Développement de dispositifs microfluidiques pour étudier la capacité d’élongation de la pointe de croissance des cellules végétales dans des espaces très réduits

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine de la biologie cellulaire végétale, telles que la façon dont les cellules végétales en croissance à pointe pénètrent les barrières physiques cellulaires. Le principal avantage de cette technique est la possibilité d’acquérir des images à haute résolution qui reconstruisent le processus de déformation d’une cellule à l’échelle micrométrique sous un microscope conventionnel. Pour fabriquer un appareil permettant d’examiner les tubes polliniques en croissance et les protonématas de mousse, préparez d’abord environ 11 grammes d’un PDMS et chargez-le dans un moule de quatre pouces.

Ensuite, dégazez le moule pendant 20 minutes dans une chambre à vide. Ensuite, faites durcir le moule à 65 degrés Celsius pendant 90 minutes. Une fois durci, décollez la couche PDMS du moule et ouvrez les trous d’accès au canal à l’intérieur du PDMS à l’aide d’un outil de biopsie.

Ensuite, exposez le PDMS et la parabole en verre de cinq centimètres à du plasma d’air pendant 50 secondes. Pour sceller le réseau microfluidique, appuyez sur la couche PDMS sur la boîte en verre et faites-la durcir pendant 30 minutes à 65 degrés Celsius. Pour fabriquer un microdispositif conçu pour l’examen des poils racinaires, deux moules sont chargés et durcis.

Lorsque vous percez les trous de canal, utilisez un poinçon de deux millimètres. Après avoir exposé les deux couches au plasma aérien pendant 50 secondes, assemblez-les, y compris une lamelle, sous un stéréomicroscope. Utilisez l’outil d’alignement sur mesure pour ce faire.

Durcir l’ensemble pendant 30 minutes au four pour sceller le réseau microfluidique. Après durcissement, retirez la lamelle de l’appareil et transférez-la dans un plat en verre de cinq centimètres. Avant d’utiliser le microdispositif du tube pollinique, dégazez-le dans une chambre à vide pendant 20 minutes.

Ajouter le milieu de culture à l’entrée du pistil à l’aide d’une micropipette à pointe fine. Chargez les autres puits avec le même milieu. Attendez quelques minutes pour que les canaux se remplissent.

Pendant ce temps, placez une serviette en papier humide dans le plat pour aider à maintenir l’humidité locale. Maintenant, récoltez des grains de pollen sur une fleur bleue et blanche de T. fournieri. Transférez les grains sur le stigmate à l’aide d’une aiguille à dissectionner.

Ensuite, coupez un style pollinisé d’un centimètre de long dans le sens de la longueur, puis insérez le style coupé dans l’entrée du dispositif microfluidique. Lorsque le style coupé est inséré dans l’entrée du dispositif microfluidique à l’aide d’une pince à épiler, il est important de ne pas tenir le style très serré car cela pourrait endommager le style. Ensuite, fixez un couvercle sur le plat à l’aide de ruban adhésif et transférez le plat dans un incubateur à 28 degrés Celsius où il doit rester dans l’obscurité pendant cinq à six heures.

En travaillant sous une hotte à flux laminaire, commencez par stériliser les graines transgéniques d’A. thaliana Columbia. Faites-les tremper dans une solution de nettoyage pendant cinq minutes. Ensuite, rincez abondamment les graines à l’eau autoclave.

Une fois stérilisées, conservez les graines à quatre degrés Celsius dans l’obscurité pendant 48 heures. Quelques jours plus tard, dégazez le microappareil pendant 20 minutes avant de l’utiliser. Ensuite, chargez le milieu de croissance approprié dans les puits de l’appareil à l’aide d’une pipette à pointe fine et attendez quelques minutes que la solution soit aspirée à travers tous les canaux.

Chargez également un peu d’essuie-tout humide sur le plat pour maintenir l’humidité. Maintenant, transférez une graine préparée dans l’entrée de l’appareil. Ensuite, fixez le couvercle à l’aide de ruban adhésif et transférez le plat dans un incubateur à 22 degrés Celsius avec une lumière continue.

Avant son utilisation, stérilisez le microdispositif sous UV pendant la nuit. Le lendemain, dégazez le microappareil pendant 20 minutes. Une fois dégazés, chargez les micropuits avec le milieu de croissance approprié.

Pendant que les canaux se remplissent progressivement, entourez le microappareil d’un peu d’eau autoclavée pour maintenir l’humidité. Transférez un petit morceau de tissu de protonée de mousse à l’entrée du microappareil. Maintenant, cultivez l’appareil à 25 degrés Celsius sous une lumière continue.

Après deux à trois semaines de croissance, prenez des images en fond clair des résultats au microscope. Les cellules végétales en croissance à pointe rencontrent une série de barrières physiques le long de leurs voies de croissance in vivo, comme dans le conduit de transmission et au niveau du micropyle, sans parler du chemin des poils racinaires dans le sol. Les plateformes de culture cellulaire microfluidique in vitro présentées permettent d’examiner le processus de croissance des pointes dans trois types de cellules végétales, les tubes polliniques, les poils racinaires et les protonémates de mousse.

La visualisation est réalisée à travers des espaces d’un micron dans les appareils. Parce que les micro-espaces de cette taille sont fragiles, ils se ferment parfois, surtout après une utilisation répétée. Ainsi, il est important de vérifier que les espaces sont intacts avant d’effectuer les expériences.

Pour l’étude du tube pollinique, l’imagerie des cellules vivantes a été utilisée pour surveiller les changements morphologiques dans la région apicale des tubes polliniques, ainsi que dans le noyau végétatif et les spermatozoïdes en réponse à la rencontre d’un espace extrêmement petit. Après son développement, cette technique a ouvert la voie aux chercheurs dans le domaine de la biologie cellulaire végétale pour explorer la capacité d’élongation des cellules végétales à croissance en pointe, telles que les tubes polliniques, les poils racinaires et les protonémata de mousse dans un espace extrêmement petit.