Name: Déterminer le rôle des gènes exprimés par la mère dans le développement précoce des croustillants maternels (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-12-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Découvrez une technique CRISPR-Cas9 maternelle pour identifier rapidement les gènes à effet maternel dans le développement embryonnaire précoce du zèbre. Cette méthode permet d'étudier les phénotypes en une seule génération.

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Nous remercions les membres passés et actuels du personnel d’élevage du laboratoire Pelegri pour les soins qu’ils ont prodigués à l’installation aquatique. Nous sommes également reconnaissants pour les commentaires et la perspicacité sur le manuscrit par Ryan Trevena et Diane Hanson. Le financement a été fourni par la subvention des NIH à F.P. (GM065303)

<ol><li>Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maternal+factors+in+zebrafish+development%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Maternal factors in zebrafish development.</a> Developmental Dynamics. 228 (3), 535-554 (2003).</li>
<li>Campbell, P. D., Heim, A. E., Smith, M. Z., Marlow, F. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinesin-1+interacts+with+Bucky+ball+to+form+germ+cells+and+is+required+to+pattern+the+zebrafish+body+axis%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Kinesin-1 interacts with Bucky ball to form germ cells and is required to pattern the zebrafish body axis.</a> Development. 142 (17), Cambridge, England. 2996-3008 (2015).</li>
<li>Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((aura+%28mid1ip1l%29+regulates+the+cytoskeleton+at+the+zebrafish+egg-to-embryo+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition.</a> Development. 143 (9), Cambridge, England. 1585-1599 (2016).</li>
<li>He, W. -X., et al. Oocyte-specific maternal Slbp2 is required for replication-dependent histone storage and early nuclear cleavage in zebrafish oogenesis and embryogenesis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aHe%2C+W-X+%22RNA%22">RNA</a>. 24 (12), RNA. New York, N.Y. 1738-1748 (2018).</li>
<li>Burger, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Maximizing+mutagenesis+with+solubilized+CRISPR-Cas9+ribonucleoprotein+complexes%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Maximizing mutagenesis with solubilized CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes.</a> Development. 143 (11), Cambridge, England. 2025-2037 (2016).</li>
<li>Jao, L. -E., Wente, S. R., Chen, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+multiplex+biallelic+zebrafish+genome+editing+using+a+CRISPR+nuclease+system%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">Efficient multiplex biallelic zebrafish genome editing using a CRISPR nuclease system.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110 (34), 13904-13909 (2013).</li>
<li>Shah, A. N., Davey, C. F., Whitebirch, A. C., Miller, A. C., Moens, C. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+reverse+genetic+screening+using+CRISPR+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">Rapid reverse genetic screening using CRISPR in zebrafish.</a> Nature Methods. 12 (6), 535-540 (2015).</li>
<li>Shankaran, S. S., Dahlem, T. J., Bisgrove, B. W., Yost, H. J., Tristani-Firouzi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-directed+gene+editing+for+the+generation+of+loss-of-function+mutants+in+high-throughput+zebrafish+F0+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Current+Protocols+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-directed gene editing for the generation of loss-of-function mutants in high-throughput zebrafish F0 screens.</a> Current Protocols in Molecular Biology. 119 (1), 1-22 (2017).</li>
<li>Trubiroha, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+CRISPR%2FCas-based+mutagenesis+assay+in+zebrafish+for+identification+of+genes+involved+in+thyroid+morphogenesis+and+function%5BTitle%5D)+AND+%22Scientific+Reports%22%5BJournal%5D)">A Rapid CRISPR/Cas-based mutagenesis assay in zebrafish for identification of genes involved in thyroid morphogenesis and function.</a> Scientific Reports. 8 (1), 5647(2018).</li>
<li>Wu, R. S., Lam, I. I., Clay, H., Duong, D. N., Deo, R. C., Coughlin, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Rapid+method+for+directed+gene+knockout+for+screening+in+G0+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">A Rapid method for directed gene knockout for screening in G0 zebrafish.</a> Developmental Cell. 46 (1), 112-125 (2018).</li>
<li>Moravec, C. E., Voit, G. C., Otterlee, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+maternal-effect+genes+in+zebrafish+using+maternal+crispants%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Identification of maternal-effect genes in zebrafish using maternal crispants.</a> Development. 148 (19), Cambridge, England. 199536(2021).</li>
<li>Braat, A. K., Zandbergen, T., van de Water, S., Goos, H. J., Zivkovic, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+zebrafish+primordial+germ+cells%3A+morphology+and+early+distribution+of+vasa+RNA%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">Characterization of zebrafish primordial germ cells: morphology and early distribution of vasa RNA.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 216 (2), 153-167 (1999).</li>
<li>Eno, C., Hansen, C. L., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aggregation%2C+segregation%2C+and+dispersal+of+homotypic+germ+plasm+RNPs+in+the+early+zebrafish+embryo%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%22%5BJournal%5D)">Aggregation, segregation, and dispersal of homotypic germ plasm RNPs in the early zebrafish embryo.</a> Developmental Dynamics. 248 (4), 306-318 (2019).</li>
<li>Knaut, H., Steinbeisser, H., Schwarz, H., Nüsslein-Volhard, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+evolutionary+conserved+region+in+the+vasa+3%27UTR+targets+RNA+translation+to+the+germ+cells+in+the+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Current+biology%3A+CB%22%5BJournal%5D)">An evolutionary conserved region in the vasa 3'UTR targets RNA translation to the germ cells in the zebrafish.</a> Current biology: CB. 12 (6), 454-466 (2002).</li>
<li>Yoon, C., Kawakami, K., Hopkins, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+vasa+homologue+RNA+is+localized+to+the+cleavage+planes+of+2-+and+4-cell-stage+embryos+and+is+expressed+in+the+primordial+germ+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">Zebrafish vasa homologue RNA is localized to the cleavage planes of 2- and 4-cell-stage embryos and is expressed in the primordial germ cells.</a> Development. 124 (16), Cambridge, England. 3157-3165 (1997).</li>
<li>Gagnon, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Efficient+mutagenesis+by+Cas9+protein-mediated+oligonucleotide+insertion+and+large-scale+assessment+of+single-guide+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+ONE%22%5BJournal%5D)">Efficient mutagenesis by Cas9 protein-mediated oligonucleotide insertion and large-scale assessment of single-guide RNAs.</a> PLoS ONE. 9 (5), 98186(2014).</li>
<li>Labun, K., Montague, T. G., Gagnon, J. A., Thyme, S. B., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v2%3A+a+web+tool+for+the+next+generation+of+CRISPR+genome+engineering%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v2: a web tool for the next generation of CRISPR genome engineering.</a> Nucleic Acids Research. 44, 272-276 (2016).</li>
<li>Labun, K., Montague, T. G., Krause, M., Torres Cleuren, Y. N., Tjeldnes, H., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP+v3%3A+expanding+the+CRISPR+web+toolbox+beyond+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP v3: expanding the CRISPR web toolbox beyond genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 47, 171-174 (2019).</li>
<li>Montague, T. G., Cruz, J. M., Gagnon, J. A., Church, G. M., Valen, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CHOPCHOP%3A+a+CRISPR%2FCas9+and+TALEN+web+tool+for+genome+editing%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Research%22%5BJournal%5D)">CHOPCHOP: a CRISPR/Cas9 and TALEN web tool for genome editing.</a> Nucleic Acids Research. 42, 401-407 (2014).</li>
<li>Moravec, C. E., Pelegri, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+accessible+protocol+for+the+generation+of+CRISPR-Cas9+knockouts+using+INDELs+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Molecular+Biology%22%5BJournal%5D)">An accessible protocol for the generation of CRISPR-Cas9 knockouts using INDELs in zebrafish.</a> Methods in Molecular Biology. 1920, Clifton, N.J. 377-392 (2019).</li>
<li>White, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-resolution+mRNA+expression+time+course+of+embryonic+development+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">A high-resolution mRNA expression time course of embryonic development in zebrafish.</a> eLife. 6, 30860(2017).</li>
<li>Aanes, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zebrafish+mRNA+sequencing+deciphers+novelties+in+transcriptome+dynamics+during+maternal+to+zygotic+transition%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Research%22%5BJournal%5D)">Zebrafish mRNA sequencing deciphers novelties in transcriptome dynamics during maternal to zygotic transition.</a> Genome Research. 21 (8), 1328-1338 (2011).</li>
<li>Aken, B. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+Ensembl+gene+annotation+system%5BTitle%5D)+AND+%22Database%3A+The+Journal+of+Biological+Databases+and+Curation%22%5BJournal%5D)">The Ensembl gene annotation system.</a> Database: The Journal of Biological Databases and Curation. 2016, (2016).</li>
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<li>Kotani, H., Taimatsu, K., Ohga, R., Ota, S., Kawahara, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((efficient+multiple+genome+modifications+induced+by+the+crRNAs%2C+tracrRNA+and+Cas9+protein+complex+in+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22PloS+One%22%5BJournal%5D)">efficient multiple genome modifications induced by the crRNAs, tracrRNA and Cas9 protein complex in zebrafish.</a> PloS One. 10 (5), 0128319(2015).</li>
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<li>Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ploidy+manipulation+of+zebrafish+embryos+with+Heat+Shock+2+treatment%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (118), e54492(2016).</li>
<li>Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+oocyte+culture-based+manipulation+of+zebrafish+maternal+genes%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Dynamics%3A+An+Official+Publication+of+the+American+Association+of+Anatomists%22%5BJournal%5D)">In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes.</a> Developmental Dynamics: An Official Publication of the American Association of Anatomists. 242 (1), 44-52 (2013).</li>
<li>Kushawah, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-Cas13d+induces+efficient+mRNA+knockdown+in+animal+embryos%5BTitle%5D)+AND+%22Developmental+Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-Cas13d induces efficient mRNA knockdown in animal embryos.</a> Developmental Cell. 54 (6), 805-817 (2020).</li>
<li>Kroeger, P. T., Poureetezadi, S. J., McKee, R., Jou, J., Miceli, R., Wingert, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+haploid+zebrafish+embryos+by+in+vitro+fertilization%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Visualized+Experiments%3A+JoVE%22%5BJournal%5D)">Production of haploid zebrafish embryos by in vitro fertilization.</a> Journal of Visualized Experiments: JoVE. (89), e51708(2014).</li>
<li>Xiao, T., Roeser, T., Staub, W., Baier, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+GFP-based+genetic+screen+reveals+mutations+that+disrupt+the+architecture+of+the+zebrafish+retinotectal+projection%5BTitle%5D)+AND+%22Development%22%5BJournal%5D)">A GFP-based genetic screen reveals mutations that disrupt the architecture of the zebrafish retinotectal projection.</a> Development. 132 (13), Cambridge, England. 2955-2967 (2005).</li>
<li>Riemer, S., Bontems, F., Krishnakumar, P., Gömann, J., Dosch, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+functional+Bucky+ball-GFP+transgene+visualizes+germ+plasm+in+living+zebrafish%5BTitle%5D)+AND+%22Gene+Expression+Patterns%3A+GEP%22%5BJournal%5D)">A functional Bucky ball-GFP transgene visualizes germ plasm in living zebrafish.</a> Gene Expression Patterns: GEP. 18 (1-2), 44-52 (2015).</li>
<li>Moreno-Mateos, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRscan%3A+designing+highly+efficient+sgRNAs+for+CRISPR-Cas9+targeting+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Methods%22%5BJournal%5D)">CRISPRscan: designing highly efficient sgRNAs for CRISPR-Cas9 targeting in vivo.</a> Nature Methods. 12 (10), 982-988 (2015).</li>
</ol>

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Le protocole présenté dans ce manuscrit permet l’identification et la caractérisation moléculaire primaire d’un phénotype d’effet maternel en une seule génération au lieu des générations multiples requises pour les techniques génétiques directes et inverses. Actuellement, le rôle de nombreux gènes exprimés par la mère est inconnu. Ce manque de connaissances est en partie dû à la génération supplémentaire nécessaire pour visualiser un phénotype lors de l’identification des gènes de l’effet maternel. Dans le passé, l’ident...

Un pool de produits déposés par la mère (par exemple, ARN, protéines et autres biomolécules) est nécessaire pour tous les processus cellulaires précoces jusqu’à ce que le génome zygotique de l’embryon soit activé1. L’épuisement prématuré de ces produits de l’ovocyte est généralement létal embryonnaire. Malgré l’importance de ces gènes dans le développement, le rôle de nombreux gènes exprimés par la mère est actuellement inconnu. Les progrès de la technologie d’édition de gènes chez le poisson zèbre, tels que CRISPR-Cas9, permettent de cibler les gènes exprimés par la mère 2,3,4. Cependant, l’identification d’un phénotype d’effet maternel nécessite une génération supplémentaire par rapport à un phénotype zygotique, nécessitant ainsi plus de ressources. Récemment, la capacité d’édition biallélique de CRISPR-Cas9 a été utilisée pour dépister les phénotypes embryonnaires dans les tissus somatiques d’embryons injectés (F0), connus sous le nom de « crispants »5,6,7,8,9,10. La technique de crispant permet un criblage efficace des gènes candidats dans les cellules somatiques, facilitant ainsi la compréhension des aspects spécifiques du développement. Le protocole décrit dans cet article permet d’identifier les phénotypes de l’effet maternel, ou « crispants maternels », en une seule génération11. Ce schéma est réalisable en multiplexant les ARN guides vers un seul gène et en favorisant les événements d’édition bialléliques dans la lignée germinale. Ces embryons maternels crispants peuvent être identifiés par des phénotypes morphologiques macroscopiques et faire l’objet d’une caractérisation primaire, telle que l’étiquetage des limites cellulaires et la structuration de l’ADN11. L’analyse combinée du phénotype observable et la caractérisation moléculaire de base des INDEL induites permettent de prédire le rôle du gène ciblé dans le développement précoce.
Chez le poisson zèbre, au cours des premières 24 heures post-fécondation (HPF), un petit groupe de cellules se développe dans les cellules germinales primordiales, un précurseur de la lignée germinale12,13,14,15. Dans les couvées pondues par les femelles F0, la proportion d’embryons maternels crispants récupérés dépend du nombre de cellules germinales contenant un événement d’édition biallélique dans le gène ciblé. En général, plus l’événement d’édition se produit tôt dans l’embryon, plus la probabilité que des mutations CRISPR-Cas9 soient observées dans la lignée germinale est élevée. Dans la plupart des cas, les phénotypes des embryons maternels crispants proviennent de la perte de fonction des deux allèles maternels présents dans l’ovocyte en développement. Lorsque l’ovocyte termine la méiose, l’un des allèles maternels est extrudé de l’embryon via le corps polaire, tandis que l’autre allèle est incorporé dans le pronucleus maternel. Le séquençage de multiples haploïdes maternels crispants représentera un mélange des mutations (insertions et/ou délétions (INDEL)) présentes dans la lignée germinale qui contribuent au phénotype11.
Le protocole suivant décrit les étapes nécessaires pour créer des mutations CRISPR-Cas9 dans les gènes de l’effet maternel et identifier le phénotype correspondant à l’aide d’une approche de crispant maternel (Figure 1). La première section expliquera comment concevoir et créer efficacement des ARN guides, tandis que les sections deux et trois contiennent des étapes critiques pour la création de crispants maternels par micro-injection. Après l’injection du mélange CRISPR-Cas9, les embryons injectés sont examinés pour les modifications somatiques par PCR (section quatre). Une fois que les embryons F0 injectés se développent et atteignent la maturité sexuelle, les femelles F0 sont croisées avec des mâles de type sauvage, et leur progéniture est examinée pour les phénotypes d’effet maternel (section cinq). La section six comprend des instructions sur la fabrication d’haploïdes maternels crispants qui peuvent être combinés avec le séquençage de Sanger pour identifier les INDEL induites par CRISPR-Cas9. En outre, la discussion contient des modifications qui peuvent être apportées au protocole pour augmenter la sensibilité et la puissance de cette méthode.

déterminer le rôle des gènes exprimés par la mère dans le développement précoce des croustillants maternels

Determining the Role of Maternally-Expressed Genes in Early Development with Maternal Crispants

Le développement précoce dépend d’un ensemble de facteurs maternels incorporés dans l’ovocyte mature au cours de l’oogenèse qui remplissent toutes les fonctions cellulaires nécessaires au développement jusqu’à l’activation du génome zygotique. En règle générale, le ciblage génétique de ces facteurs maternels nécessite une génération supplémentaire pour identifier les phénotypes d’effet maternel, ce qui entrave la capacité de déterminer le rôle des gènes exprimés par la mère au cours du développement. La découverte des capacités d’édition biallélique de CRISPR-Cas9 a permis le criblage de phénotypes embryonnaires dans les tissus somatiques d’embryons injectés ou de « crispants », augmentant ainsi la compréhension du rôle que jouent les gènes exprimés zygotiquement dans les programmes de développement. Cet article décrit un protocole qui est une extension de la méthode crispant. Dans cette méthode, l’édition biallélique des cellules germinales permet d’isoler un phénotype d’effet maternel en une seule génération, ou « crispants maternels ». Le multiplexage des ARN guides vers une seule cible favorise la production efficace de crispants maternels, tandis que l’analyse de séquence des haploïdes maternels crispants fournit une méthode simple pour corroborer les lésions génétiques qui produisent un phénotype d’effet maternel. L’utilisation de crispants maternels favorise l’identification rapide des gènes essentiels exprimés par la mère, facilitant ainsi la compréhension du développement précoce.

L’approche expérimentale décrite dans ce protocole permet d’identifier les phénotypes d’effet maternel de manière rapide et économe en ressources (Figure 1).
Générer des crispants maternels : Lors de la conception des quatre ARN guides pour cibler un seul gène candidat de l’effet maternel, une attention particulière doit être accordée à l’endroit où les ARN guides se lieront à l’ADN. En général, ils devraient tous être regroupés avec peu ou pas...

Le développement précoce dépend des produits hérités de la mère, et le rôle de bon nombre de ces produits est actuellement inconnu. Ici, nous avons décrit un protocole qui utilise CRISPR-Cas9 pour identifier les phénotypes d’effet maternel en une seule génération.

Déterminer le rôle des gènes exprimés par la mère dans le développement précoce des croustillants maternels

Early development depends on a pool of maternal factors incorporated into the mature oocyte during oogenesis that perform all cellular functions necessary ...

Le rôle de nombreux gènes exprimés par la mère au cours du développement précoce est actuellement inconnu. Cette technique CRISPR maternelle permet l’identification rapide des gènes d’effet maternel et de leur rôle dans le développement. Le multiplexage guide les ARN vers un seul gène permet aux chercheurs d’identifier de nouveaux phénotypes d’effets maternels en une seule génération.Cette recherche est bénéfique pour comprendre la fonction des transcrits d’ARNm dans les gamètes, qui sont nécessaires à l’embryogenèse précoce. La clé de cette technique est de micro-injecter les embryons au début du stade d’une cellule, et de vérifier que la majorité des ARN guides peuvent faire des mutations somatiques dans les embryons injectés. Pour créer un modèle d’ARN guide pour chaque oligonucléotide spécifique au gène, analyte à l’oligonucléotide constant et remplir les surplombs avec de l’ADN polymérase T4.Une fois les quatre modèles d’ARN guides assemblés, purifiez-les et concentrez-les ensemble à l’aide d’un kit de nettoyage et de concentrateur d’ADN. Synthétisez le mélange d’ARNg à partir du modèle d’ARN de hauban mis en commun, en utilisant un kit de transcription T7 in vitro, et effectuez la transcription in vitro comme décrit dans le manuscrit. Pour vérifier l’intégrité de l’ARNg, lancez un gel de bromure d’éthidium Tris-Borate-EDTA à 1% d’agarose 0,5 par millilitre.Placer le gel solidifié dans un tampon de fonctionnement Tris-Borate-EDTA. Mélanger un mélange d’ARNg de microlitre et un tampon de chargement de gel d’ARN de microlitre. Chargez cet échantillon dans le gel et faites fonctionner le gel à 100 volts pendant cinq minutes.Visualisez les bandes à l’aide de la lumière ultraviolette. Mettez en place des croisements de type sauvage et des boîtes d’accouplement de poisson zèbre. Gardez les poissons mâles et femelles dans le même réservoir, mais séparez-les à l’aide d’un séparateur de boîte d’accouplement, ou comme indiqué ici, en plaçant la femelle à l’intérieur d’un insert de ponte.Une fois le cocktail d’injection assemblé, laissez le mâle et la femelle s’accoupler en retirant le séparateur de boîte d’accouplement ou, comme illustré ici, en plaçant le mâle dans le même insert de ponte que la femelle. Pour synchroniser les embryons, prélevez-les après 10 minutes à l’aide d’une passoire en plastique et rincez-les dans une boîte de Petri à l’aide d’un support 1XE3. Prélever 10 à 15 embryons et les placer dans une boîte de Petri séparée pour les conserver comme témoins non injectés.Transférer les embryons restants dans les puits de la plaque d’injection. Injecter une solution d’ARNg de protéine nanolitre dans le disque blasto en développement d’un embryon unicellulaire. Utilisez une pince pour casser la pointe de l’aiguille obstruée et recalibrez l’aiguille pour éjecter un bolus d’un nanolitre.Le lendemain de l’injection, prélever six embryons injectés sains et deux embryons témoins dans la plaque non injectée. Placez chaque embryon individuellement dans un seul puits d’un tube en bande PCR et étiquetez le dessus des tubes. Concevoir des amorces de criblage uniques pour chaque site guide afin d’amplifier un fragment d’ADN apparié de 100 à 110 bases qui comprend le site cible CRISPR-Cas9.Si possible, placez le site cible au milieu du fragment amplifié, ce qui permet d’identifier les délétions plus importantes. Pour chacun des quatre sites cibles guides, mettre en place huit réactions PCR de 25 microlitres en utilisant cinq microlitres d’ADN embryogénomique unique préparé et 20 microlitres du mélange PCR, et guider le mélange d’amorces de criblage spécifiques, afin d’identifier les mutations somatiques dans le site cible. Couler un gel de bromure de tris-borate-EDTA à 2,5 %, 0,5 microgramme par millilitre d’éthidium à l’aide de peignes qui créent des puits d’environ 0,625 centimètre de large.Placez ensuite le gel solidifié dans la chambre d’électrophorèse contenant le tampon courant Tris-Borate-EDTA. Ajoutez cinq microlitres de colorant de chargement 6X au produit PCR. Chargez 25 microlitres de ce mélange dans le gel, en vous assurant que les échantillons injectés et témoins fonctionnent sur la même rangée de gel.Une fois tous les échantillons chargés, ajoutez cinq microlitres de bromure d’éthidium par litre de tampon courant Tris-Borate-EDTA, à l’extrémité positive de la boîte de gel. Faites fonctionner le gel à 120 volts jusqu’à ce que les interdictions d’ADN se résolvent ou que l’ADN ait approché de la fin de la voie. Pour identifier les phénotypes d’effet maternel et les embryons maternels de CRISPR, installez les femelles injectées F0 contre les mâles de type sauvage et contrôlez les croisements de type sauvage dans des boîtes d’accouplement standard de poissons zèbres pendant l’après-midi précédant l’expérience.Placez les poissons mâles et femelles dans le même réservoir, mais séparez-les avec un séparateur de boîte d’accouplement, ou placez la femelle à l’intérieur d’un insert de ponte. Le matin de l’expérience, laissez le mâle et la femelle commencer à s’accoupler en retirant le séparateur de boîte d’accouplement ou en plaçant le mâle dans le même insert de ponte que la femelle. Prélevez les embryons toutes les 10 minutes en déplaçant l’insert de ponte dans un nouveau fond de réservoir d’accouplement contenant de l’eau fraîche du système, et étiquetez le réservoir avec une étiquette identifiant la femelle F0 individuelle.Prenez l’ancien réservoir d’accouplement et versez l’eau à travers une passoire en T pour recueillir les embryons d’une couvée individuelle de 10 minutes. Sous un microscope à dissection avec une source de lumière transcendante, observez les embryons en cours de développement toutes les heures, pendant les six à huit premières heures et quotidiennement pendant les cinq jours suivants. Déplacer les embryons CRISPR maternels potentiels vers une boîte de Petri contenant un milieu 1XE3 et tester le phénotype morphologique 24 heures après la fécondation et la viabilité cinq jours après la fécondation.L’après-midi précédant l’expérience, mettez en place des paires d’accouplement de femelles F0 en gardant les mâles de type sauvage physiquement séparés des femelles, en utilisant un séparateur de boîte d’accouplement ou en plaçant la femelle dans l’insert de ponte. Le matin de l’expérience, retirez la cloison physique pour initier l’accouplement. Au premier signe de ponte, interrompre la reproduction en séparant le mâle et les femelles F0 et garder chaque femelle F0 séparée dans des boîtes d’accouplement individuelles.Après la fécondation in vitro, laissez les embryons haploïdes se développer jusqu’à ce que le phénotype maternel CRISPR soit observé, et placez ces embryons dans une boîte de Pétri différente. Une fois que les embryons haploïdes CRISPR maternels ont été identifiés, laissez-les se développer pendant au moins six heures après la fécondation. Pour extraire l’ADN génomique d’au moins 10 embryons haploïdes CRISPR maternels, placez un seul embryon haploïde dans un puits individuel d’un tube en bandelette de PCR, retirez l’excès de milieu E3 du puits et ajoutez 50 microlitres d’hydroxyde de sodium de 50 millimolaires.Incuber les embryons pendant 20 minutes à 95 degrés Celsius et les refroidir à quatre degrés Celsius. Ajoutez ensuite cinq microlitres d’une molaire d’acide trichlorhydrique avec un pH de 7,5 et un vortex de cinq à 10 secondes. Pour identifier les sites guides contenant des indels, concevez des amorces de séquençage pour amplifier un fragment d’ADN comprenant les quatre sites cibles CRISPR / Cas9.Mettre en place deux 25 microlitres de réactions PCR par embryon, en utilisant cinq microlitres de l’ADN génomique préparé, et les amorces de séquençage. Une fois la PCR terminée, purifiez et concentrez les deux échantillons à l’aide d’un kit de nettoyage et de concentrateur d’ADN, et soumettez le fragment d’ADN au séquençage de Sanger, en utilisant les amorces de séquençage avant et arrière. Les ARN guides doivent tous être regroupés avec peu ou pas de chevauchement des régions entre les ARN guides au cours de la génération maternelle de CRISPR.Si des indels ont été créés, un frottis doit être observé dans les échantillons injectés sur un gel d’agarose, mais pas dans le témoin non injecté. La méthode maternelle CRISPR peut être utilisée pour phénocopier les mutations connues de l’effet maternel, telles que motley, tmi et aura. Pour identifier les lésions génétiques qui contribuent au phénotype maternel CRISPR, les spermatozoïdes traités aux UV et la fécondation in vitro sont combinés pour créer des haploïdes CRISPR maternels.La création d’un haploïde permet le séquençage de Sanger de l’allèle maternel et l’identification des indels CRISPR maternels. Lors de l’identification d’un phénotype d’effet non maternel, il est essentiel que vous puissiez l’observer chez plusieurs femelles F0, car cela augmente les chances que le phénotype soit causé par une perte de fonction, et non par des effets hors cible ou non spécifiques. Une fois qu’un phénotype d’effet maternel a été identifié, les embryons maternels CRISPR peuvent être utilisés pour examiner les effets sur divers aspects de l’embryogenèse précoce, tels que le squelette sinusal ou la ségrégation de l’ADN.Cela permet aux chercheurs de comprendre la cause moléculaire du phénotype. Cette méthode teste directement la fonction de gènes inconnus exprimés par la mère en une seule génération, accélérant notre compréhension des processus, agissant au début de l’embryogenèse.

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