Un protocole pour l'élimination des gènes multiples dans les petits organoïdes intestinaux de souris à l'aide d'un concatériste CRISPR

L’objectif global de ce protocole est de cloner plusieurs ARN guides en un seul vecteur concatéreur CRISPR et d’obtenir une électroporation très efficace dans les organoïdes intestinaux de souris, afin d’obtenir l’inactivation simultanée de plusieurs gènes. Cette méthode peut améliorer considérablement l’efficacité des études de perte de fonction en permettant de surmonter l’effet potentiel de la compensation parallèle. Le principal avantage de notre stratégie CRISPR-concatemer est la commodité d’une seule étape de clonage et la possibilité d’effectuer l’inactivation simultanée d’un maximum de quatre gènes différents.

La démonstration de la procédure sera faite par Alessandra Merenda, une étudiante au doctorat de mon laboratoire. Le clonage d’ARN guides ou d’ARNg dans le vecteur concatémère CRISPR commence par une seule réaction pour recuire les brins supérieur et inférieur de chaque oligonucléotide d’ARNg et pour phosphoryler leurs extrémités. Préparez le mélange réactionnel sur de la glace, pour trois concatémères, utilisez trois microlitres d’ARNg du brin supérieur, trois microlitres d’ARNg du brin inférieur, deux microlitres de tampon d’ADN ligase T4, un microlitre de polynucléotide kinase T4 et de l’eau jusqu’à un volume total de 20 microlitres.

Mélangez bien en pipetant et en faisant fonctionner le thermocycleur en utilisant les réglages suivants, 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, descendre à 25 degrés Celsius à 0,3 degré Celsius par minute et maintenir à quatre degrés Celsius. L’étape suivante est la réaction de brassage Bbs1, dans laquelle les oligonucléotides d’ARNg pré-recuits sont incorporés à la position appropriée du vecteur concatère. Diluez le mélange réactionnel de un à 100 dans de l’ADN, de l’eau libre d’ARN pour générer trois et quatre vecteurs concatémères d’ARNg.

Assemblez les réactions de mélange Bbs1 sur de la glace. Utilisez 100 nanogrammes de vecteur CRISPR-concatemer, 10 microlitres de mélange d’oligos, un microlitre de tampon enzymatique de restriction, un microlitre de DTT, un microlitre d’ATP, un microlitre d’enzyme Bbs1, un microlitre de T7 ligase et de l’eau jusqu’à un volume total de 20 microlitres. Bien mélanger par pipetage, inclure un témoin négatif qui contient le vecteur.

Exécutez les réactions dans un thermocycleur, à l’aide des paramètres suivants, pour cloner trois et quatre concatémères d’ARNg, exécutez 50 cycles à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes et 21 degrés Celsius pendant cinq minutes, maintenez à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis maintenez à quatre degrés Celsius indéfiniment. Pour deux concatémères d’ARNg, exécutez les mêmes paramètres avec 25 cycles de la première étape. Lorsque la réaction de brassage Bbs1 est terminée, prenez 11 microlitres de chaque mélange de ligature et ajoutez 1,5 microlitre de tampon d’exonucléase, 1,5 microlitre d’ATP, un microlitre d’exonucléase d’ADN et de l’eau pour un volume total de 15 microlitres.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis à 70 degrés Celsius pendant 30 minutes. Par la suite, le mélange réactionnel est utilisé pour transformer les bactéries E.Coli chimiquement compétentes, selon un protocole standard. Pour confirmer la présence d’inserts d’ARNg dans le vecteur concatémère CRISPR, prélevez les colonies de bactéries avec une boucle d’inoculation et inoculez chacune d’entre elles dans quatre millilitres de milieu LB.

Faites pousser les clones pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un agitateur orbital. Le lendemain, l’ADN est extrait à l’aide d’un kit de mini-préparation de plasmides, selon les instructions du fabricant. Mélangez environ 200 nanogrammes de chaque échantillon d’ADN avec 10 unités d’EcoR1 et cinq unités de BglII dans une réaction de 10 microlitres.

Inclure un mélange réactionnel distinct avec le vecteur d’origine correspondant comme contrôle positif pour la comparaison de taille. Incuber les réactions à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Exécutez les réactions de digestion sur un gel d’agarose à 1 % à 90 volts pendant environ 20 minutes.

Visualisez le gel à l’aide d’un transilluminateur UV pour identifier les clones avec la bonne taille d’insert. Pour confirmer que les ARNg ont été clonés au bon endroit et que, par conséquent, tous les sites de reconnaissance de Bbs1 ont été perdus, digérez les clones sélectionnés avec cinq unités de Bbs1. Incluez un mélange réactionnel séparé, avec le vecteur original correspondant comme témoin.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant trois heures, exécuter les réactions de digestion sur un gel d’agarose à 1 % à 90 volts pendant environ 20 minutes. Visualisez le gel à l’aide d’un transilluminateur UV pour identifier les vecteurs qui ne sont pas coupés par Bbs1. Lors de la division d’organoïdes pour l’électroporation, ensemencez un minimum de six puits d’une plaque de 48 puits par transvection.

Semez les organoïdes dans des gouttes matricielles de socle de 20 microlitres et cultivez-les dans 250 microlitres de WENR plus un milieu nicotinamide par puits à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié. Le deuxième jour, remplacez le milieu WENR plus nicotinamide par 250 microlitres d’EGF plus noggin, un inhibiteur de GSK3 et un milieu inhibiteur de roche sans antibiotiques. Le troisième jour, changez le milieu organoïde en EGF plus noggin, inhibiteur de GSK3, inhibiteur de roche et 1,25 % de diméthylsulfoxyde sans antibiotiques.

Le quatrième jour, perturbez les dômes de la matrice sous-jacente à l’aide d’une pointe de pipette d’un millilitre et transférez les organoïdes dans un tube de 1,5 millilitre. Tirez le contenu de quatre puits d’une plaque de 48 puits dans un tube. Cassez mécaniquement les organoïdes en petits fragments en pipetant de haut en bas avec la pipette P200 environ 200 fois.

Centrifuger à 600 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Après la centrifugation, retirer le milieu de tous les tubes et remettre les palettes en suspension dans un millilitre d’une protéase recombinante de qualité culture cellulaire. Incuber à 37 degrés Celsius pendant un maximum de cinq minutes.

Il est important de surveiller attentivement le traitement par protéase car le succès de l’électroporation dépend de l’obtention d’une suspension cellulaire contenant des amas de cellules au lieu de cellules uniques. Vérifiez une goutte d’échantillon de 50 microlitres sous un microscope à lumière inversée avec un objectif quatre fois. Des grappes de 10 à 15 cellules sont souhaitables car elles augmentent la survie cellulaire après électroporation.

Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres à faible liaison et monopolisez la dissociation en ajoutant neuf millilitres de milieu de base sans antibiotiques. Centrifugez-le à 600 fois G pendant cinq minutes à température ambiante. Jetez le surnageant et suspendez à nouveau la palette dans un millilitre de sérum réduit.

Comptez le nombre de cellules avec une chambre de Burkes, un minimum d’un fois 10 à la cinquième cellule est nécessaire par réaction d’électroporation. Commencez cette procédure en ajoutant neuf millilitres de sérum réduit dans le tube de 15 millilitres contenant la suspension cellulaire et centrifugez à 400 fois G pendant trois minutes à température ambiante. Retirez tout le surnageant et remettez la palette en suspension dans une solution d’électroporation.

Ajoutez une quantité totale de 10 microgrammes d’ADN dans deux nouveaux tubes. Ensuite, ajoutez la solution d’électroporation à un volume final de 100 microlitres et maintenez le mélange d’ADN cellulaire sur de la glace. Transférez le mélange d’ADN cellulaire dans la cuvette d’électroporation, placez la cuvette dans la chambre de l’électroporateur.

Mesurez l’impédance en appuyant sur le bouton approprié de l’électroporateur et assurez-vous qu’elle est de 0,030 à 0,055 ohm. Effectuez l’électroporation selon les paramètres indiqués dans le protocole texte. Ajoutez 400 microlitres de tampon d’électroporation et d’inhibiteur de roche dans la cuvette, puis transférez tout son contenu dans un tube de 1,5 millilitre.

Incuber à température ambiante pendant 30 minutes pour permettre aux cellules de récupérer. Après 30 minutes, tournez à 400 fois G pendant trois minutes à température ambiante. Retirez le surnageant et remettez la palette en suspension dans 20 microlitres par puits de matrice de sous-sol.

Semez environ une fois 10 fois 10 à une fois 10 à cinquième cellules par puits dans une plaque de 48 puits et ajoutez de l’EGF plus de la caboche, un inhibiteur de GSK3, un inhibiteur de roche et un milieu de diméthylsulfoxyde à 1,25 %. Incuber à 37 degrés Celsius. Le lendemain, changer le milieu en EGF plus noggin, inhibiteur de GSK3 et inhibiteur de roche et vérifier l’efficacité de la transvection en observant l’expression de la GFP.

Conservez les organoïdes à 37 degrés Celsius. Deux jours plus tard, remplacez le milieu par un milieu frais. Quatre jours après l’électroporation, changez le milieu pour le WENR plus le nicotinamide et le milieu inhibiteur de roche et continuez à incuber les cellules à 37 degrés Celsius.

La présence du bon nombre d’inserts d’ARNg dans le vecteur concatéreur est confirmée par une digestion à double restriction avec EcoR1 et BglII. La taille attendue de la bande inférieure est d’environ 1,6 kilobase pour un vecteur concatère à quatre ARNg et de 1,2 kilobase pour un vecteur concatère à trois ARNg. De plus, la digestion avec Bbs1 confirme que les ARNg ont été clonés dans la bonne position et, par conséquent, tous les sites de reconnaissance de Bbs1 sont perdus.

Des constructions confirmées sont délivrées aux organoïdes intestinaux de souris par électroporation pour atteindre une efficacité de transvection allant jusqu’à 70 %, comme le montre l’expression de la GFP. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de générer des vecteurs concatémères d’ARNg et de la façon de les livrer efficacement à des cultures d’organoïdes 3D en utilisant l’électroporation, afin de réaliser l’inactivation de plusieurs gènes en même temps.