Name: Une procédure complète d’évaluer la Performance In Vitro de la néovascularisation Hémangioblastome putatif à l’aide de l’ellipsoïde test de germination (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-04-12T14:15:00.000+00:00
Duration: 8 min 26 s
Description: Découvrez l'évaluation de la néovascularisation des hémangioblastomes par le test de germination d'ellipsoïdes in vitro. Cette méthode révèle le rôle de l'angiogenèse tumorale classique comme mécanisme complémentaire.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

Ce travail a été soutenu par des subventions de la Commission des sciences de Shanghai et de la technologie (15411951800, 15410723200). Les auteurs tiennent à remercier Prof. YuMei Wen et Prof. Chao Zhao de l’Université de département de microorganisme pathogène de Fudan pour leur assistance technique.

Cette méthode a été réalisée conformément aux lignes directrices approuvées et réglementation de la recherche éthique Comité de l’hôpital Huashan, Université Fudan. Les mesures de sécurité standard correspondantes ont été suivis à chaque étape. Pour une présentation schématique, veuillez vous reporter à la Figure 1.
1. cellules de Culture et la construction plasmidique
<ol><li>Maintenir régulièrement les cellules endothéliales de veine ombilicale humaine (HUVEC) dans Dulbecco de l’aigle modifié (DMEM) additionné de 10 % sérum fœtal (SVF), 100 unités/mL de pénicilline et 100 µg/mL de streptomycine dans un humidifié 5 % CO2 incubateur à 37 ° C.</li>
	<li>PLKO.1 Digest plasmide avec ApaI et EcoRI pour la synthèse de shARN fragment. Assurez-vous que la séquence du vecteur de shARN VHL est CCGGGATCTGGAAGACCACCCAAATCTCGAGA TTTGGGTGGTCTTCCAGATCTTTTTG14.</li>
	<li>Ensuite, mélanger 20 système µΜ avant 5 µl d’oligo, 5 µL d’oligo reverse, 5 µL de NEB mémoire tampon 10 x et 35 µL de ddH2O ensemble (le volume total est de 50 µL). Chauffer le mélange à 98 ° C pendant 4 min, lentement et laissez refroidir à la température de la pièce en quelques heures.</li>
	<li>Ligaturer les oligos recuit et le plasmide PLKO.1 ainsi que de la ligase T4 à 4 ° C pour la nuit. 16 h plus tard, ajouter 5 µL du mélange de ligation dans 25 µL DH5α les cellules compétentes. Ensuite, les plasmides ligaturés avec succès de l’écran et vérifiez le fragment inséré par séquençage.</li>
</ol>2. infection et paquet de lentivirus
<ol><li>Au total, mélanger 10 µg du vecteur PLKO.1-shVHL ou PLKO.1-shScramble, 7,5 µg d’emballage plasmide psPAX2 et 2,5 µg d’enveloppe plasmide pMD2.G dans 500 µL des médias DMEM sans sérum fœtal (SVF) pendant 25 min.</li>
	<li>Ajouter 7 mLDMEM sans FBS à la solution préparée précédemment.</li>
	<li>Culture de 293 cellules FT le DMEM sans FBS dans un plats de culture de tissus de 10 cm de diamètre. S’assurer que le nombre de cellules 293FT 1 x 107 à l’aide d’un compteur de cellules.</li>
	<li>Ajouter 1 mL de la solution préparée ci-dessus au milieu des cellules 293FT pour la transfection. Remarque : La lignée de cellules 293FT est dérivé de la lignée cellulaire 293F et stablement expriment l’antigène T grand SV40. Par conséquent, il est un hôte convenable pour la production des gènes.</li>
	<li>Remplacer le milieu de culture avec le DMEM contenant 10 % FBS après 6 h.</li>
	<li>Recueillir les médias à l’aide d’une pipette à 48 h après la transfection. Remarque : Le virus existe dans le DMEM contenant 10 % FBS. Les cellules mortes flottent sur le milieu. Membrane stérile de 0,45 µm permet de filtrer les cellules mortes et les impuretés. En règle générale, il n’y a pas besoin de vérifier la multiplicité d’infection (MOI). Il s’agit d’établir une ligne de cellules stables. Lors de la dernière étape, toutes les cellules vivantes sans infection réussie vont mourir par la puromycine. Le groupe shScramble et cellules HUVEC constituent le groupe de contrôle. Veiller à ce que toutes les cellules HUVEC mourir avec la concentration de puromycine utilisé après 72 h. Chaque cupule a le même nombre de cellules.</li>
	<li>La culture des cellules HUVEC dans les médias des gènes pendant 72 h. Puis, ajoutez la puromycine aux médias des cellules HUVEC à une concentration de 2 µg/mL pour les cellules HUVEC utilisation 24 h sans aucun traitement dans le groupe témoin. Veiller à ce que tous les commande cellules meurent à ce moment-là. Remarque : Les cellules vivantes représentent une lignée cellulaire stable VHL cellules démontable et shSramble. La densité de placage est 5 000/puits dans les plaques à 96 puits.</li>
</ol>3. génération des sphéroïdes de cellules endothéliales
<ol><li>Trypsinize les cellules HUVEC et remettre en suspension dans le milieu DMEM avec 10 % FBS. Avec un nombre modéré de cellules dans une boîte de Petri de 10 cm, ajouter 1 mL d’EDTA-typsin.</li>
	<li>Les cellules dans une plaque à 96 puits fond rond 3D, à une densité cellulaire de 1 × 103 cellules/puits de graines. Utiliser un puits pouvant accueillir un sphéroïde de 0,50 µL à suspendre l’ellipsoïde. Compter les cellules à l’aide d’un système de compteur de cellules suivant les instructions du fabricant.</li>
	<li>Incuber les cellules à 37 ° C et 5 % de CO2 en continu pendant 72 h. Dans ces conditions, faire en sorte que les cellules en suspension forment les sphéroïdes cellule automatiquement. Remplacer la moitié du milieu de culture après 36 h.</li>
</ol>4. test in vitro de l’angiogenèse
<ol><li>Décongeler la solution de gel à 4 ° C et le diluer avec le milieu de sérum réduit à un taux de dilution de 1:5.</li>
	<li>Sucer les sphéroïdes DMEM milieu de culture avec une micropipette. Après avoir lavé les sphéroïdes avec 5 mL de milieu sérum réduit, suspendre les sphéroïdes doucement et prudemment dans le gel dilué. S’assurer qu’il n’y a pas de bulles d’air.</li>
	<li>Incorporez 300 µL de liquide mélangé dans un plat de 15 puits. Après incubation à 37 ° C et 5 % de CO2 pendant 1 h, ajouter 400 µL de milieu sérum réduit dans chaque puits. Remplir d’eau stérile autour des puits pour générer un environnement humidifié pour empêcher l’évaporation.</li>
	<li>Par la suite, la culture la plaque à 37 ° C à 5 % de CO2 à 100 % d’humidité pendant 1 h.</li>
	<li>Aspirer le vieux support avec précaution et remplacez-le par 600 µL de milieu de sérum réduit avec des suppléments de croissance des cellules endothéliales de le 1 % dans chaque puits.</li>
	<li>Après 12 h ou 24h, prendre des photos sous un microscope inversé de lumière (40 *).</li>
</ol>5. analyse
<ol><li>Télécharger les images sur une plateforme d’analyse en ligne d’image pour obtenir des données de longueur sprout (Table des matières).</li>
	<li>Sur la page Web, créez un compte par email.</li>
	<li>Puis télécharger les images en cliquant sur le bouton transférer.</li>
	<li>Télécharger le résultat en cliquant sur le bouton Télécharger. Remarque : Le logiciel va générer l’image traitée et les données. Les données contiennent cinq parties : cumulatif germination, pousse moyenne longueur, l’écart de la longueur de la pousse, pousse et sphéroïde. Dans l’image traitée, chaque paramètre est décrit dans une couleur différente pour faciliter l’identification de l’image traitée : rouge représente les choux de squelette, jaune le nombre de germes, bleu la structure sprout, sprout blanc fin et orange sphéroïde.</li>
</ol>

<ol><li>Lonser, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.sciencedirect.com/science/article/pii/S0140673603136434">von Hippel-Lindau disease.</a> Lancet. 361 (9374), 2059-2067 (2003).</li>
<li>Hussein, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Central+nervous+system+capillary+haemangioblastoma%3A+the+pathologist%27s+viewpoint%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Exp+Pathol%22%5BJournal%5D)">Central nervous system capillary haemangioblastoma: the pathologist's viewpoint.</a> Int J Exp Pathol. 88 (5), 311-324 (2007).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastomas+might+derive+from+neoplastic+transformation+of+neural+stem+cells%2Fprogenitors+in+the+specific+niche%5BTitle%5D)+AND+%22Carcinogenesis%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastomas might derive from neoplastic transformation of neural stem cells/progenitors in the specific niche.</a> Carcinogenesis. 32 (1), 102-109 (2011).</li>
<li>Zhuang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+derived+vasculogenesis+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+tumors%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Tumor derived vasculogenesis in von Hippel-Lindau disease-associated tumors.</a> Sci Rep. 4, 4102(2014).</li>
<li>Glasker, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((VHL-deficient+vasculogenesis+in+hemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Mol+Pathol%22%5BJournal%5D)">VHL-deficient vasculogenesis in hemangioblastoma.</a> Exp Mol Pathol. 96 (2), 162-167 (2014).</li>
<li>Wizigmann-Voos, S., Breier, G., Risau, W., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Up-regulation+of+vascular+endothelial+growth+factor+and+its+receptors+in+von+Hippel-Lindau+disease-associated+and+sporadic+hemangioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Up-regulation of vascular endothelial growth factor and its receptors in von Hippel-Lindau disease-associated and sporadic hemangioblastomas.</a> Cancer Res. 55 (6), 1358-1364 (1995).</li>
<li>Cancilla, P. A., Zimmerman, H. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fine+structure+of+a+cerebellar+hemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">The fine structure of a cerebellar hemangioblastoma.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 24 (4), 621-628 (1965).</li>
<li>Kawamura, J., Garcia, J. H., Kamijyo, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cerebellar+hemangioblastoma%3A+histogenesis+of+stroma+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer%22%5BJournal%5D)">Cerebellar hemangioblastoma: histogenesis of stroma cells.</a> Cancer. 31 (6), 1528-1540 (1973).</li>
<li>Jurco, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hemangioblastomas%3A+histogenesis+of+the+stromal+cell+studied+by+immunocytochemistry%5BTitle%5D)+AND+%22Hum+Pathol%22%5BJournal%5D)">Hemangioblastomas: histogenesis of the stromal cell studied by immunocytochemistry.</a> Hum Pathol. 13 (1), 13-18 (1982).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+tumorigenic+cells+and+implication+of+their+aberrant+differentiation+in+human+hemangioblastomas%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Biol+Ther%22%5BJournal%5D)">Identification of tumorigenic cells and implication of their aberrant differentiation in human hemangioblastomas.</a> Cancer Biol Ther. 12 (8), 727-736 (2011).</li>
<li>Ma, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CD41+and+CD45+expression+marks+the+angioformative+initiation+of+neovascularisation+in+human+haemangioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Tumour+Biol%22%5BJournal%5D)">CD41 and CD45 expression marks the angioformative initiation of neovascularisation in human haemangioblastoma.</a> Tumour Biol. 37 (3), 3765-3774 (2016).</li>
<li>Sharifpanah, F., Sauer, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stem+Cell+Spheroid-Based+Sprout+Assay+in+Three-Dimensional+Fibrin+Scaffold%3A+A+Novel+In+Vitro+Model+for+the+Study+of+Angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Stem Cell Spheroid-Based Sprout Assay in Three-Dimensional Fibrin Scaffold: A Novel In Vitro Model for the Study of Angiogenesis.</a> Methods Mol Biol. 1430, 179-189 (2016).</li>
<li>Cai, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+non-coding+RNA+taurine+upregulated+1+enhances+tumor-induced+angiogenesis+through+inhibiting+microRNA-299+in+human+glioblastoma%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">Long non-coding RNA taurine upregulated 1 enhances tumor-induced angiogenesis through inhibiting microRNA-299 in human glioblastoma.</a> Oncogene. 36 (3), 318-331 (2017).</li>
<li>Xu, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Construction+of+Conveniently+Screening+pLKO.1-TRC+Vector+Tagged+with+TurboGFP%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Biochem+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Construction of Conveniently Screening pLKO.1-TRC Vector Tagged with TurboGFP.</a> Appl Biochem Biotechnol. 181 (2), 699-709 (2017).</li>
<li>Laib, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spheroid-based+human+endothelial+cell+microvessel+formation+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Spheroid-based human endothelial cell microvessel formation in vivo.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1202-1215 (2009).</li>
<li>D'Alessio, A., Moccia, F., Li, J. H., Micera, A., Kyriakides, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Angiogenesis+and+Vasculogenesis+in+Health+and+Disease%5BTitle%5D)+AND+%22Biomed+Res+Int%22%5BJournal%5D)">Angiogenesis and Vasculogenesis in Health and Disease.</a> Biomed Res Int. 2015, 126582(2015).</li>
<li>Finkenzeller, G., Graner, S., Kirkpatrick, C. J., Fuchs, S., Stark, G. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impaired+in+vivo+vasculogenic+potential+of+endothelial+progenitor+cells+in+comparison+to+human+umbilical+vein+endothelial+cells+in+a+spheroid-based+implantation+model%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Prolif%22%5BJournal%5D)">Impaired in vivo vasculogenic potential of endothelial progenitor cells in comparison to human umbilical vein endothelial cells in a spheroid-based implantation model.</a> Cell Prolif. 42 (4), 498-505 (2009).</li>
<li>Morin, K. T., Tranquillo, R. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vitro+models+of+angiogenesis+and+vasculogenesis+in+fibrin+gel%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">In vitro models of angiogenesis and vasculogenesis in fibrin gel.</a> Exp Cell Res. 319 (16), 2409-2417 (2013).</li>
<li>Blacher, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cell+invasion+in+the+spheroid+sprouting+assay%3A+a+spatial+organisation+analysis+adaptable+to+cell+behaviour%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cell invasion in the spheroid sprouting assay: a spatial organisation analysis adaptable to cell behaviour.</a> PLoS One. 9 (5), 97019(2014).</li>
<li>Straume, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+heat+shock+protein+27+induces+long-term+dormancy+in+human+breast+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Suppression of heat shock protein 27 induces long-term dormancy in human breast cancer.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (22), 8699-8704 (2012).</li>
<li>Naumov, G. N., Akslen, L. A., Folkman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Role+of+angiogenesis+in+human+tumor+dormancy%3A+animal+models+of+the+angiogenic+switch%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Cycle%22%5BJournal%5D)">Role of angiogenesis in human tumor dormancy: animal models of the angiogenic switch.</a> Cell Cycle. 5 (16), 1779-1787 (2006).</li>
<li>Naumov, G. N., Folkman, J., Straume, O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Tumor+dormancy+due+to+failure+of+angiogenesis%3A+role+of+the+microenvironment%5BTitle%5D)+AND+%22Clin+Exp+Metastasis%22%5BJournal%5D)">Tumor dormancy due to failure of angiogenesis: role of the microenvironment.</a> Clin Exp Metastasis. 26 (1), 51-60 (2009).</li>
<li>Wang, Y., Yang, J., Du, G., Ma, D., Zhou, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Neuroprotective+effects+respond+to+cerebral+ischemia+without+susceptibility+to+HB-tumorigenesis+in+VHL+heterozygous+knockout+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Carcinog%22%5BJournal%5D)">Neuroprotective effects respond to cerebral ischemia without susceptibility to HB-tumorigenesis in VHL heterozygous knockout mice.</a> Mol Carcinog. 56 (10), 2342-2351 (2017).</li>
<li>Stratmann, R., Krieg, M., Haas, R., Plate, K. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Putative+control+of+angiogenesis+in+hemangioblastomas+by+the+von+Hippel-Lindau+tumor+suppressor+gene%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neuropathol+Exp+Neurol%22%5BJournal%5D)">Putative control of angiogenesis in hemangioblastomas by the von Hippel-Lindau tumor suppressor gene.</a> J Neuropathol Exp Neurol. 56 (11), 1242-1252 (1997).</li>
<li>Correa de Sampaio, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+heterogeneous+in+vitro+three+dimensional+model+of+tumour-stroma+interactions+regulating+sprouting+angiogenesis%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A heterogeneous in vitro three dimensional model of tumour-stroma interactions regulating sprouting angiogenesis.</a> PLoS One. 7 (2), 30753(2012).</li>
</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Récemment, plusieurs champs de recherche en biologie vasculaire ont été stimulées par l’étude de l' endothélium d’angiogénique15. Dans cet article, nous avons développé un sphéroïde endothélial germination technique comme modèle expérimental pour étudier la formation de vaisseaux qui provient de la perte du gène VHL de fonction dans les cellules endothéliales manipulés pour identifier les molécules de nouveaux candidats de la cascade d’angiogénique. Au meilleur de notre connaissance, c’est le prem...

Hémangioblastomes (HBs) sont des tumeurs vasculaires bénignes que l'on trouve exclusivement dans le système nerveux central (CNS) humain. Ils se développent dans les patients avec la maladie de von Hippel-Lindau (VHL) ou lésions sporadiques. VHL-HBs sont difficiles à guérir grâce à un traitement chirurgical en raison de la récurrence fréquente et lésions multiples qui résultent de cette génétique trouble1. L’inactivation de la gène suppresseur de tumeur VHL a été considéré comme la cause première de la tumorigenèse de VHL-HBs, l’origine cytologique (y compris la néovascularisation) et le processus évolutif d’HBs restent largement controversée2. Par conséquent, une meilleure compréhension des mécanismes biologiques HB-néovasculaire peut fournir des indications utiles sur les stratégies anti-vasculaires les plus prometteuses pour VHL-HBs.
Une recherche récente a suggéré que HB-néovascularisation est semblable à la vasculogénèse embryologique3,4,5. Facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF) classique-médiation angiogenèse issus de l’endothélium vasculaire et qui est entraînée par la perte de fonction VHL a entraîné la prolifération et néovasculaire formation, qui a été mis au défi6. En 1965, Cancilla et Zimmerman constaté, au microscope électronique, HBs provenant de l' endothélium7. Plus tard, il a été constaté que les cellules du stroma sont issues de vasoformative élément8. En 1982, Jurco et coll. ont découvert que les cellules du stroma sont d’origine endothéliale9. Donc, nous avons émis l’hypothèse que les cellules endothéliales vasculaires humaines sont les cellules d’origine de la néovascularisation-HB10. Bien qu’il soit préférable d’utiliser les cultures primaires de HB cellules dérivées des chirurgies patients VHL, nos recherches antérieures ont indiqué que les cultures primaires de HB ne sont pas stables, et des lignées cellulaires n’a pas peuvent être établie3. En outre, les cultures primaires dans l’environnement 3D ne pouvaient pas identifier l’origine cytologique de HB-la néovascularisation parce qu’elles incluent les progéniteurs des HB-vasculaire ingrédients10,11. Par conséquent, dans un modèle classique et primitif des cellules endothéliales, les cellules endothéliales vasculaires humaines (HUVEC) pourraient servir d’un autre modèle cellulaire pour HBs.
Le test de germination sphéroïde est un nouveau modèle en tissu technique12,13. Dans cet article, une 3D à base de collagène coculture système in vitro à l’aide de l’ellipsoïde test de germination a été développé, avec un objectif général est d’évaluer si l’angiogenèse tumorale classique existe en HBs, ainsi que son rôle dans HBs.

<table><tbody><tr><td>cellule endothéliale de la veine ombilicale humaine</td><td>Fudan IBS Cell Center</td><td>FDCC-HXN180</td><td></td></tr><tr><td>dulbecco' s aigle modifié' s medium&nbsp ;</td><td>Gibco</td><td>11995040</td><td></td></tr><tr><td>sérum fœtal bovin</td><td>Gibco</td><td>&nbsp ; </td><td></td>26400044</tr><tr><td>PLKO.1-puro vecteur</td><td>Addgene</td><td>#8453</td><td></td></tr><tr><td>plasmide d’emballage psPAX2&nbsp ;</td><td>Addgene</td><td>#12260</td><td></td></tr><tr><td>enveloppe plasmide pMD2.G</td><td>Addgene</td><td>#12259</td><td></td></tr><tr><td>3D à fond rond 96 puits</td><td>plaques S-Bio</td><td>MS-9096M</td><td></td></tr><tr><td>matrigel</td><td>BD Biosciences</td><td>354234</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM medium</td><td>Gibco</td><td>31985-070</td><td>sérum réduit medium&nbsp ;</td></tr><tr><td>Plaque à 15 puits</td><td>Ibidi</td><td>81501</td><td>Les bulles d’air dans le gel peuvent être réduites en équilibrant le &mu ; &ndash ; Glisser l’angiogenèse avant l’utilisation à l’intérieur de l’incubateur pendant la nuit</td></tr><tr><td>suppléments de croissance des cellules endothéliales</td><td>Sciencell</td><td>#1052</td><td></td></tr><tr><td>Boîte de culture de 10 cm</td><td>Corning</td><td>Scipu000813</td><td></td></tr><tr><td>Puromycin</td><td>Gibco</td><td>A1113802</td><td></td></tr><tr><td>typsin-EDTA</td><td>Gibco</td><td>25200056</td><td></td></tr><tr><td>Système de comptage cellulaire automatisé &nbsp ;</td>Logiciel d’analyse d’images <td>BioTech</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp ;</td><td>Winmasis</td><td></td><td>http ://mywim.wimasis.com&nbsp ;</td></tr></tbody></table>

une procédure complète d’évaluer la performance in vitro de la néovascularisation hémangioblastome putatif à l’aide de l’ellipsoïde test de germination

A Comprehensive Procedure to Evaluate the In Vitro Performance of the Putative Hemangioblastoma Neovascularization Using the Spheroid Sprouting Assay

L’inactivation du gène suppresseur tumeur von Hippel-Lindau (VHL) joue un rôle crucial dans le développement des hémangioblastomes (HBs) dans le système nerveux central (CNS) humain. Toutefois, tant l’origine cytologique et le processus évolutif d’HBs (y compris la néovascularisation) demeurent controversées, et anti-angiogènes pour VHL-HBs, basés sur le classique HB angiogenèse, donnent des résultats décevants dans les essais cliniques. Un obstacle majeur à la traduction clinique réussie du traitement anti-vasculaire est l’absence d’une compréhension approfondie de la néovascularisation dans cette tumeur vasculaire. Dans cet article, nous présentons une procédure complète pour évaluer in vitro si angiogenèse tumorale classique existe en HBs, ainsi que son rôle dans HBs. Avec cette procédure, les chercheurs peuvent précisément comprendre la complexité de la néovascularisation HB et identifier la fonction de cette forme courante de l’angiogenèse dans HBs. Ces protocoles peuvent être utilisés pour évaluer la thérapie anti-vasculaire plus prometteur pour les tumeurs, qui a fort potentiel translationnel pour traitement de tumeurs, ou pour aider dans l’optimisation du traitement anti-angiogénique de HBs à l’avenir les traductions. Les résultats soulignent la complexité de la néovascularisation HB et suggèrent que cette angiogenèse forme commune est uniquement un mécanisme complémentaire dans la néovascularisation HB.

Images originales sont prises par microscopie inversée. Les images typiques du groupe témoin et du groupe VHL sont indiquées à la Figure 2-A1 et Figure 2-A2. La durée de germination du groupe témoin est plus courte que celle du groupe VHL.
Après avoir téléchargé les Images, la plateforme en ligne fournit des résultats d’analyse directem...

Cet article présente une procédure complète pour évaluer in vitro si angiogenèse tumorale classique existe dans les hémangioblastomes (HBs) et son rôle dans HBs. Les résultats soulignent la complexité de la néovascularisation-HB et suggèrent que cette forme courante d’angiogenèse est seulement un mécanisme complémentaire dans la néovascularisation-HB.

Une procédure complète d’évaluer la Performance In Vitro de la néovascularisation Hémangioblastome putatif à l’aide de l’ellipsoïde test de germination

The inactivation of the von Hippel-Lindau (VHL) tumor suppressor gene plays a crucial role in the development of hemangioblastomas (HBs) within the human ...

L’objectif global de cette expérience est d’évaluer la performance de la néovascularisation présumée de l’hémangioblastome à l’aide du test de germination de sphéroïdes in vitro. La méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de l’angiogénie, telles que l’angiogenèse tumorale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est le produit d’une procédure complète pour évaluer in vitro où l’angiogenèse tumorale classique existe dans l’hémangioblastome et elle se développe dans l’hémangioblastome.L’implication de cette technique s’étend au traitement de l’hémangioblastum et du système vasculaire, car le résultat met en évidence la complexité de l’hémangioblastumor néovascularisation, ce qui suggère que cette forme courante d’angiogenèse n’est qu’un mécanisme complémentaire. Cette méthode peut donc donner un aperçu de l’étude de l’hémangioblastum ou de la néovascularisation. Il peut également être appliqué aux tumeurs, à l’angiogenèse et à la vasculogenèse dans certaines tumeurs solides, telles que le mimétisme vasculogénique tumoral dans la tumeur de verre.La démonstration réelle de cette méthode est essentielle car la génération de ces étapes sphéroïdes de cellules endothéliales manipulées est difficile à apprendre. Parce que les conditions appropriées sont importantes. Tout d’abord, cultivez les cellules endothéliales HUVEC dans un milieu de culture DMEM complété par dix pour cent de sérum fœtal bovin, de la pénicilline et de la streptomycine.Ensuite, maintenez la culture dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone. Ensuite, pour synthétiser le fragment de shRNA, digérez le plasmide avec les enzymes de restriction ApaI et EcoRI. Ensuite, dans le plasmide digéré, ajoutez les oligos avant et arrière, 10 tampons NEB et de l’eau distillée deux fois jusqu’à un volume final de 50 microlitres.Après avoir ajouté tous les réactifs, chauffez le mélange à 98 degrés Celsius pendant quatre minutes. Ensuite, refroidissez progressivement à température ambiante en l’espace de quelques heures. Utilisez la ligase T4 pour ligaturer les oligos recuits et le plasmide.Incuber le tube à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, ajoutez cinq microlitres de mélange de ligature à 25 microlitres de cellules compétentes DH5alpha. Dans 500 microlitres de milieu DMEM, ajoutez le vecteur lentiviral ou le vecteur brouillé, ainsi que d’autres plasmides d’emballage.Ensuite, incubez le mélange lentiviral pendant 25 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, ajoutez 7 millilitres de milieu DMEM à la solution brouillée ou mélangée lentivirale. Cultivez les cellules de 293FT dans un milieu DMEM sans sérum de veau fœtal dans une boîte de culture de 10 centimètres.Ajoutez un millilitre de solution lentivirale ou brouillée aux cellules de 293FT dans la boîte de culture. Après six heures, aspirez l’ancien milieu de la boîte de culture. Ensuite, remplacez l’ancien milieu par un milieu DMEM frais contenant 10 pour cent de sérum de bovin fœtal.Après 48 heures, récupérez le support. Transférez les cellules endothéliales HUVEC dans le milieu lentiviral et maintenez-les pendant 72 heures. Ensuite, ajoutez deux microgrammes par millilitre de puromycine dans le milieu de culture cellulaire HUVEC.Enfin, incubez la culture pendant encore 24 heures. Le lendemain, ajoutez un millilitre de trypsine EDTA pour trypsiniser les cellules HUVEC. Ensuite, mettez à nouveau en suspension la suspension de cellules trypsinisées dans un milieu DMEM avec 10 pour cent de sérum de veau fœtal.Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules. Après avoir compté, ensemencez les cellules dans une plaque à fond rond 3D de 96 puits. Après l’ensemencement, incubez les cellules à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 72 heures en continu.Après 36 heures, remplacez la moitié du milieu de culture par un milieu frais. Tout d’abord, décongelez la solution de gel à quatre degrés Celsius, puis diluez-la dans un rapport de un à cinq avec le milieu sérique réduit. Aspirez les sphéroïdes du milieu DMEM à l’aide d’une micropipette.Ensuite, lavez les sphéroïdes avec cinq millilitres de sérum réduit. Transférez soigneusement les sphéroïdes en suspension et le gel dilué. Dans une plaque à 15 puits, incorporer 300 microlitières du liquide mélangé de sphéroïdes et de gel dilué.Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Ensuite, ajoutez 400 microlitres de sérum réduit dans un seul puits. Pour éviter l’évaporation, remplissez les environs du puits avec de l’eau stérile.Ensuite, cultivez les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et 100 % d’humidité pendant une heure. Après l’incubation, aspirez l’ancien milieu et ajoutez 600 microlitres de milieu sérique réduit avec un supplément de croissance des cellules endothéliales à un pour cent dans le puits et incubez pendant une journée. Capturez des images à l’aide d’un microscope à lumière inversée.Ici, la germination sphéroïde des cellules est capturée à l’aide d’un microscope à lumière inversée pour étudier l’effet du silençage du gène VHL sur le potentiel angiogénique des cellules endothéliales. On observe la germination d’un sphéroïde 12 heures après le traitement lentiviral dans les cellules endothéliales témoins et VHL réduites au silence. Ensuite, une analyse statistique est effectuée pour quantifier la longueur des germes générés par les sphéroïdes silencieux du gène VHL.La longueur moyenne de la germination semble être d’environ 125 micromètres dans les groupes silencieux VHL alors qu’elle n’est que d’environ 65 micromètres dans le groupe témoin. La longueur moyenne cumulée de germination du groupe silencieux VHL est d’environ 1250 micromètres, tandis que celle du groupe témoin est de 680 micromètres. Ces résultats indiquent une augmentation de deux fois de la longueur de la germination dans les groupes silencieux VHL.Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 48 heures si elle est correctement exécutée. En suivant cette procédure et cette méthode, un test de formation capillaire peut être effectué afin de répondre à des questions supplémentaires. Comme l’exploration de la capacité angiogénique des cellules endothéliales vasculaires.Après ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’angiogenèse pour explorer la vasculorisation interne de la tumeur. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des gènes qui perdent une fonction dans les cellules endothéliales manipulées utilisées pour le test d’explosion.

a-comprehensive-procedure-to-evaluate-vitro-performance-putative

Research

Recherche

JoVE Journal

Cancer Research

Recherche sur le cancer

L’invasion des tissus normaux environnants est une caractéristique déterminante des tumeurs malignes. Nous fournissons ici un test simple et semi-automatisé sur microplaque d’invasion dans une biomatrice 3D naturelle qui a été illustré par un certain nombre de modèles de cancers humains avancés.

Tridimensionnelle (3D) Tumor Spheroid Invasion Assay

Le protocole décrit comment un réseau vasculaire irrigables dans un sphéroïde de l’ingénieur. Microenvironnement environnants de l’ellipsoïde est conçu pour induire l’angiogenèse et connecter l’ellipsoïde aux microcanaux dans un dispositif microfluidique. La méthode permet la perfusion de l’ellipsoïde, qui est une technique attendue dans les cultures en trois dimensions.

Irrigables réseau vasculaire avec un modèle de tissu dans un dispositif microfluidique

Cette présente protocole une perle roman in vitro d’analyse que plus modèles convenablement le processus d' in vivo la germination de l’angiogenèse en incorporant des péricytes. Cette modification permet le dosage de la perle à récapituler plus fidèlement les interactions cellulaires hétérotypiques entre cellules endothéliales et murales qui sont essentiels pour l’angiogenèse.

Incorporer les péricytes dans une perle de cellules endothéliales test de germination

Cette méthode décrit la culture des cellules endothéliales dérivées de l'iPSC comme 40 microvaisseaux 3D perfusés dans une plate-forme microfluidique normalisée. Cette plate-forme permet l'étude de la germination angiogénique à gradient en 3D, y compris l'anastomose et la stabilisation des germes angiogéniques d'une manière évolutive et à haut débit.

Test standardisé et évolutif pour étudier perfused 3D Angiogenic Sprouting of iPSC-derived Endothelial Cells In Vitro

Le système d'analyse sphéroïque de co-culture tridimensionnaux est conçu pour imiter l'angiogenèse physiologique. Les sphéroïdes de co-culture sont formés par deux précurseurs de cellules vasculaires humaines, Les ECFC et les MSC, et incorporés dans le gel de collagène. Le nouveau système est efficace pour évaluer les modulateurs angiogéniques, et fournit des informations plus pertinentes à l'étude in vivo.

Système d'analyse d'angiogenèse tridimensionnel utilisant des sphéroïdes de co-culture formés par des cellules de formation de colonies endothéliales et des cellules souches mésenchymales

Ce protocole présente l’essai choroïde de germination, un modèle ex vivo de prolifération microvasculaire. Cet essai peut être utilisé pour évaluer les voies impliquées dans la prolifération des micro-vaisseaux choroïdiens et évaluer les traitements médicamenteux à l’aide de tissus de souris sauvages et génétiquement modifiés.

Un ex Vivo Choroid Sprouting Assay de l’angiogenèse microvasculaire oculaire

Ce test utilise des cellules souches embryonnaires de souris différenciées en corps embryoïdes cultivés dans un gel de collagène 3D pour analyser les processus biologiques qui contrôlent la germination de l’angiogenèse in vitro. La technique peut être appliquée pour tester des médicaments, modéliser des maladies et étudier des gènes spécifiques dans le contexte de délétions mortelles pour les embryons.

In vitro Essai tridimensionnel de germination de l’angiogenèse à l’aide de cellules souches embryonnaires de souris pour la modélisation de maladies vasculaires et l’analyse de médicaments

La diaphonie entre les cellules épithéliales mammaires et les cellules endothéliales contribue de manière importante à la progression du cancer du sein, à la croissance tumorale et aux métastases. Dans cette étude, les sphéroïdes ont été fabriqués à partir de cellules cancéreuses du sein avec des cellules endothéliales vasculaires et / ou lymphatiques et démontrent leur applicabilité en tant que système in vitro pour la recherche sur le cancer du sein.

Les sphéroïdes épithéliaux et endothéliaux mammaires comme modèle fonctionnel in vitro potentiel pour la recherche sur le cancer du sein

Nous présentons ici un protocole qui permet une fabrication rapide, robuste et peu coûteuse de sphéroïdes tumoraux, suivie d’une encapsulation d’hydrogel. Il est largement applicable car il ne nécessite pas d’équipement spécialisé. Il serait particulièrement utile pour explorer les interactions sphéroïde-matrice et construire des modèles de physiologie tissulaire ou de pathologie in vitro .

Fabrication et encapsulation de sphéroïdes tumoraux dans des hydrogels de polyéthylène glycol pour étudier les interactions sphéroïde-matrice

Cette étude présente le test de migration bidimensionnel (2D) et le test de germination de sphéroïdes tridimensionnel (3D), ainsi que leurs méthodes d’analyse respectives en aval, y compris l’extraction d’ARN et l’immunocytochimie, comme des tests appropriés pour étudier l’angiogenèse in vitro.

Étude de l’angiogenèse aux niveaux fonctionnel et moléculaire en exploitant le test de migration des plaies par égratignures et le test de germination des sphéroïdes

Découvrez l'évaluation de la néovascularisation des hémangioblastomes par le test de germination d'ellipsoïdes in vitro. Cette méthode révèle le rôle de l'angiogenèse tumorale classique comme mécanisme complémentaire.

Une procédure complète d’évaluer la Performance In Vitro de la néovascularisation Hémangioblastome putatif à l’aide de l’ellipsoïde test de germination (Vidéo) | JoVE Journal

Une procédure complète d’évaluer la Performance In Vitro de la néovascularisation Hémangioblastome putatif à l’aide de l’ellipsoïde test de germination

Explorer plus de vidéos