Name: Souris tissus adipeux collecte et le traitement pour l’analyse de l’ARN (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-31T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 13 s
Description: Apprenez la collecte de tissus adipeux blancs chez la souris et l'extraction d'ARN de haute qualité. Cette méthode permet d'étudier l'expression génique dans le métabolisme et la biologie moléculaire.

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Les auteurs n’ont rien à divulguer.

HF-régime suivant l’alimentation, les souris obèses se sont avérées ont augmenté le corps et le tissu adipeux blanc poids par rapport aux souris nourries d’un N. ARN extrait à l’aide de solution de phénol ont donné des échantillons avec bonne pureté. La leptine est une adipokine principalement produite par le tissu adipeux et est connue pour la corrélation positive avec la masse grasse16. Comme prévu, expression de l’ARNm leptine a augmenté chez les souris obèses en concomitance avec leur masse gr...

L’obésité est une épidémie mondiale qui peut conduire à des complications comme le type 2 diabète1. Induite par l’alimentation obèses et génétiquement modifiés des modèles animaux sont fréquemment utilisés pour la recherche dans l’obésité et ses complications associées. Traditionnellement, le tissu adipeux blanc est connu comme un compartiment de rangement pour excès d’énergie et est surtout composé de lipides alors que le tissu adipeux brun convertit l’énergie en chaleur2,3. Le tissu adipeux est dynamique et agrandira et rétrécir en fonction de nombreux facteurs tels que la prise alimentaire et l’activité physique. Par conséquent, pour déterminer les facteurs ayant contribué à ces changements, manutention et collecte adéquate du tissu adipeux sont requis4.
Parmi les tissus adipeux blancs, il est généralement admis que les dépôts de graisse sous-cutanée et viscérales ont des propriétés différentes comme la localisation anatomique et fonctionnent2,5. Par conséquent, pour éviter des résultats contradictoires ou grande variabilité, attention doit être prises pour éviter la contamination croisée entre ces différents dépôts de graisse lors de la collecte des coussinets adipeux.
En outre, il y a trois défis majeurs lorsque isoler l’ARN ou les protéines du tissu adipeux blanc souris. Tout d’abord, le collecte des coussinets adipeux chez des souris obèses n’est pas une tâche facile car la frontière qui sépare les différents dépôts de graisse blanches n’est pas toujours claire, contrairement à d’autres organes comme les reins et le coeur6. Deuxièmement, en raison de la teneur élevée en lipides du tissu adipeux, lors de l’ARN ou protéine isolation, une couche de lipides flotte sur le dessus et empêche l’accès direct à l’échantillon. Troisièmement, par opposition au tissu adipeux brun ou d’autres tissus, le tissu adipeux blanc a considérablement plus faible teneur en ARN et des protéines et il s’agit d’une préoccupation majeure lors de l’utilisation de jeunes souris, souris nourries d’une normale (N) et souris qui sont censés ont faibles masses grasses (par exemple KO modèles, traitement par des médicaments, exercent de formation, etc..) 7 , 8.
Choisir la méthode appropriée pour isoler l’ARN du tissu adipeux est donc essentiel. Méthodes alternatives à l’extraction de phénol/chloroforme sont les kits commerciaux. Ils reposent généralement sur une étape d’extraction de phénol initiale, suivie de purification RNA sur une colonne9. Cependant, ces kits sont en général plus coûteuses et donnent des échantillons de rendement plus faible, tandis que la qualité de RNA peut être variable mais sont beaucoup moins de temps. Cependant, un des grands avantages de l’extraction de solution/chloroforme phénol décrite ici est la possibilité d’isoler l’ARN, ADN et protéine d’un seul échantillon10. Étant donné que les coussinets adipeux de souris sont généralement petits et donnent la petite quantité d’ARN et de protéines (en particulier dans les modèles de souris maigre), ces protocoles maximisent les données on peut sortir d’un petit échantillon.
L’objectif de cet article est de décrire en détail une méthode afin d’assurer un prélèvement adéquat de dépôts de tissu adipeux blanc trois souris ainsi que de quantité et de qualité des ARN. RNA obtenu en suivant ce protocole peut être utilisé pour effectuer des analyses par PCR en temps réel. Ce protocole n’est pas prévu pour l’isolement des adipocytes primaires cultivées.

<table><tbody><tr><td>1 mL de seringues</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1X solution TE (10 mM de Tris-HCl et 1 mM d’EDTA&bull ; Na2. pH 8,0)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Aiguilles de 22 g Aiguilles</td><td></td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>26 g Éthanol</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td>à 75 %</td></tr><tr><td>Chauffe-bloc (bain sec)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Chloroforme</td><td>Sigma</td><td>C2432-500mL</td><td></td></tr><tr><td>dATP&nbsp ; &nbsp ; &nbsp ;</td><td>Thermo scientifique</td><td>R0141</td><td></td></tr><tr><td>dCTP&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Thermo scientifique</td><td>R0151</td><td></td></tr><tr><td>dGTP&nbsp ; &nbsp ;</td><td>Thermo scientifique</td><td>R0161</td><td></td></tr><tr><td>DNase I (1 U/&micro ; l)&nbsp ;</td><td>Thermo scientifique</td><td>EN0521</td><td></td></tr><tr><td>dTTP&nbsp ;</td><td>Thermo scientific</td><td>R0171</td><td></td></tr><tr><td>Faststart Universal SYBR green Master (Rox)</td><td>Roche</td><td>4913922001</td><td></td></tr><tr><td>Faststart universal SYBR green master (Rox) colorant fluorescent&nbsp ;</td><td>Roche</td><td>4913914001</td><td></td></tr><tr><td>Pointes</td><td></td><td></td><td></td>filtrées</tr><tr><td>Pinces&nbsp ;</td><td>Instrumentarium</td><td>HB275</td><td></td></tr><tr><td>Marteau de</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>gaze</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Régime alimentaire riche en graisses pour rongeurs</td><td>Bio-Serv, Frenchtown, NJ</td><td>F3282</td><td></td></tr><tr><td>Isopropanol&nbsp ;</td><td>Laboratoire MAT</td><td>IH-0101</td><td></td></tr><tr><td>Amorce PCR directe à la leptine (5'-GGGCTTCACCCCATTCTGA-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amorce PCR inverse à la leptine (5'-GGCTATCTGCAGCACATTTTG-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Azote</td><td></td><td></td><td></td>liquide</tr><tr><td>Maxima Transcriptase inverse (enzyme et tampon 5x)</td><td>Thermo scientific</td><td>EP0742</td><td></td></tr><tr><td>Eau nanopure (appelée eau ultrapure)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr>Gants <td></td><td></td><td></td><td>d’examen en nitrile</td></tr><tr>Gants <td></td><td></td><td></td><td>en nitrile</td></tr><tr><td>Régime normal pour rongeurs</td><td>Harlan Laboratories, Madison, WI</td><td>Harlan 2018</td><td></td></tr><tr><td>P1000 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P2 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P20 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>P200 pipetman</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Solution phénolique (TRIzol)&nbsp ;</td><td>Ambion Life Technologies</td><td>15598018</td><td></td></tr><tr><td>Feuille</td><td></td><td></td><td></td>d’aluminium pré-identifiée</tr><tr><td>Cuvette</td><td></td><td></td><td></td>de spectrophotomètre</tr><tr><td>à quartz Rack pour bandelettes</td><td></td><td></td><td></td>de tubes PCR</tr><tr><td>Racks pour bandelettes de tubes RT-PCR Hexamères</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>aléatoires&nbsp ;</td><td>Invitrogen</td><td>58875</td><td></td></tr><tr><td>PCR en temps réel Rotor Gene system&nbsp ;</td><td>Corbett research</td><td>RG-3000 Rotor-Gene Thermocycleur</td><td></td></tr><tr>Centrifugeuse <td></td><td></td><td></td><td>de paillasse réfrigérée</td></tr><tr><td>Inhibiteur de la RNase RiboLock&nbsp ;</td><td>Thermo scientific</td><td>EO0381</td><td></td></tr><tr>Tubes <td></td><td></td><td></td><td>eppendorf sans RNase 1,5 mL</td></tr><tr>Tubes <td></td><td></td><td></td>à<td>bouchon à vis sans</td></tr><tr><td>RNase Bandes de tubes PCR sans RNase (0,2 mL) et bouchons</td><td></td><td></td><td></td></tr> sans <tr><td>RNase sans eau&nbsp ;</td><td>Hyclone</td><td>SH30538.02</td><td></td></tr><tr><td>Appareil RT-PCR</td><td>Qiagen</td><td>Rotor-Gene Corbett 3000</td><td></td></tr><tr><td>Bandelettes tubulaires RT-PCR (0,1 mL) et capuchons</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>S16 amorce PCR directe (5'-ATCTCAAAGGCCCTGGTAGC-3') 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Amorce PCR inverse S16 (5' ACAAAGGTAAACCCCGATCG-3') Spectrophotomètre 10 uM</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Biochrom</td><td>Ultrospec 3100 pro</td><td></td></tr><tr><td>Mortier et pilon</td><td></td><td></td><td></td>en acier inoxydable</tr><tr><td>Coussinets chirurgicaux</td><td>Fait maison, un panneau de mousse enveloppé dans un sous-coussin</td><td></td><td></td>absorbant jetable</tr><tr><td>Ciseaux chirurgicaux&nbsp ;</td><td>Intrumentarium</td><td>130.450.11</td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Thermocycleur</td><td>Biometra</td><td>Thermocycleur</td><td></td></tr><tr><td>Mélangeur</td><td></td><td></td><td></td>vortex</tr><tr><td>Spatule</td><td></td><td></td><td></td> de pesée</tr></tbody></table>

souris tissus adipeux collecte et le traitement pour l’analyse de l’arn

Mouse Adipose Tissue Collection and Processing for RNA Analysis

Par rapport à d’autres tissus, le tissu adipeux blanc a une beaucoup moins teneur en ARN et des protéines pour des applications en aval comme la PCR en temps réel et Western Blot, puisqu’il contient surtout des lipides. Isolement d’ARN d’échantillons de tissus adipeux est aussi difficile que des mesures supplémentaires sont nécessaires pour éviter ces lipides. Nous présentons ici une procédure pour rassembler le tissu adipeux blanc trois anatomiquement différent de souris, pour traiter ces échantillons et effectuer des ARN. Nous décrivons plus loin la synthèse de cDNA et gène expériences d’expression à l’aide de la PCR en temps réel. Le protocole décrit par les présentes permet la réduction de la contamination de cheveux et de sang sur les coussinets adipeux ainsi que la contamination croisée entre les coussinets adipeux différents au cours de la collection de tissus de l’animal. Il a également été optimisé afin d’assurer une quantité adéquate et la qualité de l’ARN extrait. Ce protocole peut être largement appliqué à n’importe quel modèle de souris où des échantillons de tissus adipeux sont requises pour des expériences courantes comme la PCR en temps réel mais n’est pas prévu pour l’isolement de la culture de cellules primaires adipocytes.

En suivant la procédure de l’autopsie, le tissu adipeux blanc trois ont été recueilli et pondérée en fonction de deux groupes de souris (N et HF régime alimentaire chez les souris nourries). Comme prévu, souris sur le régime de HF avaient augmenté le poids corporel final et gain de poids par rapport à la même portée sur régime N (tableau 1). Ces observations étaient accompagnées par plus qu’une augmentation de 2 fois le poids de la PGF, PRF et SCF chez des souris obèses p...

Le but de cet article est de présenter une procédure étape par étape pour rassembler différents les tissus adipeux blancs de souris, de traiter les échantillons de matières grasses et d’extraire des RNA.

Souris tissus adipeux collecte et le traitement pour l’analyse de l’ARN

Compared to other tissues, white adipose tissue has a considerably less RNA and protein content for downstream applications such as real-time PCR and ...

L’objectif global de cette procédure est d’assurer une collecte adéquate d’échantillons de dépôts de tissu adipeux blanc de différentes souris et d’isoler une grande quantité d’ARN de bonne qualité dans le tissu. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans les domaines du métabolisme, de la biochimie et de la biologie moléculaire qui, par exemple, concernent l’expression des gènes dans le tissu adipeux de souris traitées ou génétiquement modifiées. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’isoler de grandes quantités d’ARN de bonne qualité dans le tissu adipeux qui a généralement une faible teneur en ARN.La démonstration de la procédure sera assurée par Emilie Pepin, une assistante de recherche de mon laboratoire. Après avoir euthanasié une souris, coupez la peau sur la linea alba selon le protocole de texte, puis faites deux incisions d’environ deux centimètres du milieu de la cage thoracique vers le bras droit et près des organes génitaux au-dessus du membre postérieur droit. Étirez un coin de la peau ouverte et utilisez une aiguille de calibre 22 pour la fixer sur le coussin.Ensuite, épinglez l’autre coin. À l’aide de ciseaux chirurgicaux positionné

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Le profilage de l'expression de l'ARN de régions cérébrales murines discrètes nécessite une stratégie de collecte de tissus précise et reproductible. Un protocole utilisant à la fois la section coronale du cerveau et la microdissection assistée par un carottier tissulaire est décrit ici. Le rendement et la qualité de l'ARN total obtenu à partir des échantillons résultants confirment l'utilité de la méthode décrite.

Approche non-Laser Microscopie Capture pour la microdissection des régions discrètes du cerveau de souris pour l&#39;ARN isolement total et en aval séquençage de nouvelle génération et de profil d&#39;expression génique

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Isolement de l&#39;ARN de souris Pancréas: un tissu de Ribonuclease riche

cryo-sections consécutives sont recueillies pour permettre aux applications histologiques et l'enrichissement de l'ARN pour la mesure de l'expression des gènes en utilisant des régions adjacentes à partir d'un muscle squelettique de souris unique. ARN de haute qualité est obtenu à partir de 20 - 30 mg de cryosections et les mesures mises en commun sont comparés directement à travers des applications.

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Apprenez la collecte de tissus adipeux blancs chez la souris et l'extraction d'ARN de haute qualité. Cette méthode permet d'étudier l'expression génique dans le métabolisme et la biologie moléculaire.

Souris tissus adipeux collecte et le traitement pour l’analyse de l’ARN

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