Distinction simultanée de monospécifiques et modèles mixtes DFS70 cours ANA de dépistage avec un substrat de roman HEp-2 ELITE/DFS70 Knockout

L’objectif global de cette procédure est de démontrer un test immunofluorescent indirect amélioré qui utilise un nouveau substrat HEp-2, dense finement speckled 70 knockout pour cribler les auto-anticorps antinucléaires et confirmer simultanément les motifs monospécifiques et denses finement speckled 70. Le nouveau substrat HEp-2 utilise une procédure d’immunofluorescence indirecte standard et des critères d’interprétation pour le dépistage d’anticorps antinucléaires cliniquement pertinents, également connus sous le nom d’ANA. Le principal avantage est la capacité de distinguer le motif dense finement moucheté 70 des motifs associés à la maladie, mouchetés homogènes ou mixtes difficiles à l’étape de criblage.

Sofia Badanin, une technicienne de notre laboratoire de contrôle de la qualité, fera la démonstration de la procédure. Pour les lames de substrat, utilisez des lames de verre avec 12 puits sur chaque lame, contenant soit les cellules HEp-2 conventionnelles, soit un mélange de cellules HEp-2 conventionnelles et denses finement mouchetées à 70 cellules HEp-2. Laissez les sachets contenant les lames de substrat s’équilibrer à la température ambiante pour des performances optimales et pour éviter la condensation de l’humidité sur la surface de la lame avant l’ajout de l’échantillon.

Cela devrait prendre entre 10 et 15 minutes. Une fois équilibré à température ambiante, retirez soigneusement les lames de substrat à l’aide de vos doigts, en évitant tout contact entre les lames et les côtés du sachet. Étiquetez les lames et placez-les dans une chambre d’incubation tapissée d’essuie-tout humidifié pour éviter le dessèchement des lames pendant l’incubation de l’échantillon et du conjugué.

Distribuez environ 50 microlitres des témoins négatifs et positifs, ainsi que le sérum dilué du patient dans des puits de lames individuels avant de placer les lames dans la chambre d’incubation. Le test ANA est la première étape du dépistage d’une maladie auto-immune. Il est essentiel d’éviter la contamination croisée des échantillons de patients sur la lame afin de minimiser les résultats faussement positifs ou faussement négatifs.

Pour éviter la contamination croisée des puits, évitez de trop remplir les puits. Placez le couvercle sur la chambre d’incubation et incubez les lames pendant 30 minutes à température ambiante. S’il y a de l’ANA présent dans le sérum du patient, il se liera aux cellules présentes dans chaque testament pendant ce temps.

Une fois la période d’incubation terminée, retirez la lame de la chambre d’incubation. Tenez la lame à l’extrémité de la languette et rincez doucement pendant 10 à 15 secondes avec environ 10 millilitres de tampon de lavage salin tamponné au phosphate reconstitué. Transférez immédiatement la lame dans un bocal Coplin avec un tampon de lavage PBS et faites-la tremper pendant 10 minutes.

Répétez le processus avec toutes les lames restantes. Ne retirez qu’une seule lame à la fois du bocal Coplin. Pour retirer l’excès de tampon de lavage PBS de la diapositive, tapotez ou épongez doucement la diapositive sur une serviette en papier.

Sur chaque puits, appliquez doucement une goutte d’isothiocyanate de fluorescéine, marqué comme conjugué fluorescent anti-IgG humain. Ensuite, incubez les lames dans la chambre d’incubation de coloration fermée pendant 30 minutes. Une fois la période d’incubation terminée, retirez la lame de la chambre d’incubation.

Tenez la glissière à l’extrémité de la languette et rincez doucement comme précédemment, avec environ 10 millilitres de tampon de lavage PBS. Transférez immédiatement la lame dans un bocal Coplin avec un tampon de lavage PBS et faites-la tremper pendant 10 minutes. Placez les lamelles fournies dans le kit sur une serviette en papier sèche.

Sur le bord inférieur de la lamelle, appliquez entre 3 et 4 gouttes du support de montage en ligne. Ensuite, retirez une lame à la fois du pot Coplin contenant le tampon de lavage. Pour retirer l’excès de tampon de lavage, tapotez ou épongez doucement la glissière sur l’essuie-tout.

Évitez de laisser une quantité excessive de tampon de lavage sur la lame, d’appliquer trop de pression sur la lamelle ou d’introduire des bulles d’air. Tous ces éléments peuvent avoir un impact sur la morphologie cellulaire, les motifs fluorescents qui en résultent et l’intensité des réactions. Abaissez doucement la glissière sur la lamelle, en plaçant le bord inférieur de la glissière sur le bord de la lamelle.

Cela permet au support de montage présent sur la lamelle de s’écouler vers le bord supérieur de la glissière et minimise la formation de bulles d’air, qui peuvent interférer avec la lecture de chaque puits. Visualisez les lames à l’aide d’un microscope fluorescent, à l’aide d’un ensemble de filtres isothiocyanates de fluorescéine situé dans une chambre noire. Examinez l’échantillon à la recherche d’une fluorescence vert vif spécifique au microscope à un grossissement de 200 fois ou plus pour faire l’interprétation finale concernant la positivité et le motif.

Observez les contrôles positifs et négatifs. Le témoin positif affichera une fluorescence vert vif dans le noyau. Le contrôle négatif n’affichera aucune fluorescence verte spécifique sous un microscope à fluorescence.

Notez le résultat positif ou négatif pour chaque puits et incluez le modèle ANA pour les cas positifs. Le substrat dense et finement moucheté 70 knockout HEp-2 préserve tous les principaux motifs nucléaires et cytoplasmiques. Le motif moucheté fin dense est caractérisé par la présence d’une coloration mouchetée uniformément répartie dans tout le noyau interphasique et la chromatine dans la phase mitotique.

La présence de cellules HEp-2 conventionnelles qui expriment l’antigène 70 finement moucheté 70 dense et de cellules HEp-2 modifiées dépourvues de l’antigène facilite la distinction précise du motif 70 moucheté fin dense, tout en conservant tous les avantages des substrats HEp-2 conventionnels. Des sérums positifs pour les principaux profils d’ANA associés à des maladies majeures ont été mélangés à un sérum dense finement moucheté de 70 motifs positifs dans des proportions égales et testés à la fois sur des substrats HEp-2 conventionnels et sur des substrats denses finement mouchetés 70 knockout. Ici, les flèches rouges indiquent les cellules en phase mitotique.

Les flèches jaunes indiquent les noyaux HEp-2 conventionnels et les flèches bleues indiquent les noyaux HEp-2 modifiés. Pour toutes les combinaisons de réactions représentées, le substrat dense et finement moucheté 70 knockout présente une nette différence d’intensité entre les cellules non modifiées et les cellules modifiées sur le même champ de vision. Cela permet de distinguer les réactions monospécifiques et denses mixtes finement mouchetées 70.

Les auto-anticorps dirigés contre les antigènes nucléaires et cytoplasmiques sont très répandus dans les maladies auto-immunes systémiques. On a signalé que le motif dense et finement moucheté résultant d’anticorps automatiques dirigés contre DFS70, également connu sous le nom de protéine PSIP1, était très répandu dans les populations saines. De plus, ces auto-anticorps DFS70 sont présents à la fois isolés et associés à d’autres ANA associés à la maladie.

Il est donc essentiel pour les laboratoires cliniques de distinguer avec précision ce modèle des autres modèles associés à la maladie. Par exemple, dans le cas d’un motif moucheté homogène mixte, qui est associé au lupus, il pourrait être interprété à tort comme un motif DFS70, ce qui nécessiterait plusieurs tests de confirmation. La méthode d’immunofluorescence indirecte utilisant des substrats HEp-2 est considérée comme la méthode de dépistage de référence pour les ANA.

Cependant, la précision dépend fortement de l’habileté du technicien, de l’exécution minutieuse des différentes étapes et de l’interprétation précise des motifs résultants. À l’inverse, l’évaluation comparative des substrats d’infonçabilité HEp-2 et DFS70 conventionnels démontre l’utilité de ce nouveau substrat pour distinguer le motif DFS70 avec un niveau de confiance élevé, tout en dépistant les ANA. L’interprétation ultérieure des motifs DFS70 monopositifs et mixtes a été relativement simplifiée à l’aide de ce substrat HEp-2 amélioré.

Le nouveau substrat utilise un protocole standard d’immunofluorescence indirecte et des critères d’interprétation établis pour tous les motifs d’ANA cliniquement pertinents.