Visualisation de Compaction de l’ADN chez les cyanobactéries par haute tension Cryo-electron Tomography

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la microbiologie, telles que la façon dont la structure de l’ADN change au cours du cycle cellulaire des bactéries. Le principal avantage de cette technique est qu’il est possible de visualiser l’ultrastructure de cellules bactériennes entières proches de l’état vivant à des moments appropriés sans aucun traitement supplémentaire. Chihong Song, un postdoctorant de mon laboratoire, et Mako Hayashi, un étudiant diplômé du laboratoire du Dr Kaneko, feront la démonstration de la procédure.

Commencez par cultiver des cyanobactéries sur des plaques BG-11 stérilisées de neuf centimètres contenant 1,5 % de gélose et 0,3 % de thiosulfate de sodium. Incuber les plaques à 23 degrés Celsius sous un cycle de lumière de 12-12 avec 50 micro-E de lumière par mètre carré et par seconde. Pour conserver les cellules, transférez-les chaque semaine sur des plaques de gélose BG-11 fraîches.

En l’espace d’une semaine, les cultures apparaissent sous forme de bandes vertes. Transférez les amas verts de cellules à l’aide d’une boucle stérilisée à la flamme et faites-les strier sur la nouvelle plaque. Pour observer le compactage de l’ADN, prélevez les cellules cultivées pendant six jours à la fin de la période lumineuse.

Pour libérer les cellules de la plaque, ajoutez un millilitre de saccharose 0,2 molaire. Ensuite, récupérez la suspension cellulaire et répétez l’ajout et le retrait du saccharose jusqu’à ce que la solution devienne verte. Le changement de couleur indique que la plupart des cellules ont été libérées.

Maintenant, transférez 500 microlitres de solution de cellules en suspension dans un tube Microfuge et ajoutez une coloration Hoechst pour une concentration finale d’un microgramme par millilitre. Ensuite, laissez les cellules incuber dans l’obscurité pendant 10 minutes. Ensuite, faites tourner les cellules, jetez le surnageant et mettez-les en suspension dans 10 microlitres de saccharose de 0,2 molaire.

Ensuite, transférez un microlitre de suspension sur une lame de verre, mettez une lamelle et observez les cellules sous un microscope à fluorescence équipé d’un filtre UV. À l’aide d’un objectif d’immersion dans l’huile 100 fois, recherchez des preuves de compaction de l’ADN, qui devraient être observables dans la plupart des cellules. Préparez d’abord l’appareil de congélation plongeante.

Ensuite, installez le récipient d’azote liquide en insérant le récipient d’éthane et la fixation de la tige de refroidissement. Ensuite, remplissez le récipient d’azote liquide et refroidissez-le à la température de l’azote liquide. Après cela, chargez le gaz éthane dans le conteneur.

Assurez-vous de porter des lunettes de sécurité, car l’éthane liquide est explosif. Enfin, retirez la tige de refroidissement et couvrez le récipient avec un couvercle en plastique pour éviter de fixer le givre. Pour continuer, déchargez le côté carbone d’une grille EM recouverte de carbone pendant 30 secondes à 50 milliampères à l’aide d’une barrière ionique plasma.

Ensuite, préparez le Vitrobot selon le protocole de test. À l’aide d’une pince à épiler, la grille EM prétraitée est fixée à la chambre. Traitez la grille EM avec un traceur d’or BSA de 15 nanomètres d’un microlitre pour servir de marqueur repère avant d’appliquer l’échantillon.

Maintenant, aliquote 2,5 microlitres de suspension cellulaire sur la grille. Épongez tout excès de solution à l’aide de papier filtre et congelez immédiatement la grille dans de l’éthane liquide. Conservez la grille congelée dans de l’azote liquide jusqu’à ce qu’elle puisse être examinée.

Ensuite, démarrez le HVEM et réglez-le sur une haute tension d’un mégavolt. Ensuite, refroidissez le support de grille d’échantillon à moins 150 degrés Celsius avec de l’azote liquide. Une fois refroidie, montez la grille congelée dans le porte-échantillon cryogénique refroidi et chargez-la dans le HVEM.

Prenez soin de ne pas contaminer l’installation avec de la glace. Maintenant, sélectionnez une zone d’imagerie à faible grossissement de 1 000 fois. Ensuite, ajustez la hauteur de l’axe z eucentrique et inclinez la platine de l’échantillon à moins 60 degrés.

Ensuite, supprimez le jeu de la rotation d’inclinaison. Maintenant, faites la mise au point près de l’emplacement cible à un grossissement de 10 000 fois. Réglez une mise au point de six à 10 microns en déviant de l’image nette.

Pour l’imagerie, réglez la dose à deux électrons par angström carré par seconde ou moins. Gardez un œil sur la dose d’électrons, qui est réfléchie par la densité de courant, et prenez une image avec un appareil photo numérique ou sur un film d’électrons. Ensuite, collectez des images d’inclinaison de moins 60 à plus 60 degrés par incréments de deux à quatre degrés.

Utilisez les fonctions automatisées du microscope si possible. Ouvrez le progiciel commercial et chargez les images d’inclinaison pour la reconstruction tomographique. Ensuite, créez un fichier de pile d’images à partir des images individuelles à l’aide de la commande tif2mrc ou newstack.

Ensuite, démarrez le logiciel eTomo GUI et entrez les paramètres de l’image pour la taille des pixels, le diamètre repère, la rotation de l’image, etc. Créez donc le script d’édition. Maintenant, utilisez le logiciel suggéré pour créer une série d’inclinaisons, alignée à l’aide de repères, avec une erreur résiduelle moyenne inférieure à 0,5.

Enfin, reconstruisez un tomogramme 3D à l’aide de l’algorithme SIRT. Maintenant, extrayez une région d’intérêt du tomogramme et appliquez un filtre de débruitage, tel qu’un filtre de diffusion anisotrope, un filtre bilatéral ou un filtre de morphologie mathématique. Effectuez le filtrage à l’aide de paramètres qui améliorent le contraste de l’image.

Ensuite, segmentez une caractéristique qui vous intéresse. Utilisez la fonction de tranchage pour ouvrir le tomogramme. Ensuite, accédez à la fenêtre de l’éditeur de segmentation et sélectionnez un nouveau champ d’étiquette pour créer un fichier de segmentation.

Ensuite, tracez manuellement la bordure de l’entité d’intérêt dans la première tranche, puis chacune des autres tranches. Des fonctionnalités supplémentaires d’intérêt peuvent être ajoutées à l’aide des mêmes opérations. Maintenant, pour générer un rendu de surface à l’aide des options du menu SurfaceGen pour visualiser le volume segmenté, sélectionnez le menu SurfaceView.

Pour déplacer, faire pivoter et zoomer dans le volume 3D, utilisez les outils de la fenêtre du visualiseur 3D. La segmentation automatique peut être effectuée à l’aide de l’outil Baguette magique. Cliquez sur un objet et ajustez les curseurs dans Affichage et masquage afin que les caractéristiques de l’objet soient entièrement sélectionnées.

Dans une culture synchrone précise, l’ADN marqué avec Hoechst montre une distribution uniforme normale dans l’obscurité, puis se compacte progressivement dans la cellule pendant la période de lumière, prenant une structure ondulée en forme de bâtonnet à la fin de la période de lumière. Enfin, la tige se divise au centre, et ses deux parties sont réparties dans les cellules filles. Après la division cellulaire, l’ADN compacté disparaît immédiatement et l’ADN revient à une distribution uniforme normale.

Lorsque des cellules au stade final de la compaction de l’ADN ont été congelées et observées à l’aide de la microscopie électronique à haute tension, beaucoup ont montré une compaction distincte de l’ADN qui se distinguait facilement des cellules normales. Certains présentaient une constriction au centre des cellules, comme prévu avant la division cellulaire. À partir des tomogrammes 3D, l’ADN compact est visiblement séparé dans le cytoplasme et est entouré d’un matériau de faible densité.

Les couches de la membrane thylakoïde sont déformées le long de la tige ondulée d’ADN compacté. Il est intéressant de noter que de nombreux petits corps phosphatés adhèrent à l’ADN compacté et apparaissent généralement par paires. Ces polyphosphates peuvent être les fournisseurs de phosphate pour la synthèse de l’ADN.

Après avoir regardé cette vidéo, vous devriez avoir une bonne compréhension de la façon de visualiser l’ultrastructure de cellules bactériennes entières proches de l’état vivant au moment approprié par cryo-microscopie électronique à haute tension sans aucun traitement supplémentaire comme la coloration. Lors de la tentative de cette procédure, il est important de se rappeler que l’état de compaction de l’ADN change à chaque minute à la fin du cycle de lumière. Assurez-vous de ne pas manquer le meilleur moment pour congeler l’échantillon.

Suite à cette procédure, d’autres méthodes comme CLEM peuvent être mises en œuvre afin de répondre à des questions supplémentaires sur la localisation de protéines ou de nucléotides spécifiques dans l’ADN compacté. Après son développement, cette technique devrait ouvrir la voie aux chercheurs dans le domaine de la microbiologie pour explorer la division cellulaire, la ségrégation de l’ADN et l’infection virale chez les bactéries ou chez les petits eucaryotes.