Vérifier dans un modèle de Culture cellulaire 3D basé sur l’ellipsoïde tête et cou, carcinome épidermoïde de la thérapie

L’objectif global de cette méthode in vitro est de générer les sphéroïdes de culture cellulaire tridimensionnelle qui permettent de tester les schémas thérapeutiques standard ou expérimentaux actuels pour le carcinome épidermoïde de la tête et du cou. Cette méthode nous aide à comprendre la croissance tumorale tridimensionnelle des cellules cancéreuses de la tête et du cou lorsqu’elles sont exposées à des radiations ou à des traitements de chimiothérapie. Il reste à dire que la manipulation des cellules tumorales primaires est difficile et ne conduit pas toujours à une formation fiable de sphéroïdes tridimensionnels.

Sabina Schwenk-Zieger, une technicienne de notre laboratoire, fera la démonstration de la procédure. Lors de l’utilisation de cellules primaires d’un échantillon tumoral, placez l’échantillon sur une surface appropriée et stérile et coupez-le soigneusement avec un scalpel stérile à usage unique en très petits morceaux. Après une séparation mécanique suffisante du tissu primaire, transférez-le dans un flacon contenant de la collagénase 1 et 2 et incubez-le pendant une heure à 37 degrés Celsius.

Ensuite, tamisez le mélange à travers une passoire à cellules Falcon de 70 micromètres et lavez la suspension avec HBSS. Après une séparation réussie et un lavage ultérieur, transférez la suspension contenant un à deux millions de cellules dans un flacon de culture cellulaire T75 pour qu’elle atteigne une sous-confluence à 37 degrés Celsius pendant dix jours maximum. Au microscope, confirmez la croissance des cellules tumorales.

Comptez les cellules en culture. À l’aide d’une plaque à 96 puits à très faible adhérence à fond rond concave, ensemencez 5 000 cellules tumorales primaires, ou 1 000 à 2 000 cellules de lignée cellulaire intermédiaire, dans 200 à 300 microlitres de milieu dans les puits. Ensuite, cultivez les cellules à 37 degrés Celsius.

Effectuez des changements de support tous les deux jours. Veillez à ne pas aspirer le sphéroïde avec la pipette lors des changements de support. Cultivez les sphéroïdes jusqu’à ce que les conglomérats cellulaires tridimensionnels en forme de sphéroïde soient observés.

N’oubliez pas d’exclure les puits avec une formation irrégulière ou plusieurs sphéroïdes d’une enquête plus approfondie. Par la suite, remplacez les milieux par des milieux contenant des chimiothérapies et/ou des anticorps monoclonaux aux concentrations souhaitées. Ajoutez du cisplatine à des concentrations de 2,5, cinq ou 10 micromolaires ou du 5-fluorouracile à 30 micromolaires.

Dans cette procédure, mesurez la taille du sphéroïde après la documentation photo numérique le jour six, le jour 10 et le jour 16 avec un logiciel graphique. Après centrifugation de la plaque à 520g pendant 2,5 minutes, retirez le surnageant. Ensuite, lavez les cellules avec 1x PBS et centrifugez à nouveau la plaque, puis retirez le surnageant.

Ensuite, ajoutez 100 microlitres de solution enzymatique de détachement cellulaire dans chaque flacon pour permettre aux sphéroïdes de se dissoudre. Ensuite, incubez la plaque pendant huit minutes à 37 degrés Celsius. Vérifiez la dissolution réussie des sphéroïdes au microscope.

Ajoutez 100 microlitres de DMEM. Ensuite, centrifugez la plaque à 520 g pendant 2,5 minutes. Retirez ensuite le surnageant et suspendez les cellules dans 100 microlitres de DMEM.

Par la suite, si nécessaire, effectuer un test colorimétrique de prolifération disponible dans le commerce et lire le test dans un lecteur ELISA. Toutes les lignées cellulaires pourraient générer des sphéroïdes fiables avec des différences de taille et de temps de lecture. Les cellules primaires ont formé des sphéroïdes reproductibles dans des plaques de fixation ultra-faibles.

La coloration au Ki-67 révèle la périphérie de la culture, montrant des taux de prolifération beaucoup plus élevés que les cellules centrales, imitant la distribution des nutriments dans les tumeurs muqueuses solides qui présentent souvent des noyaux nécrotiques. Ici, l’effet de plusieurs chimiothérapies et radiations sur la taille des sphéroïdes. La radiothérapie avec deux gris avant le traitement par cisplatine a entraîné une diminution significative de la taille des sphéroïdes par rapport au cisplatine seul.

Avec l’établissement ultérieur de la génération de sphéroïdes à partir de cellules humaines primaires, c’est ainsi que le concept de test thérapeutique pourrait être mis en œuvre. Des sphéroïdes seraient générés après la biopsie tumorale, puis testés pour leurs caractéristiques moléculaires et leur sensibilité au traitement. Nous avons pu établir un protocole pour générer des sphéroïdes reproductibles à partir de suspensions cellulaires pour les lignées cellulaires et les cellules tumorales humaines primaires.

Ce test multimodal est suffisamment sensible pour identifier de petites différences entre les groupes. À l’avenir, le test pourrait être utilisé pour évaluer d’abord la réponse individuelle aux protocoles de thérapie standard et expérimentaux. Deuxièmement, caractériser davantage les cellules tumorales à partir d’échantillons frais.

Et troisièmement, corréler la réponse thérapeutique aux modèles moléculaires. L’utilisation de cellules primaires et la génération de sphéroïdes permettraient de préserver autant de caractéristiques que possible de la croissance tumorale in vivo en combinaison avec un test rentable pour étudier la réponse thérapeutique individuelle.