très susceptibles d’affecter les sites hors cible différents. Une autre méthode pour réduire au minimum les effets hors cible qui n’est pas décrit dans le présent protocole est l’utilisation d’un Cas9 muté qui génère des cassures monocaténaires sur la cible de l’ADN, qui doivent être réparés avec une grande efficacité. Les pseudos d’ADN situé à proximité d’un de l’autre qui sont complémentaires à l’opposé de l’appariement brins conduit à la formation d’indel efficace au locus désiré et minimise les effets hors cible55,56.
En plus d’avoir des taux différents d’effets hors cible, sgRNAs différentes peuvent avoir des taux différents de mutagenèse de la cible souhaitée57,58,59. Ce protocole utilise HMA pour analyser l’efficacité de la mutagénèse d’une sgRNA donnée à l’aide de hétéroduplex bande formation33,40. Hétéroduplex bandes sont créés par hybridation générées par PCR des brins d’ADN qui contiennent des incompatibilités et peut être facilement résolu par électrophorèse sur gel. Contrairement aux autres méthodes couramment utilisées pour mesurer la formation indel, tels que l’endonucléase T7 dosage ou haute résolution fondre analyse25,26, HMA ne nécessite pas une enzyme cher pour couper l’ADN ne correspondent pas et ne nécessite pas de une analyse complexe de PCR fondre courbes. Ce qui est important, pour vérifier les taux élevés de formation indel dans la population injectée à l’aide de HMA permet également l’enquêteur afin de minimiser le nombre de poissons nécessaires à la production ultérieure de lignes knock out, ce qui réduit le coût d’identification d’une mutation avec le caractéristiques souhaitées.
La facilité relative de production axée sur les CRISPR indels permet la création de multiples allèles de plusieurs gènes à la fois. Logiciel Web est disponible pour l’analyse de simples mutations hétérozygotes poissons à l’aide de Sanger séquençage des produits PCR49. Dans le cas où trois ou plusieurs allèles muté CRISPR sont analysées, NGS pour caractériser la nature de l’indel est probablement plus rentable pour caractériser la nature de l’indel comme cette approche permet une piscine de 50 différents allèles se caractériser à o RCE (voir Table des matières)60,,du6162. Ces économies d’échelle serait particulièrement utile dans un environnement de laboratoire premier cycle.
En résumé, ce protocole fournit des instructions étape par étape de façon reproductible génération haute qualité CRISPR-réactifs (en particulier, sgRNA) telle que moins de poissons adultes doivent être créés et analysées afin d’identifier correctement les allèles mutants d’intérêt, qui réduit également le temps et le coût de production des lignes souhaitées. Ce qui est important, ce protocole a été conçu telle qu’elle peut être appliquée par les laboratoires disposant de ressources limitées pour produire le poisson-zèbre mutant de façon abordable. En outre, nous avons constaté que cette approche convient aux étudiants de premier cycle et étend ainsi les possibilités d’éducation et de formation des étudiants de premier cycle intéressés par une expérience pratique dans l’édition de base CRISPR génome.

La conservation des machines moléculaires dans les eukaryotes sous-tend le pouvoir d’utiliser des organismes modèles pour la recherche. Bon nombre de ces systèmes modèles facilitent l’utilisation d’une approche génétique inverse comme débouchures de gène ciblé pour caractériser la contribution du produit d’un gène à un processus biologique ou d’une maladie d’intérêt. Techniques de perturbation de gène dans les organismes comme le poisson-zèbre ont historiquement invoqué ciblée introduction de mutations de déphasage qui résultent de réparation imprécise de la CDB1,2. Lorsqu’un ORD est introduit dans le génome, la lésion de l’ADN est réparée par l’une des deux voies qui sont universellement présents dans presque tous les types de cellules et organismes : fin non homologue rejoindre (NHEJ) et axés sur l’homologie réparation (HDR)3,4 . Le caractère imprécis de la machinerie NHEJ produit fréquemment indels diverses longueurs5,6,7,8,9. Introduction de mutations de déphasage dans la séquence codante d’un gène peut produire un codon stop prématuré, qui rend souvent le gène ne fonctionne pas.
Stratégies de génie précoce du génome chez le poisson zèbre pour promouvoir les indels incluent méganucléases, nucléases de doigts de zinc et nucléases d’effecteur comme activateur de transcription, qui utilisé interactions ADN-protéines pour cibler une nucléase à un particulier en génomique cible, où il introduit un ORD10,11,12,13,14,15. Cependant, ces technologies sont souvent difficiles à appliquer en raison de l’ingénierie laborieuse et complexe, nécessaire pour générer une nucléase qui cible la séquence d’ADN d’intérêt. Contrairement aux stratégies antérieures, modification génique à base CRISPR ne repose pas sur des interactions protéine-ADN pour le ciblage. Au lieu de cela, l’endonucléase associée à CRISPR (Cas) est dirigée par un guide de RNA qui utilise des nucléotides à base de couplage des interactions de cibler un site génomique d’intérêt16,17,18,19 ,20,21. En raison de la simplicité de la conception d’un ARN guide avec la base désirée interactions pour cibler l’appariement est relativement facile de cibler l’endonucléase de Cas au locus désiré. Le type II CRISPR système en particulier largement développé pour les applications d’édition en raison de plusieurs caractéristiques avantageuses, y compris l’utilisation d’une nucléase de Cas multidomaine unique (Cas9) nécessitant une interaction avec l’ADN pour stimuler l’activité endonucléasique génome et l’utilisation d’un seul guide ARN (sgRNA) à cibler à l’apparenté de séquence ADN18. Les exigences de la séquence nécessaires pour le ciblage de la sgRNA apparenté sont bien compris19, et le sgRNA désiré est facilement générée par in vitro de transcription. La simplicité et la robustesse de l’approche CRISPR/Cas9 facilite grandement la modification génétique ciblée dans le poisson-zèbre et une grande variété d’autres organismes.
La capacité accrue à entreprendre génome ciblé d’édition chez le poisson zèbre grâce à l’élaboration des réactifs à base de CRISPR a significativement augmenté la possibilité d’étudier les processus emblématiques d’organismes vertébrés tels que le développement du nerveux central système. Le poisson-zèbre génome contient orthologues de 70 % des gènes codant pour des protéines trouvées dans le génome humain ainsi que 84 % des gènes liés aux maladies chez les humains,22. Développement du poisson zèbre présente plusieurs qualités principales d’améliorer son utilisation dans les études de génétique inverses : les embryons sont déposés dans les grandes griffes, développer à l’extérieur de la mère, rendant la manipulation se prête à la génétique par microinjection et poisson-zèbre adulte maturité sexuelle à 3 mois, permettant une rapide propagation de lignes souhaitées,23.
Il existe plusieurs protocoles qui décrivent diverses approches pour générer et identifier les indels CRISPR dérivé dans le poisson-zèbre24,25,26,27,28,29 ,30,31. Cependant, beaucoup de ces procédures sont temps intensif, doivent avoir accès à des équipements coûteux et peuvent être difficile pour les laboratoires ayant une expertise limitée. Les étapes décrites dans la présente fournissent une simple, robuste et économique CRISPR Cas9-stratégie/ingénieur zebrafish knockout lignes. Ce protocole décrit l’utilisation d’un kit très efficace pour synthétiser sgRNAs utilisant des oligonucléotides d’ADN (oligos), semblable aux autres approches qui ont été précédemment décrit32. Le protocole décrit comprend deux étapes en particulier qui simplifient grandement l’analyse de lignées CRISPR muté : utilisation étape par étape du HMA basées sur la PCR33 pour déterminer facilement la présence de modifications du génome et analyse de la séquence de poisson-zèbre hétérozygote pour rapidement et facilement déterminer la nature des indels multiples de façon économique. En outre, des instructions sont incluses pour sélection robuste, production fiable et l’injection du guide RNAs. La procédure décrite ici illustre un protocole robuste et relativement peu coûteux qui permet au personnel de laboratoire avec un éventail de compétences contribuer à l’identification des débouchures de gènes chez le poisson zèbre.

<table><tbody><tr><td>Logiciel d’analyse d’ARNsg CRISPOR</td><td></td><td></td><td></td>.</tr> <tr><td>Logiciel d’analyse d’ARNsg http://crispor.tefor.net/ Breaking-Cas</td><td></td><td></td><td></td>. https://omictools.com/breaking-cas-tool</tr><tr><td>Logiciel d’analyse d’ARNsg</td> <td>ChopChop</td><td></td><td></td>. Conception</tr> <tr><td>d’amorces https://chopchop.rc.fas.harvard.edu/ Primer 3</td><td></td><td></td><td>PCR. http://bioinfo.ut.ee/primer3-0.4.0/</td></tr><tr>Technique <td></td><td></td><td>sans RNASE</td><td>http://genomics.no/oslo/uploads/PDFs/workingwithrna.pdf</td></tr><tr><td>Eau sans RNase</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>Synthèse d’ARN guides. Thermo Fisher et Qiagen transportent tous deux de l’eau adaptée.</td></tr><tr><td>Éthanol sans RNASE</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>d’éthanol de biologie moléculaire est sans RNASE. Fischer, VWR vendent de l’éthanol adapté.</td></tr><tr><td>Protéine Cas9 PNA</td><td>Bio</td><td>CP01</td><td>Protéine Cas9 avec signal de localisation nucléaire.</td></tr><tr><td>Cibler des oligos spécifiques :</td><td>les technologies d’ADN intégrées (IDT)</td><td></td> <td>synthétisent les ARN guides.</td></tr><tr><td>Amorces PCR guide flanquant site de coupure de l’ARN</td><td>Technologies d’ADN intégrées (IDT)</td><td></td><td>Utilisation pour l’analyse hétéroduplex, produit 100-300 pb.</td></tr><tr><td>Amorces PCR guide flanquant site de coupe de l’ARN</td><td>Technologies d’ADN intégrées (IDT)</td><td></td><td>Utilisation pour le séquençage des allèles CRISPR, produit 300-600 pb recommandé.</td></tr><tr><td>Kit de synthèse d’ARNsg EnGen</td><td>New England BioLabs</td><td>E3322</td><td>ARN guides transcrits in vitro.</td></tr><tr><td>10X TBE</td><td>Thermo Fisher</td><td>B52</td><td>Tampon sans RNase pour l’électrophorèse des acides nucléiques.</td></tr><tr><td>6X Load Dye</td><td>New England BioLabs</td><td>B7025S</td><td>Chargement de l’ADN pour l’électrophérèse.</td></tr><tr><td>5M Acétate d’ammonium</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9071</td><td>Réactif de nettoyage pour la purification des ARN guides.</td></tr><tr><td>Éthanol (200 proof, sans nucléase)</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>Réactif de nettoyage pour la purification des ARN guides. Les matériaux de qualité moléculaire sont exempts de RNase.</td></tr><tr><td>Eau sans nucléases N’importe</td><td>quelle marque</td><td></td><td>Pour la synthèse et la purification d’ARN guides.</td></tr><tr><td>RNase away</td><td>Thermo Fisher</td><td>10328011</td><td>Élimine la contamination RNase des surfaces, de l’équipement et de la verrerie.</td></tr><tr><td>Échelle d’ADN, 100 pb</td><td>New England BioLabs</td><td>N0467S</td><td>Étalons de poids moléculaire pour l’électrophorèse sur gel de l’ADN.</td></tr><tr><td>Échelle d’ADN, 1 kb</td><td>New England BioLabs</td><td>N0552S</td><td>Étalons de poids moléculaire pour l’électrophorèse sur gel de l’ADN.</td></tr><tr><td>Échelle d’ARN</td><td>New England BioLabs</td><td>N0364S</td><td>Marqueur d’ARN simple brin pour vérifier que l’ARNsg pleine longueur a été synthétisé</td></tr><tr><td>TEMED</td><td>Thermo Fisher</td><td>17919</td><td>Coulée de gel de polyacrylamide.</td></tr><tr><td>Persulfate d’ammonium (APS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3678</td><td>Moulage de gel de polyacrylamide.</td></tr><tr><td>40 % Polyacrylamide (19:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0154</td><td>Moulage de gel de polyacrylamide dénaturant.</td></tr><tr><td>Urea</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>U5378-100G</td><td>Gel de polyacrylamide dénaturant pour coulée.</td></tr><tr><td>Colorant de chargement de gel d’ARN (2x)</td><td>Thermo Fisher</td><td>R0641</td><td>Guide de chargement de l’ARN sur gel dénaturant pour l’électrophorèse.</td></tr><tr><td>Bromure d’éthidium</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E1510-10ML</td><td>Visualisation des acides nucléiques.</td></tr><tr><td>SYBER Green</td><td>Thermo Fisher</td><td>S7563</td><td>Méthode alternative au bromure d’éthidium pour la détection de l’ADNdb dans les gels d’agarose ou de polyacrylamide.</td></tr><tr><td>Microcentrifugeuse</td><td>Eppendorf</td><td>5424</td><td>Nettoyage de l’ARN, purification par PCR.</td></tr><tr><td>MyTaq Polymerase</td><td>Bioline</td><td>BIO-21105</td><td>Pour l’amplification de l’ADN par PCR.</td></tr><tr><td>Thermocycleur</td> : <td>Amplification PCR</td> <td>de toute marque</td><td></td>.</tr><tr><td>Spectrophotomètre</td><td>Toute marque</td><td></td><td>NanoDrop ou produit associé permettant de quantifier la quantité d’ADN/ARN.</td></tr><tr><td>Milieu embryonnaire</td><td>E3 Fabriqué en interne</td><td></td><td>Média pour l’élevage des embryons et la fabrication de plaques d’injeciton. Recette : http://cshprotocols.cshlp.org/content/2011/10/pdb.rec66449</td></tr><tr><td>Bleu de méthylène</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M9140</td><td>ajouté à 1x milieu E3 pour prévenir la croissance fongique sur les embryons.</td></tr><tr><td>Boîte de Pétri</td><td>Thermo Fisher</td><td>FB0875711Z</td><td>Stocker les embryons, plaque d’injection moulée.</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Denville</td><td>CA3510-8</td><td>Plaque d’injection de coulée, gels d’agarose.</td></tr><tr><td>Moule de microinection</td><td>Outils de science adaptatifs</td><td>TU-1</td><td>Pour créer des puits pour retenir les embryons pendant l’injection.</td></tr><tr><td>Rouge phénolique</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0290&nbsp ;</td><td>Colorant pour la visualisation de l’injection.</td></tr><tr><td>Huile minérale</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5904-5ML</td><td>Pour calibrer le volume d’injection à l’aiguille.</td></tr><tr><td>Pipettes de transfert</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>Déplacer les embryons.</td></tr><tr><td>Lame de rasoir</td><td>Thermo Fisher</td><td>11295-10</td><td>Aiguille d’injection de coupe, coupe de queue de poisson adulte.</td></tr><tr><td>Incubateur</td><td>Toute marque</td><td></td><td>Maintien des embryons à 28,5 oC.</td></tr><tr><td>Extracteur de pipette verticale</td><td>David Kopf Instruments</td><td>700C</td><td>Generate aiguilles pour injection. Instructions supplémentaires pour le tirage de l’aiguille : http://cshprotocols.cshlp.org/content/2006/7/pdb.prot4651.long</td></tr><tr><td>Tubes capillaires</td><td>Sutter Instruments</td><td>BF100-58-10</td><td>Générez des aiguilles pour injection.</td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>930001007</td><td>Chargez la solution dans des aiguilles d’injection.</td></tr><tr><td>Microinjecteur</td><td>World Precision Instruments</td><td>PV 820</td><td>Injection d’embryons.</td></tr><tr><td>Microscope de dessiccation</td><td>Leica</td><td></td><td>Injection d’embryons.</td></tr><tr><td>30 % Polyacylamide (29:1)</td><td>BioRad</td><td>161-0156</td><td>Coulée de gel hétéroduplex.</td></tr><tr><td>MS-222 (Tricaïne)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A-5040</td><td>Anesthésie le poisson-zèbre pour la coupe de la queue et l’extraction d’ADNg à partir d’embryons. Recette : https://wiki.zfin.org/display/prot/TRICAINE</td></tr><tr><td>Micro-ondes</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>Plaque d’injection de coulée, gels d’agarose.</td></tr><tr><td>Échelle</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>Plaque d’injection de coulée, gels d’agarose.</td></tr><tr><td>Gants</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>Pour tous les aspects du protocole.</td></tr><tr><td>N2</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>Pour expulser du liquide du capillaire pour l’injection d’embryons.</td></tr><tr><td>1 000 et micro ; L&nbsp ; pourboires</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>Pour tous les aspects du protocole.</td></tr><tr><td>200 et micro ; L conseils</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>Pour tous les aspects du protocole.</td></tr><tr><td>10 et micro ; L conseils</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>Pour tous les aspects du protocole.</td></tr><tr><td>Tubes de bandelettes PCR</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>Pour tous les aspects du protocole.</td></tr><tr><td>Micropipettes</td><td>N’importe quelle marque</td><td></td><td>Pour tous les aspects du protocole.</td></tr><tr><td>Plateforme de séquençage NGS : Wideseq</td><td></td><td></td><td>Si votre établissement n’offre pas ce service, rendez-vous : https://www.purdue.edu/hla/sites/genomics/wideseq-2/ (Coût externe : 35 $).</td></tr><tr><td>Logiciel d’analyse</td><td></td><td></td> de séquences <td>Pour le séquençage de poissons hétérozygotes. Visitez : http://yosttools.genetics.utah.edu/PolyPeakParser/</td></tr> <tr><td>Logiciel pour l’analyse</td><td></td><td></td><td>de séquences SnapGene Viewer, Scanner de séquences pour l’analyse du séquençage NGS.</td></tr></tbody></table>

une production efficace et généré par l’identification de crispr/cas9 les débouchures de gène dans le modèle système danio rerio

Efficient Production and Identification of CRISPR/Cas9-generated Gene Knockouts in the Model System Danio rerio

Caractérisation de l’ordonné en clusters, régulièrement espacées, courtes, palindrome répéter (CRISPR) système de Streptococcus pyogenes a permis le développement d’une plate-forme personnalisable pour générer rapidement des modifications du gène dans une grande variété de organismes, y compris le poisson-zèbre. Axée sur les CRISPR génome édition utilise un seul guide RNA (sgRNA) afin de cibler une endonucléase associée à CRISPR (Cas) à une cible d’ADN (génomique) génomique d’intérêt, où l’endonucléase de Cas génère un saut double-brin (DSB). Réparation des CDB de plomb mécanismes sujette aux insertions ou suppressions (indels). Cela peut provoquer des mutations de déphasage qui présentent souvent un codon d’arrêt prématuré au sein de la séquence codante, créant ainsi un allèle de protéine null. Ingénierie de base CRISPR génome nécessite seulement quelques composants moléculaires et est facilement introduit dans des embryons de poisson-zèbre par microinjection. Ce protocole décrit les méthodes utilisées pour générer des réactifs CRISPR pour le poisson-zèbre microinjection et d’identifier les poissons présentant des cellules germinales transmission des gènes modifiés CRISPR. Ces méthodes incluent la transcription in vitro de sgRNAs, microinjection de réactifs CRISPR, identification des indels induit sur le site de cible en utilisant une méthode basée sur le PCR appelée une analyse de mobilité hétéroduplex (HMA) et la caractérisation de l’indels en utilisant un débit faible et un séquençage puissant de prochaine génération (NGS)-basé d’approche qui permet d’analyser plusieurs produits PCR provenant de poissons hétérozygotes. Ce protocole est simplifié afin de minimiser le nombre de poissons nécessaires tant les types d’équipement nécessaire pour effectuer les analyses. En outre, ce protocole est conçu pour être prête pour utilisation en laboratoire personnel de tous niveaux d’expérience, y compris les étudiants de premier cycle, permettant à ce puissant outil devant être économiquement utilisés par les groupes de recherche intéressés dans l’exercice de base CRISPR modifications génomiques chez le poisson zèbre.

Les approches expérimentales décrites dans le présent protocole permettant une production efficace et rentable des lignes de knock out de poisson-zèbre utilisant la technologie CRISPR/Cas9. Les chiffres suivants ont été inclus dans cet article pour faciliter l’interprétation et le dépannage des résultats obtenus à l’aide de ce protocole. Suite production réussie et microinjection de CRISPR-réactifs, les embryons de poisson-zèbre peuvent être analysés pour les phénotypes manifestes et indel formation à l’aide de HMA. Un contrôle utile de visualiser la réussite de l’expérience-CRISPR est l’utilisation de la sgRNA décrit à l’étape 1.5 pour cibler le gène productrices de pigment tyrosinase. Indel Cas9 induite par la formation à la tyrosinase entraîne une perte de pigmentation et est facilement marquée par 48 hpf (Figure 1). Un autre contrôle utile pour s’assurer que la préparation des réactifs-CRISPR pour injection a été couronnée de succès, est de vérifier que le DVD complet (120 nt) sgRNA a été synthétisé à l’aide d’un gel de polyacrylamide dénaturation (Figure 2, voie 1 et 2). Si l’ARN a été dégradée, il peut apparaître comme un frottis, par exemple 3 voies (Figure 2) montre des ARN dégradé qui ne convient pas pour injection.
Pour analyser la fréquence de formation indel des gènes ciblés par CRISPR-Cas9 qui n’aboutissent pas à des phénotypes manifestes tels que de la tyrosinase, analyse HMA est une méthode simple et fiable. sgRNA/Cas9 injecté embryons analysées à l’aide des résultats HMA dans la formation des bandes hétéroduplex et réduction de l’intensité de la bande de homoduplex (Figure 4). La présence de bandes hétéroduplex est davantage utilisée dans le présent protocole pour identifier les éventuels poissons fondateur des embryons microinjectés et que les adultes (Figure 4 et Figure 5), pour analyser l’efficacité de transmission des cellules germinales d’un fondateur ( Figure 6) et de vérifier la présence d’un indel dans un poisson de F1 hétérozygote (Figure 7). Les poissons hétérozygotes qui contiennent un indel sont candidats pour NGS pour identifier la nature de l’indel et de déterminer si un codon stop prématuré est présent dans la région codante du gène cible.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig1.jpg"> Figure 1 : Les embryons de poisson-zèbre présentent un défaut de pigment lorsqu’elle est injectée avec une sgRNA ciblant la tyrosinase au stade unicellulaire. (A) sauvage, non embryon à 48 hpf et (B) injecté embryon à 48 hpf. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig2.jpg"> Figure 2 : In vitro de transcription de sgRNA à l’aide de kit de synthèse. Oligos ont été synthétisés à l’aide de in vitro transcription conformément aux instructions de kit de synthèse sgRNA. 500 ng d’ARN a été exécuté sur un gel d’urée/PAGE comme décrit. sgRNA chargé dans les couloirs 1 et 2 montre une bande correspondant à la pleine longueur, intact 120 nt RNA. Le sgRNA en voie 3 montre un exemple de RNA dégradé qui ne convient pas pour injection.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig3.jpg"> Figure 3 : Comparaison de la santé des embryons de hpf injecté 24. Un embryon de vie (A) mis au point à 24 hpf, se distingue facilement d’un embryon qui a interrompu le développement (B). Les embryons qui ressemblent à (B) ou qui ont radicalement modifié les caractéristiques de (A), comme la courbure de la colonne vertébrale ou modifié tête et développement de le œil doit être retirée du plat. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig4.jpg"> Figure 4 : Analyse de mobilité hétéroduplex de sgRNA-Cas9 micro embryons de poissons zèbres. Piscines de 5 embryons par échantillon prélevés à 72 hpf et ADNg a été extrait. Hétéroduplex analyse a été réalisée comme décrit, échantillons sont chargés également de 500 ng d’ADN. Voies : M = 100 bp marqueur ; 1 = non contrôle ; 2 = injection sample 1 ; 3 = échantillon d’injection 2. Prévu de taille de bande = 98 bp.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig5.jpg"> Figure 5 : Analyse de mobilité hétéroduplex d’ADNg extraite de la queue d’un poisson-zèbre adulte injecté CRISPR. Les embryons qui ont été injectés avec une sgRNA et Cas9 protéine ont été cultivés à l’âge adulte (3 mois). Poisson B et C pièce hétéroduplex bandes et ont été élevés par la suite afin d’identifier les indels germline transmis ; poisson A n’était pas utilisé dans une analyse ultérieure parce qu’il ne présente pas une bande hétéroduplex positive. Voies : 1 = contrôle de type sauvage ; 2 = poisson A ; 3 = poisson B ; 4 = poisson C. attendu bande taille = 98 BP. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig5large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig6.jpg"> Figure 6 : Analyse de mobilité hétéroduplex d’embryons unique généré par la reproduction d’un poisson-zèbre F0 CRISPR-injecté à un poisson sauvage pour identifier les cellules germinales transmis indels. Poisson zèbre ont été accouplés et les embryons de F1 cultivés pour les embryons unique de 72 h. ont été prélevés et hétéroduplex analyse effectuée comme indiqué. Voies : 1 = contrôle de type sauvage ; 2-10 = un seul embryon de F1 par couloir. Ce gel montre que 7 des 10 embryons montrent une bande hétéroduplex positif, indiquant un taux de transmission de lignée germinale de 70 % de l’indel. Prévu de taille de bande = 98 BP. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig6large.jpg" target="_blank">s’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56969/56969fig7.jpg"> Figure 7 : Analyse de mobilité hétéroduplex d’adultes clips de queue de poisson-zèbre F1. Les poissons adultes de F1 ont été marqués par HMA pour identifier les indels. Les poissons qui présentaient une bande hétéroduplex positifs étaient PCR amplifiés et soumis à l’analyse de la séquence large pour déterminer la nature de la mutation. (A) voies : 1 = contrôle de type sauvage ; 2 = poisson une (délétion 4 bp, 1 incompatibilité de bp). (B) ces F1 poissons ont été identifiées dans le même fondateur et encore montrent différente hétéroduplex patterning, indiquant la lignée germinale transmission de multiples allèles modifiés d’un fondateur unique. Voies : 1 = contrôle de type sauvage ; 2 = poisson B (4 bp insertion, incompatibilité de bp 7), 3 = poisson C (4 bp suppression, 4 incompatibilité de bp). Chacun des ces indels créé un codon stop prématuré dans la séquence codante du gène cible, tel que déterminé par NGS. <a href="https://cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56969/56969fig7large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>

Édition de génome ciblé dans le système de modèle Danio rerio (poisson-zèbre) a été grandement facilitée par l’émergence des approches axées sur les CRISPR. Ici, nous décrivons un protocole simplifié et robuste pour la génération et l’identification d’allèles de dérivés CRISPR non-sens qui intègre l’analyse de mobilité hétéroduplex et l’identification des mutations à l’aide de séquençage de prochaine génération.

Une Production efficace et généré par l’Identification de CRISPR/Cas9 les débouchures de gène dans le modèle système Danio rerio

Characterization of the clustered, regularly interspaced, short, palindromic repeat (CRISPR) system of Streptococcus pyogenes has enabled the development ...

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer une édition ciblée du génome à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9 chez le poisson-zèbre afin de concevoir des knock-outs de gènes de manière robuste et peu coûteuse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le rôle biologique d’un gène dans le contexte d’un système modèle de vertébrés, comme la façon dont un gène contribue aux processus de développement chez les eucaryotes d’ordre supérieur. Grâce à ces procédures simples et robustes, le personnel de laboratoire de tous niveaux d’expérience, y compris les étudiants de premier cycle, peut effectuer des modifications génomiques ciblées chez le poisson zèbre.Les personnes novices dans cette méthode devraient être en mesure de suivre les instructions étape par étape pour identifier les cibles génomiques optimales pour la mutagenèse CRISPR, effectuer la micro-injection d’embryons de poisson-zèbre et identifier les allèles modifiés. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car elle est destinée aux étudiants de premier cycle qui ne sont peut-être pas familiers avec une ou plusieurs des techniques nécessaires. Des directives pour la conception d’oligos spécifiques à la matrice pour la production d’ARN guide sont fournies dans le protocole textuel.Pour commencer, suspendez la protéine Cas9 dans un tampon pour générer une solution d’un milligramme par millilitre. Conservez cette solution dans des aliquotes prêtes à l’injection à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Ensuite, synthétisez l’ARNsg à l’aide d’un kit de transcription in vitro tel que celui suggéré dans les matériaux de cet article selon les instructions du fabricant.Purifier l’ARNsg synthétisé à l’aide d’une précipitation d’acétate d’ammonium libre ARNase. Ajoutez 25 microlitres d’acétate d’ammonium à cinq molaires à l’ARN synthétisé et mélangez la solution par vortex. Ensuite, ajoutez 150 microlitres d’éthanol sans nucléase à 200 degrés à l’échantillon.Et placez la réaction dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 20 minutes. Ensuite, centrifugez les échantillons à vitesse maximale. À l’aide d’une pipette, prélever le surnageant en prenant soin de ne pas déranger la pastille d’ARN.Ajoutez ensuite un millilitre d’éthanol à 70 % et retournez le tube plusieurs fois pour laver le sel résiduel du tube. Centrifugez à nouveau à vitesse maximale à quatre degrés Celsius pendant sept minutes. Utilisez une pipette P1000 pour prélever la majeure partie de la solution.Ensuite, utilisez une pipette P200 pour prélever la plus grande partie de la solution restante sans déranger la pastille. En prenant soin d’éviter la contamination par l’ARNase, séchez la pastille dans un endroit propre jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de gouttes de liquide visibles dans le tube. Remettez la pastille en suspension dans 30 microlitres d’eau exempte d’ARNase et utilisez un spectrophotomètre pour quantifier le produit.Aliquote la solution pour le stockage à long terme à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, mélangez 300 à 500 nanogrammes d’ARNsg avec un volume égal de colorant de chargement de gel d’ARN 2X. Ensuite, à l’aide d’une pipette P1000, nettoyez plusieurs fois chacun des puits de gel d’agarose des débris avec un tampon de coulée.Chargez les solutions dans les puits de gel d’agarose et faites fonctionner le gel à 10 volts par centimètre pendant suffisamment de temps pour séparer les bandes d’ARN sur le gel. Le temps peut varier selon l’appareil d’électrophorèse. En général, le front du colorant doit être coulé à 2/3 s de la longueur du gel.Utilisez ensuite une coloration à l’acide nucléique pour visualiser les bandes. L’ARN intact apparaît sous la forme d’une seule bande, comme dans les voies un et deux illustrées ici. L’ARN dégradé s’écoule sous forme de frottis, comme dans la voie trois.Tout d’abord, préparez les sujets de poisson-zèbre pour la reproduction la nuit précédant la réalisation des injections, comme décrit dans le protocole de texte. Combinez ensuite la protéine Cas9 et l’ARNsg dans un rapport de deux pour un. Incuber la solution à température ambiante pendant cinq minutes pendant que le Cas9 et l’ARNsg forment un complexe ribonucléoprotéique.Ajoutez ensuite 0,5 microlitre de solutions de rouge de phénol à 2,5 % dans suffisamment d’eau libre d’ARNase pour obtenir un volume final de cinq microlitres. Pour préparer l’aiguille d’injection, utilisez un extracteur de micropipette pour tirer un capillaire en verre d’un millimètre. Coupez ensuite la pointe de l’aiguille de verre obtenue avec une lame de rasoir pour obtenir une ouverture inclinée.Placez l’aiguille dans un micromanipulateur attaché à un micro-injecteur. À l’aide d’un microscope optique, ajustez la pression d’injection jusqu’à ce que l’aiguille injecte constamment un nanomètre de solution dans la boîte de Pétri. Avant d’effectuer la micro-injection d’embryons, entraînez-vous à préparer des aiguilles et à injecter des embryons témoins à l’aide d’une solution de colorant uniquement et enregistrez la survie après 24 heures de développement.Vous devriez être en mesure d’obtenir un taux de survie supérieur à 90 % par rapport à un témoin non injecté. Ensuite, sélectionnez 10 à 15 embryons en tant que population témoin et placez-les dans une boîte de Pétri étiquetée séparément. À l’aide d’une pipette de transfert, alignez soigneusement les embryons restants sur une plaque d’injection à température ambiante.Sous un microscope de dissection, injectez un nanolitre de la solution dans le sac vitellin de chaque embryon. Ensuite, retournez les embryons injectés dans une boîte de Pétri étiquetée et recouvrez-les d’un milieu 1X E3 avec du bleu de méthylène. Placez les embryons injectés dans un incubateur à 28 degrés Celsius pendant 24 heures.Ensuite, inspectez les embryons injectés pour retirer les individus morts ou en développement anormal. Tout d’abord, prélevez deux séries de cinq embryons de 72 heures dans les plaques contenant les embryons injectés et une série de cinq embryons de 72 heures du groupe témoin non injecté dans les tubes de la microcentrifugeuse. Pipetez doucement le milieu de chaque ensemble d’embryons et anesthésez-les.Retirez l’anesthésique après deux minutes et ajoutez 45 microlitres d’hydroxyde de sodium de 50 millimolaires. Ensuite, incubez les échantillons à 95 degrés pendant 10 minutes. Ensuite, retirez les échantillons de l’incubateur et laissez-les refroidir à température ambiante.Ajoutez cinq microlitres de chlorhydrate de tris de pH molaire et agitez vigoureusement les échantillons. Ensuite, centrifugez la solution à vitesse maximale à température ambiante pendant trois minutes. Transférez le surnageant, qui contient l’ADN génomique, dans un nouveau tube étiqueté et stockez l’ADNg à moins 20 degrés Celsius.Utilisez les amorces conçues pour amplifier autour de la région cible de l’ARNsg comme décrit dans le texte pour amplifier un fragment de PCR pour l’analyse hétéroduplex. Utilisez un kit de nettoyage PCR pour purifier les produits de la réaction PCR. Diluez les échantillons dans 30 microlitres d’eau et utilisez un spectrophotomètre pour quantifier l’ADN.Placez les tubes contenant les amplicons PCR dans une grille flottante dans un bain d’eau bouillante. Préparez ensuite un gel TBE à 15 % de polyacrylamide en utilisant 30 % de polyacrylamide. Une fois que le gel a pris, placez-le dans un appareil d’électrophorèse avec tampon de fonctionnement TBE.Chargez ensuite 500 nanogrammes de produits PCR recuits et chargez un témoin à côté de chaque ensemble d’échantillons d’ARNsg. Faites fonctionner le gel à 150 volts pendant deux heures et demie ou jusqu’à ce que la face du colorant se trouve au bas du gel. Grandir a injecté des embryons de poisson-zèbre à l’âge adulte qui présentent des bandes hétéroduplex dans le HMA.Pour interpréter le HMA, comparez l’intensité de la bande homoduplex de la PCR du contrôle non injecté de type sauvage aux échantillons injectés correspondants. S’il y a eu une coupe suffisante, l’intensité de la bande du poisson injecté doit être inférieure d’environ 50 % à celle du témoin de type sauvage. Pour confirmer la présence d’indels chez les poissons parents fondateurs potentiels, anesthésez le poisson avec 0,004 % de tricaïne et utilisez une lame de rasoir propre pour enlever 1/2 à 3/4 de la nageoire caudale.Ensuite, placez la queue dans 45 microlitres d’hydroxyde de sodium de 50 millimolaires. Remettez le poisson dans un réservoir de récupération et effectuez l’extraction de l’ADNg comme décrit précédemment. Ensuite, effectuez une HMA sur l’ADNg du clip de queue pour déterminer si l’individu a été modifié avec succès par injection CRISPR.Ensuite, reproduisez les adultes qui présentent des bandes hétéroduplex dans l’ADN de la queue avec des poissons de type sauvage. Sélectionner les poissons fondateurs pour générer des poissons F1 sur la base de l’analyse HMA des fosses. Enfin, séquencez l’ADNg du poisson d’intérêt pour caractériser la nature de l’indel.Après la production et la micro-injection réussies de réactifs CRISPR, les embryons de poisson-zèbre ont été analysés pour détecter les phénotypes manifestes et la formation d’indel à l’aide de HMA. La formation d’indel induite par Cas9 au niveau de la tyrosinase entraîne une perte de pigmentation et est facilement évaluée 48 heures après la fécondation. L’identification des allèles modifiés par CRISPR qui n’entraînent pas de phénotypes de développement manifestes est effectuée à l’aide de l’HMA.Le ciblage réussi du gène d’intérêt entraîne la formation de bandes hétéroduplex et une réduction de l’intensité de la bande homoduplex, comme dans les voies trois et quatre. N’oubliez pas que travailler avec un organisme vertébré comporte des responsabilités éthiques. Ce protocole décrit des stratégies qui minimisent le nombre de poissons-zèbres nécessaires pour obtenir un knock-out, un objectif qui doit être pris en compte lors de l’exécution de cette procédure.Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour générer et identifier rapidement le poisson-zèbre porteur d’allèles modifiés par CRISPR qui seront transmis dans la lignée germinale avec une grande efficacité. Il est important de noter que cette technique a été optimisée pour être une approche peu coûteuse qui convient aux étudiants de premier cycle et à d’autres personnes ayant peu d’expérience préalable. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir et de mettre en œuvre facilement une approche d’inactivation de gènes basée sur CRISPR à l’aide de poissons-zèbres.

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