Une procédure complète d’évaluer la Performance In Vitro de la néovascularisation Hémangioblastome putatif à l’aide de l’ellipsoïde test de germination

L’objectif global de cette expérience est d’évaluer la performance de la néovascularisation présumée de l’hémangioblastome à l’aide du test de germination de sphéroïdes in vitro. La méthode peut aider à répondre aux questions clés dans le domaine de l’angiogénie, telles que l’angiogenèse tumorale. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est le produit d’une procédure complète pour évaluer in vitro où l’angiogenèse tumorale classique existe dans l’hémangioblastome et elle se développe dans l’hémangioblastome.

L’implication de cette technique s’étend au traitement de l’hémangioblastum et du système vasculaire, car le résultat met en évidence la complexité de l’hémangioblastumor néovascularisation, ce qui suggère que cette forme courante d’angiogenèse n’est qu’un mécanisme complémentaire. Cette méthode peut donc donner un aperçu de l’étude de l’hémangioblastum ou de la néovascularisation. Il peut également être appliqué aux tumeurs, à l’angiogenèse et à la vasculogenèse dans certaines tumeurs solides, telles que le mimétisme vasculogénique tumoral dans la tumeur de verre.

La démonstration réelle de cette méthode est essentielle car la génération de ces étapes sphéroïdes de cellules endothéliales manipulées est difficile à apprendre. Parce que les conditions appropriées sont importantes. Tout d’abord, cultivez les cellules endothéliales HUVEC dans un milieu de culture DMEM complété par dix pour cent de sérum fœtal bovin, de la pénicilline et de la streptomycine.

Ensuite, maintenez la culture dans l’incubateur à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone. Ensuite, pour synthétiser le fragment de shRNA, digérez le plasmide avec les enzymes de restriction ApaI et EcoRI. Ensuite, dans le plasmide digéré, ajoutez les oligos avant et arrière, 10 tampons NEB et de l’eau distillée deux fois jusqu’à un volume final de 50 microlitres.

Après avoir ajouté tous les réactifs, chauffez le mélange à 98 degrés Celsius pendant quatre minutes. Ensuite, refroidissez progressivement à température ambiante en l’espace de quelques heures. Utilisez la ligase T4 pour ligaturer les oligos recuits et le plasmide.

Incuber le tube à quatre degrés Celsius pendant la nuit. Le lendemain, ajoutez cinq microlitres de mélange de ligature à 25 microlitres de cellules compétentes DH5alpha. Dans 500 microlitres de milieu DMEM, ajoutez le vecteur lentiviral ou le vecteur brouillé, ainsi que d’autres plasmides d’emballage.

Ensuite, incubez le mélange lentiviral pendant 25 minutes à 37 degrés Celsius. Après l’incubation, ajoutez 7 millilitres de milieu DMEM à la solution brouillée ou mélangée lentivirale. Cultivez les cellules de 293FT dans un milieu DMEM sans sérum de veau fœtal dans une boîte de culture de 10 centimètres.

Ajoutez un millilitre de solution lentivirale ou brouillée aux cellules de 293FT dans la boîte de culture. Après six heures, aspirez l’ancien milieu de la boîte de culture. Ensuite, remplacez l’ancien milieu par un milieu DMEM frais contenant 10 pour cent de sérum de bovin fœtal.

Après 48 heures, récupérez le support. Transférez les cellules endothéliales HUVEC dans le milieu lentiviral et maintenez-les pendant 72 heures. Ensuite, ajoutez deux microgrammes par millilitre de puromycine dans le milieu de culture cellulaire HUVEC.

Enfin, incubez la culture pendant encore 24 heures. Le lendemain, ajoutez un millilitre de trypsine EDTA pour trypsiniser les cellules HUVEC. Ensuite, mettez à nouveau en suspension la suspension de cellules trypsinisées dans un milieu DMEM avec 10 pour cent de sérum de veau fœtal.

Comptez le nombre de cellules à l’aide d’un compteur de cellules. Après avoir compté, ensemencez les cellules dans une plaque à fond rond 3D de 96 puits. Après l’ensemencement, incubez les cellules à 37 degrés Celsius avec cinq pour cent de dioxyde de carbone pendant 72 heures en continu.

Après 36 heures, remplacez la moitié du milieu de culture par un milieu frais. Tout d’abord, décongelez la solution de gel à quatre degrés Celsius, puis diluez-la dans un rapport de un à cinq avec le milieu sérique réduit. Aspirez les sphéroïdes du milieu DMEM à l’aide d’une micropipette.

Ensuite, lavez les sphéroïdes avec cinq millilitres de sérum réduit. Transférez soigneusement les sphéroïdes en suspension et le gel dilué. Dans une plaque à 15 puits, incorporer 300 microlitières du liquide mélangé de sphéroïdes et de gel dilué.

Incuber l’assiette à 37 degrés Celsius et 5 % de dioxyde de carbone pendant une heure. Ensuite, ajoutez 400 microlitres de sérum réduit dans un seul puits. Pour éviter l’évaporation, remplissez les environs du puits avec de l’eau stérile.

Ensuite, cultivez les cellules à 37 degrés Celsius, 5 % de dioxyde de carbone et 100 % d’humidité pendant une heure. Après l’incubation, aspirez l’ancien milieu et ajoutez 600 microlitres de milieu sérique réduit avec un supplément de croissance des cellules endothéliales à un pour cent dans le puits et incubez pendant une journée. Capturez des images à l’aide d’un microscope à lumière inversée.

Ici, la germination sphéroïde des cellules est capturée à l’aide d’un microscope à lumière inversée pour étudier l’effet du silençage du gène VHL sur le potentiel angiogénique des cellules endothéliales. On observe la germination d’un sphéroïde 12 heures après le traitement lentiviral dans les cellules endothéliales témoins et VHL réduites au silence. Ensuite, une analyse statistique est effectuée pour quantifier la longueur des germes générés par les sphéroïdes silencieux du gène VHL.

La longueur moyenne de la germination semble être d’environ 125 micromètres dans les groupes silencieux VHL alors qu’elle n’est que d’environ 65 micromètres dans le groupe témoin. La longueur moyenne cumulée de germination du groupe silencieux VHL est d’environ 1250 micromètres, tandis que celle du groupe témoin est de 680 micromètres. Ces résultats indiquent une augmentation de deux fois de la longueur de la germination dans les groupes silencieux VHL.

Une fois maîtrisée, cette technique peut être réalisée en 48 heures si elle est correctement exécutée. En suivant cette procédure et cette méthode, un test de formation capillaire peut être effectué afin de répondre à des questions supplémentaires. Comme l’exploration de la capacité angiogénique des cellules endothéliales vasculaires.

Après ce développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de l’angiogenèse pour explorer la vasculorisation interne de la tumeur. Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension des gènes qui perdent une fonction dans les cellules endothéliales manipulées utilisées pour le test d’explosion.