Un protocole pour l'élimination des gènes multiples dans les petits organoïdes intestinaux de souris à l'aide d'un concatériste CRISPR

L'objectif général de ce protocole est d'insérer plusieurs ARN guide dans un vecteur CRISPR en concatémère et d'obtenir une électroporation hautement efficace dans des organoïdes intestinaux de souris, afin de réaliser une invalidation simultanée de plusieurs gènes. Cette méthode peut considérablement améliorer l'efficacité des études de perte de fonction en permettant de contourner l'effet potentiel de compensation parallèle. Le principal avantage de notre stratégie CRISPR en concatémère réside dans la simplicité d'une étape unique de clonage et dans la possibilité d'effectuer l'invalidation simultanée jusqu'à quatre gènes différents.

La démonstration de la procédure sera effectuée par Alessandra Merenda, étudiante au doctorat de mon laboratoire. Le clonage des ARN guides ou ARNg dans le vecteur CRISPR-concatémerique commence par une réaction unique permettant d'hybrider les brins supérieur et inférieur de chaque oligonucléotide ARNg et de phosphoryler leurs extrémités. Préparez le mélange réactionnel sur de la glace : pour trois concatémères, utilisez trois microlitres des brins supérieurs d'ARNg, trois microlitres des brins inférieurs d'ARNg, deux microlitres de tampon T4 DNA ligase, un microlitre de T4 polynucléotide kinase et de l'eau jusqu'à un volume total de 20 microlitres.

Mélanger soigneusement par pipetage et exécuter le thermocycleur avec les paramètres suivants : 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, 95 degrés Celsius pendant cinq minutes, ramener progressivement à 25 degrés Celsius à raison de 0,3 degré Celsius par minute, puis maintenir à quatre degrés Celsius. L'étape suivante est la réaction de réarrangement par Bbs1, au cours de laquelle les oligonucléotides d'ARNg pré-appariés sont intégrés à la position appropriée du vecteur concatémère. Diluer le mélange réactionnel au 1/100 dans de l'eau exempte de DNA et d'ARN pour générer les vecteurs concatémères d'ARNg trois et quatre.

Préparez les réactions de brassage Bbs1 sur de la glace. Utilisez 100 nanogrammes de vecteur CRISPR-concatémère, 10 microlitres de mélange d'oligonucléotides, un microlitre de tampon pour enzyme de restriction, un microlitre de DTT, un microlitre d'ATP, un microlitre d'enzyme Bbs1, un microlitre de ligase T7 et de l'eau jusqu'à un volume total de 20 microlitres. Mélangez soigneusement par pipetage, et incluez un témoin négatif contenant le vecteur.

Effectuer les réactions dans un thermocycleur en utilisant les paramètres suivants : pour le clonage de concatémères de trois et quatre ARNg, effectuer 50 cycles à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes et à 21 degrés Celsius pendant cinq minutes, maintenir à 37 degrés Celsius pendant 15 minutes, puis maintenir indéfiniment à 4 degrés Celsius. Pour les concatémères de deux ARNg, utiliser les mêmes paramètres avec 25 cycles de la première étape. Une fois la réaction de permutation par Bbs1 terminée, prélever 11 microlitres de chaque mélange de ligature et ajouter 1,5 microlitre de tampon exonucléase, 1,5 microlitre d'ATP, un microlitre d'exonucléase ADN et de l'eau jusqu'à un volume total de 15 microlitres.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant 30 minutes, puis à 70 degrés Celsius pendant 30 minutes. Ensuite, le mélange réactionnel est utilisé pour transformer des bactéries E. coli chimiquement compétentes, selon un protocole standard. Pour confirmer la présence d'inserts d'ARNg dans le vecteur CRISPR-concatémère, prélever des colonies bactériennes à l’aide d’un anneau d’inoculation et les inoculer chacune dans quatre millilitres de milieu LB.

Faire pousser les clones pendant la nuit à 37 degrés Celsius dans un agitateur orbital. Le jour suivant, extraire l'ADN à l'aide d'un kit de minipréparation de plasmide, conformément aux instructions du fabricant. Mélanger environ 200 nanogrammes de chaque échantillon d'ADN avec 10 unités d'EcoR1 et cinq unités de BglII dans une réaction de 10 microlitres.

Inclure un mélange de réaction séparé avec le vecteur d'origine correspondant comme témoin positif pour la comparaison de taille. Incuber les réactions à 37 degrés Celsius pendant trois heures. Faire migrer les réactions de digestion sur un gel d'agarose à 1 % à 90 volts pendant environ 20 minutes.

Visualisez le gel à l’aide d’un transilluminateur UV afin d’identifier les clones présentant la taille correcte d’insert. Pour confirmer que les ARNdg ont été clonés à la position appropriée et que, par conséquent, tous les sites de reconnaissance de Bbs1 ont été perdus, digérez les clones sélectionnés avec cinq unités de Bbs1. Incluez un mélange réactionnel séparé contenant le vecteur d’origine correspondant comme témoin.

Incuber à 37 degrés Celsius pendant trois heures, puis faire migrer les réactions de digestion sur un gel d'agarose à 1 % à 90 volts pendant environ 20 minutes. Visualiser le gel à l'aide d'un transilluminateur UV afin d'identifier les vecteurs qui ne sont pas coupés par Bbs1. Lors de la division des organoïdes pour l'électroporation, ensemencer un minimum de six puits d'une plaque de 48 puits par transvection.

Ensemencer les organoïdes dans des gouttes de matrice basale de 20 microlitres et les cultiver dans 250 microlitres de milieu WENR supplémenté en nicotinamide par puits à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone dans un incubateur humidifié. Au jour deux, remplacer le milieu WENR supplémenté en nicotinamide par 250 microlitres de milieu contenant EGF et noggin, inhibiteur de GSK3 et inhibiteur de rock, sans antibiotiques. Au jour trois, changer le milieu des organoïdes pour un milieu contenant EGF et noggin, inhibiteur de GSK3, inhibiteur de rock et 1,25 % de diméthylsulfoxyde, sans antibiotiques.

Le jour quatre, rompre les dômes de matrice basale à l’aide d’une pipette de 1 millilitre et transférer les organoïdes dans un tube de 1,5 millilitre. Prélever le contenu de quatre puits d’une plaque de 48 puits dans un seul tube. Casser mécaniquement les organoïdes en petits fragments en aspirant et en expulsant environ 200 fois avec la pipette P200.

Centrifuger à 600 × g pendant cinq minutes à température ambiante. Après la centrifugation, éliminer le milieu de tous les tubes et resuspendre les pastilles dans un millilitre d'une protéase recombinante de qualité pour culture cellulaire. Incuber à 37 degrés Celsius pendant un maximum de cinq minutes.

Il est important de surveiller attentivement le traitement par protéase, car la réussite de l'électroporation dépend de l'obtention d'une suspension cellulaire contenant des agrégats de cellules plutôt que des cellules isolées. Examiner une goutte de 50 microlitres d'échantillon au microscope optique inversé avec un objectif 4 fois. Des agrégats de 10 à 15 cellules sont souhaitables, car cela augmente la survie cellulaire après l'électroporation.

Transférez la suspension cellulaire dans un tube de 15 millilitres à faible rétention et arrêtez la dissociation en ajoutant neuf millilitres de milieu basal sans antibiotiques. Centrifugez à 600 ×g pendant cinq minutes à température ambiante. Éliminez le surnageant et resuspendez le culot dans un millilitre de milieu à faible teneur en sérum.

Compter le nombre de cellules à l’aide d’une chambre de Burkes ; un minimum de 1 × 10⁵ cellules est nécessaire par réaction d’électroporation. Commencer cette procédure en ajoutant neuf millilitres de milieu à faible teneur en sérum dans le tube de 15 millilitres contenant la suspension cellulaire, puis centrifuger à 400 × g pendant trois minutes à température ambiante. Éliminer tout le surnageant et resuspendre le culot dans une solution d’électroporation.

Ajoutez une quantité totale de 10 microgrammes d'ADN dans deux nouveaux tubes. Ensuite, ajoutez la solution d'électroporation jusqu'à un volume final de 100 microlitres et maintenez le mélange cellules-ADN sur de la glace. Transférez le mélange cellules-ADN dans la cuvette d'électroporation, puis placez la cuvette dans la chambre de l'électroporateur.

Mesurez l'impédance en appuyant sur le bouton approprié de l'électroporateur et assurez-vous qu'elle se situe entre 0,030 et 0,055 ohm. Effectuez l'électroporation selon les paramètres indiqués dans le protocole écrit. Ajoutez 400 microlitres de tampon d'électroporation contenant l'inhibiteur rock dans la cuvette, puis transférez la totalité du contenu dans un tube de 1,5 millilitre.

Incuber à température ambiante pendant 30 minutes pour permettre aux cellules de se rétablir. Après 30 minutes, centrifuger à 400 × g pendant trois minutes à température ambiante. Éliminer le surnageant et re-suspendre le culot dans 20 microlitres par puits de matrice basale.

Ensemencez environ une fois 10 à la puissance quatre à une fois 10 à la puissance cinq cellules par puits dans une plaque de 48 puits et ajoutez du milieu contenant EGF plus noggin, un inhibiteur de GSK3, un inhibiteur de rock et 1,25 % de diméthylsulfoxyde. Incubez à 37 degrés Celsius. Le jour suivant, remplacez le milieu par du milieu contenant EGF plus noggin, un inhibiteur de GSK3 et un inhibiteur de rock, puis vérifiez l'efficacité de la transfection en observant l'expression de la GFP.

Conserver les organoïdes à 37 degrés Celsius. Deux jours plus tard, remplacer le milieu par du milieu frais. Quatre jours après l'électroporation, changer le milieu pour du milieu WENR contenant de la nicotinamide et un inhibiteur de ROCK, puis continuer à incuber les cellules à 37 degrés Celsius.

La présence du nombre correct d'inserts d'ARNg dans le vecteur concatémère est confirmée par une double digestion de restriction avec EcoR1 et BglII. La taille attendue de la bande inférieure est d'environ 1,6 kilobase pour un vecteur concatémère de quatre ARNg et de 1,2 kilobase pour un vecteur concatémère de trois ARNg. De plus, la digestion avec Bbs1 confirme que les ARNg ont été clonés à la position correcte et, par conséquent, tous les sites de reconnaissance de Bbs1 sont perdus.

Les constructions confirmées sont délivrées à des organoïdes intestinaux murins par électroporation, permettant d'atteindre une efficacité de transvection allant jusqu'à 70 %, comme le montre l'expression de la GFP. Après avoir visionné cette vidéo, vous devriez bien comprendre comment générer des vecteurs concatémériques d'ARNg et comment les délivrer efficacement à des cultures d'organoïdes en 3D par électroporation, afin d'obtenir une extinction simultanée de plusieurs gènes.