Souris tissus adipeux collecte et le traitement pour l’analyse de l’ARN

L’objectif global de cette procédure est d’assurer une collecte adéquate d’échantillons de dépôts de tissu adipeux blanc de différentes souris et d’isoler une grande quantité d’ARN de bonne qualité dans le tissu. Cette méthode peut répondre à des questions clés dans les domaines du métabolisme, de la biochimie et de la biologie moléculaire qui, par exemple, concernent l’expression des gènes dans le tissu adipeux de souris traitées ou génétiquement modifiées. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet d’isoler de grandes quantités d’ARN de bonne qualité dans le tissu adipeux qui a généralement une faible teneur en ARN.

La démonstration de la procédure sera assurée par Emilie Pepin, une assistante de recherche de mon laboratoire. Après avoir euthanasié une souris, coupez la peau sur la linea alba selon le protocole de texte, puis faites deux incisions d’environ deux centimètres du milieu de la cage thoracique vers le bras droit et près des organes génitaux au-dessus du membre postérieur droit. Étirez un coin de la peau ouverte et utilisez une aiguille de calibre 22 pour la fixer sur le coussin.

Ensuite, épinglez l’autre coin. À l’aide de ciseaux chirurgicaux positionnés contre la peau aussi plat que possible, effectuez une dissection contondante de la graisse sous-cutanée abdominale, ou SCF, puis transférez-la sur un morceau de papier d’aluminium prédécoupé. Répétez la dissection pour le côté gauche de l’animal.

Ensuite, tirez les coussinets de graisse collectés à gauche et à droite dans la feuille d’aluminium et utilisez de l’azote liquide pour congeler l’échantillon. Pour accéder au tissu adipeux viscéral, coupez le muscle abdominal le long de la linea alba. Ensuite, faites une incision dans les muscles abdominaux des organes génitaux vers l’arrière de la souris des deux côtés.

La graisse autour des organes reproducteurs est la graisse périgonadique, ou PGF. Détachez les coussinets adipeux gauche et droit de l’épididyme, des testicules et du canal déférent et transférez-le sur la feuille d’aluminium pré-étiquetée. Ensuite, congelez l’échantillon dans de l’azote liquide.

En commençant par le côté gauche, exposez les reins en éloignant l’intestin de la cavité abdominale vers le côté droit. Le tissu adipeux que l’on voit ici autour des reins et des glandes surrénales est la graisse périrénale, ou PRF. Isolez et retirez les glandes surrénales avant de collecter le PRF.

Cela peut être fastidieux car ils sont juste un peu plus roses que le tissu adipeux. Maintenant, isolez le PRF de la paroi musculaire arrière et coupez l’uretère, l’artère rénale et la veine qui sépare le PRF et le rein du reste du corps. Ensuite, isolez le PRF du rein en coupant et en retirant la capsule rénale.

Après avoir isolé le PRF droit, transférez l’échantillon dans la feuille d’aluminium avec le tissu du côté gauche et utilisez de l’azote liquide pour congeler les échantillons. Réfrigérez des tubes coniques sans RNase de 1,5 millilitre, un mortier et un pilon et une spatule à l’azote liquide selon le protocole de texte. Mettez l’échantillon de tissu adipeux dans le mortier, puis utilisez quelques couches de papier brun pour retirer le pilon de l’azote liquide et l’insérer dans le mortier.

Tout en tenant le pilon avec le papier, utilisez le marteau pour frapper le haut du pilon une ou deux fois. Ensuite, broyez l’échantillon à l’aide d’un mouvement de rotation jusqu’à l’obtention d’une poudre fine. Ensuite, retirez le pilon, récupérez la spatule de l’azote liquide et utilisez-la pour transférer l’échantillon dans le tube conique pré-refroidi correspondant de 1,5 millilitre.

Retrempez la spatule dans de l’azote liquide de temps en temps pour éviter que l’échantillon ne fonde. De plus, gardez le tube conique sur de la glace sèche pour éviter que l’échantillon ne dégèle. Remplissez le tube conique à environ 2/3 de sa capacité avec un échantillon moulu pour un rendement adéquat en ARN.

Ensuite, préparez les échantillons restants selon le protocole de texte. Sous une cagoule chimique et en portant une blouse de laboratoire, des gants et des lunettes de sécurité, prélevez un échantillon broyé de l’azote liquide. Ouvrez lentement le tube et ajoutez 500 microlitres de solution de phénol.

Fermez le couvercle du tube et faites tourbillonner à vitesse maximale pendant environ cinq secondes, puis ouvrez lentement et soigneusement le tube pour relâcher la pression de l’azote. Le bruit de l’air sortant du tube se fera entendre. Pipetez 500 microlitres supplémentaires de solution phénolique dans le tube.

Ensuite, vortex et ouvrez-le lentement comme précédemment. Agitez l’échantillon jusqu’à ce qu’il soit complètement dissous. Ensuite, ouvrez le tube pour relâcher la pression avant de traiter des échantillons supplémentaires.

Une fois que tous les échantillons ont été traités, agitez-les brièvement à la vitesse maximale et incubez-les à température ambiante pendant cinq minutes. Centrifugez les tubes à 12 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes. Ensuite, ramenez les tubes à température ambiante.

Pour éviter la contamination, pour chaque échantillon, utilisez une pipette P1000 avec une pointe filtrée pour isoler autant d’ARN que possible de la couche rose moyenne en perçant la phase lipidique près du côté du tube. Distribuez l’ARN dans les nouveaux tubes coniques sans toucher les côtés des tubes pour éviter le transfert des lipides présents à l’extérieur de l’embout. Ajoutez 200 microlitres de chloroforme pur à chaque échantillon et mélangez les tubes par inversion pendant 15 secondes.

Ensuite, après avoir incubé les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes, centrifugez les tubes à 12 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 15 minutes et ramenez les tubes à température ambiante. Pour chaque échantillon, utilisez une pipette P1000 et des pointes filtrées pour transférer autant de phase supérieure aqueuse transparente contenant de l’ARN que possible vers le deuxième ensemble de tubes coniques correspondants. Ensuite, ajoutez 500 microlitres d’isopropanol à 100 % à chaque échantillon et mélangez les tubes par inversion pendant 15 secondes.

Ensuite, incubez les échantillons à température ambiante pendant 10 minutes. Centrifugez les tubes à 12 000 fois G et quatre degrés Celsius pendant 10 minutes avant de les ramener à température ambiante. Jetez l’isopropanol en le versant dans chaque tube.

Maintenant, ajoutez un millilitre d’éthanol à 75 % à chaque échantillon et faites brièvement tourner les tubes à la vitesse maximale. Ensuite, centrifugez les échantillons à 7 500 fois G et quatre degrés Celsius pendant cinq minutes. Après avoir essoré les échantillons et les avoir amenés à température ambiante, jetez l’éthanol à 75 % en inversant chaque tube et en les allumant en les tapotant contre du papier brun pour éliminer tout résidu d’éthanol.

Laissez le couvercle ouvert et faites sécher la pastille d’ARN à l’air libre pendant environ 15 à 20 minutes. Après avoir évalué la taille des pastilles d’ARN, ajoutez 10 à 25 microlitres d’eau sans RNase à chaque échantillon. Incuber les échantillons dans un bloc de chaleur à 60 degrés Celsius pendant cinq minutes.

Ensuite, faites brièvement tourbillonner les tubes. Incuber les échantillons dans le même bloc de chaleur pendant cinq minutes supplémentaires. Ensuite, faites tourner rapidement tous les échantillons et placez-les immédiatement sur de la glace.

Effectuer une RT-PCR pour l’expression des gènes dans le tissu adipeux selon le protocole textuel. Comme prévu, les souris suivant un régime riche en graisses avaient un poids corporel et une prise de poids accrus par rapport aux autres souris suivant un régime normal. Ces observations ont été accompagnées d’une augmentation de plus de deux fois du poids du PGF, du PRF et du SCF chez les souris obèses par rapport à celles suivant un régime normal.

Ce tableau montre que pour chaque tissu adipeux blanc, l’isolement de l’ARN par une solution de phénol a produit des échantillons avec une OD260 sur OD280 d’environ 2,0, ce qui est considéré comme pur pour l’ARN. Comme le montre ce graphique à barres, les données PCR en temps réel ont montré que l’expression de l’ARNm de la leptine était significativement plus élevée chez les souris obèses PGF, PRF et SCF par rapport à celles suivant un régime normal. Les différences observées dans l’expression de l’ARNm de la leptine n’étaient pas dues à une variation de s16, le gène de référence utilisé pour normaliser les résultats entre les deux groupes de souris, car les valeurs CT n’ont pas été modifiées.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en quatre heures si elle est exécutée correctement. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler de travailler dans un environnement sans RNase pendant la procédure d’extraction de l’ARN. Suite à cette procédure, d’autres méthodes telles que l’amplification PCR en temps réel peuvent être effectuées afin de répondre à des questions supplémentaires telles que les modifications de l’expression génique.

Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine du métabolisme pour explorer les modulations du tissu adipeux liées à l’obésité et au diabète chez les rongeurs. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon d’isoler différents coussinets adipeux et d’en isoler l’ARN. N’oubliez pas que travailler avec la solution de phénol peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que le port d’une blouse de laboratoire et de gants doivent toujours être prises lors de cette procédure.