Une Production efficace et généré par l’Identification de CRISPR/Cas9 les débouchures de gène dans le modèle système Danio rerio

L’objectif global de cette procédure est d’effectuer une édition ciblée du génome à l’aide de la technologie CRISPR/Cas9 chez le poisson-zèbre afin de concevoir des knock-outs de gènes de manière robuste et peu coûteuse. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur le rôle biologique d’un gène dans le contexte d’un système modèle de vertébrés, comme la façon dont un gène contribue aux processus de développement chez les eucaryotes d’ordre supérieur. Grâce à ces procédures simples et robustes, le personnel de laboratoire de tous niveaux d’expérience, y compris les étudiants de premier cycle, peut effectuer des modifications génomiques ciblées chez le poisson zèbre.

Les personnes novices dans cette méthode devraient être en mesure de suivre les instructions étape par étape pour identifier les cibles génomiques optimales pour la mutagenèse CRISPR, effectuer la micro-injection d’embryons de poisson-zèbre et identifier les allèles modifiés. La démonstration visuelle de cette méthode est essentielle, car elle est destinée aux étudiants de premier cycle qui ne sont peut-être pas familiers avec une ou plusieurs des techniques nécessaires. Des directives pour la conception d’oligos spécifiques à la matrice pour la production d’ARN guide sont fournies dans le protocole textuel.

Pour commencer, suspendez la protéine Cas9 dans un tampon pour générer une solution d’un milligramme par millilitre. Conservez cette solution dans des aliquotes prêtes à l’injection à moins 80 degrés Celsius pour une utilisation ultérieure. Ensuite, synthétisez l’ARNsg à l’aide d’un kit de transcription in vitro tel que celui suggéré dans les matériaux de cet article selon les instructions du fabricant.

Purifier l’ARNsg synthétisé à l’aide d’une précipitation d’acétate d’ammonium libre ARNase. Ajoutez 25 microlitres d’acétate d’ammonium à cinq molaires à l’ARN synthétisé et mélangez la solution par vortex. Ensuite, ajoutez 150 microlitres d’éthanol sans nucléase à 200 degrés à l’échantillon.

Et placez la réaction dans un congélateur à moins 80 degrés Celsius pendant au moins 20 minutes. Ensuite, centrifugez les échantillons à vitesse maximale. À l’aide d’une pipette, prélever le surnageant en prenant soin de ne pas déranger la pastille d’ARN.

Ajoutez ensuite un millilitre d’éthanol à 70 % et retournez le tube plusieurs fois pour laver le sel résiduel du tube. Centrifugez à nouveau à vitesse maximale à quatre degrés Celsius pendant sept minutes. Utilisez une pipette P1000 pour prélever la majeure partie de la solution.

Ensuite, utilisez une pipette P200 pour prélever la plus grande partie de la solution restante sans déranger la pastille. En prenant soin d’éviter la contamination par l’ARNase, séchez la pastille dans un endroit propre jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de gouttes de liquide visibles dans le tube. Remettez la pastille en suspension dans 30 microlitres d’eau exempte d’ARNase et utilisez un spectrophotomètre pour quantifier le produit.

Aliquote la solution pour le stockage à long terme à moins 80 degrés Celsius. Ensuite, mélangez 300 à 500 nanogrammes d’ARNsg avec un volume égal de colorant de chargement de gel d’ARN 2X. Ensuite, à l’aide d’une pipette P1000, nettoyez plusieurs fois chacun des puits de gel d’agarose des débris avec un tampon de coulée.

Chargez les solutions dans les puits de gel d’agarose et faites fonctionner le gel à 10 volts par centimètre pendant suffisamment de temps pour séparer les bandes d’ARN sur le gel. Le temps peut varier selon l’appareil d’électrophorèse. En général, le front du colorant doit être coulé à 2/3 s de la longueur du gel.

Utilisez ensuite une coloration à l’acide nucléique pour visualiser les bandes. L’ARN intact apparaît sous la forme d’une seule bande, comme dans les voies un et deux illustrées ici. L’ARN dégradé s’écoule sous forme de frottis, comme dans la voie trois.

Tout d’abord, préparez les sujets de poisson-zèbre pour la reproduction la nuit précédant la réalisation des injections, comme décrit dans le protocole de texte. Combinez ensuite la protéine Cas9 et l’ARNsg dans un rapport de deux pour un. Incuber la solution à température ambiante pendant cinq minutes pendant que le Cas9 et l’ARNsg forment un complexe ribonucléoprotéique.

Ajoutez ensuite 0,5 microlitre de solutions de rouge de phénol à 2,5 % dans suffisamment d’eau libre d’ARNase pour obtenir un volume final de cinq microlitres. Pour préparer l’aiguille d’injection, utilisez un extracteur de micropipette pour tirer un capillaire en verre d’un millimètre. Coupez ensuite la pointe de l’aiguille de verre obtenue avec une lame de rasoir pour obtenir une ouverture inclinée.

Placez l’aiguille dans un micromanipulateur attaché à un micro-injecteur. À l’aide d’un microscope optique, ajustez la pression d’injection jusqu’à ce que l’aiguille injecte constamment un nanomètre de solution dans la boîte de Pétri. Avant d’effectuer la micro-injection d’embryons, entraînez-vous à préparer des aiguilles et à injecter des embryons témoins à l’aide d’une solution de colorant uniquement et enregistrez la survie après 24 heures de développement.

Vous devriez être en mesure d’obtenir un taux de survie supérieur à 90 % par rapport à un témoin non injecté. Ensuite, sélectionnez 10 à 15 embryons en tant que population témoin et placez-les dans une boîte de Pétri étiquetée séparément. À l’aide d’une pipette de transfert, alignez soigneusement les embryons restants sur une plaque d’injection à température ambiante.

Sous un microscope de dissection, injectez un nanolitre de la solution dans le sac vitellin de chaque embryon. Ensuite, retournez les embryons injectés dans une boîte de Pétri étiquetée et recouvrez-les d’un milieu 1X E3 avec du bleu de méthylène. Placez les embryons injectés dans un incubateur à 28 degrés Celsius pendant 24 heures.

Ensuite, inspectez les embryons injectés pour retirer les individus morts ou en développement anormal. Tout d’abord, prélevez deux séries de cinq embryons de 72 heures dans les plaques contenant les embryons injectés et une série de cinq embryons de 72 heures du groupe témoin non injecté dans les tubes de la microcentrifugeuse. Pipetez doucement le milieu de chaque ensemble d’embryons et anesthésez-les.

Retirez l’anesthésique après deux minutes et ajoutez 45 microlitres d’hydroxyde de sodium de 50 millimolaires. Ensuite, incubez les échantillons à 95 degrés pendant 10 minutes. Ensuite, retirez les échantillons de l’incubateur et laissez-les refroidir à température ambiante.

Ajoutez cinq microlitres de chlorhydrate de tris de pH molaire et agitez vigoureusement les échantillons. Ensuite, centrifugez la solution à vitesse maximale à température ambiante pendant trois minutes. Transférez le surnageant, qui contient l’ADN génomique, dans un nouveau tube étiqueté et stockez l’ADNg à moins 20 degrés Celsius.

Utilisez les amorces conçues pour amplifier autour de la région cible de l’ARNsg comme décrit dans le texte pour amplifier un fragment de PCR pour l’analyse hétéroduplex. Utilisez un kit de nettoyage PCR pour purifier les produits de la réaction PCR. Diluez les échantillons dans 30 microlitres d’eau et utilisez un spectrophotomètre pour quantifier l’ADN.

Placez les tubes contenant les amplicons PCR dans une grille flottante dans un bain d’eau bouillante. Préparez ensuite un gel TBE à 15 % de polyacrylamide en utilisant 30 % de polyacrylamide. Une fois que le gel a pris, placez-le dans un appareil d’électrophorèse avec tampon de fonctionnement TBE.

Chargez ensuite 500 nanogrammes de produits PCR recuits et chargez un témoin à côté de chaque ensemble d’échantillons d’ARNsg. Faites fonctionner le gel à 150 volts pendant deux heures et demie ou jusqu’à ce que la face du colorant se trouve au bas du gel. Grandir a injecté des embryons de poisson-zèbre à l’âge adulte qui présentent des bandes hétéroduplex dans le HMA.

Pour interpréter le HMA, comparez l’intensité de la bande homoduplex de la PCR du contrôle non injecté de type sauvage aux échantillons injectés correspondants. S’il y a eu une coupe suffisante, l’intensité de la bande du poisson injecté doit être inférieure d’environ 50 % à celle du témoin de type sauvage. Pour confirmer la présence d’indels chez les poissons parents fondateurs potentiels, anesthésez le poisson avec 0,004 % de tricaïne et utilisez une lame de rasoir propre pour enlever 1/2 à 3/4 de la nageoire caudale.

Ensuite, placez la queue dans 45 microlitres d’hydroxyde de sodium de 50 millimolaires. Remettez le poisson dans un réservoir de récupération et effectuez l’extraction de l’ADNg comme décrit précédemment. Ensuite, effectuez une HMA sur l’ADNg du clip de queue pour déterminer si l’individu a été modifié avec succès par injection CRISPR.

Ensuite, reproduisez les adultes qui présentent des bandes hétéroduplex dans l’ADN de la queue avec des poissons de type sauvage. Sélectionner les poissons fondateurs pour générer des poissons F1 sur la base de l’analyse HMA des fosses. Enfin, séquencez l’ADNg du poisson d’intérêt pour caractériser la nature de l’indel.

Après la production et la micro-injection réussies de réactifs CRISPR, les embryons de poisson-zèbre ont été analysés pour détecter les phénotypes manifestes et la formation d’indel à l’aide de HMA. La formation d’indel induite par Cas9 au niveau de la tyrosinase entraîne une perte de pigmentation et est facilement évaluée 48 heures après la fécondation. L’identification des allèles modifiés par CRISPR qui n’entraînent pas de phénotypes de développement manifestes est effectuée à l’aide de l’HMA.

Le ciblage réussi du gène d’intérêt entraîne la formation de bandes hétéroduplex et une réduction de l’intensité de la bande homoduplex, comme dans les voies trois et quatre. N’oubliez pas que travailler avec un organisme vertébré comporte des responsabilités éthiques. Ce protocole décrit des stratégies qui minimisent le nombre de poissons-zèbres nécessaires pour obtenir un knock-out, un objectif qui doit être pris en compte lors de l’exécution de cette procédure.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être utilisée pour générer et identifier rapidement le poisson-zèbre porteur d’allèles modifiés par CRISPR qui seront transmis dans la lignée germinale avec une grande efficacité. Il est important de noter que cette technique a été optimisée pour être une approche peu coûteuse qui convient aux étudiants de premier cycle et à d’autres personnes ayant peu d’expérience préalable. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de concevoir et de mettre en œuvre facilement une approche d’inactivation de gènes basée sur CRISPR à l’aide de poissons-zèbres.