Évaluation de l’Impact de l’agrégation de protéines sur le Stress oxydatif cellulaire chez la levure

L’objectif global de cette procédure est de déterminer la relation entre la formation d’agrégats de protéines intracellulaires et leur impact sur le stress oxydatif cellulaire à l’aide de la levure de boulangerie Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies de mauvais repliement et d’agrégation des protéines, telles que les troubles neurodégénératifs et les amyloïdoses non neuropathiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple, rapide et qu’elle permet de quantifier les dommages causés par le stress oxydatif cellulaire dans une grande population de levures.

Avec cette méthode, nous pouvons donner un aperçu de la corrélation entre l’état soluble ou agrégé intracellulaire d’une protéine amyloïdogène et les niveaux de stress oxydatif chez la levure. De plus, il peut également être appliqué à d’autres organismes modèles exprimant des protéines recombinantes. Manuela Costa, technicienne de l’installation de cytométrie en flux de l’UAB, fera la démonstration de l’analyse par cytométrie en flux.

Dans cette étude, l’état d’agrégation intracellulaire de différents variants du peptide A-bêta-42 est suivi à l’aide de S. cerevisiae transformé avec un plasmide codant pour A-bêta-42 fusionné à la GFP sous le contrôle d’un promoteur induit par le galactose. Prélevez une colonie de cellules de levure transformées et inocutionnez-la dans 20 millilitres de milieu SC moins Ura contenant 2 % de glucose. Cultivez la culture à 30 degrés Celsius sous agitation pendant la nuit.

Le lendemain, inoculez 100 microlitres de la culture de nuit dans cinq millilitres de milieu SC moins Ura frais, et faites pousser les cellules à 30 degrés Celsius pendant deux à trois heures. Lorsque la culture est à une densité optique de 590 nanomètres ou à une OD 590 de 0,5, centrifugez la culture à 3 000 fois g pendant quatre minutes, jetez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans cinq millilitres de milieu SC moins Ura frais contenant 2 % de raffinose. Incuber les cellules à 30 degrés Celsius sous agitation pendant 30 minutes.

Après 30 minutes, centrifuger les cellules à 3 000 fois g pendant quatre minutes, jeter le surnageant et remettre les cellules en suspension dans un milieu SC moins Ura frais contenant 2 % de galactose pour induire l’expression de la protéine recombinante. Remettez les cellules dans l’incubateur pendant 16 heures. Après 16 heures, récoltez les cellules en transférant des aliquotes d’un millilitre de la culture dans des tubes de microcentrifugation stériles et en centrifugeant à 3 000 fois g pendant quatre minutes.

Commencez cette procédure en déterminant la DO 590 des cellules de levure induites pendant 16 heures. Diluez ensuite les cellules dans du PBS stérile à un OD 590 de 0,1. Transférez les suspensions de cellules d’expression dans des tubes en polystyrène à fond rond étiquetés de manière appropriée et protégez-les de la lumière.

Préparer les cellules non induites comme contrôle négatif pour l’analyse par cytométrie en flux. Ajouter la sonde de stress oxydatif à chaque échantillon à une concentration finale de cinq micromolaires. Couvrez les échantillons de papier d’aluminium et incubez à 30 degrés Celsius pendant 30 minutes.

Lorsque l’incubation est terminée, faites tourner les cellules, retirez le surnageant et remettez en suspension les granules cellulaires dans le PBS. Lavez les cellules trois fois de cette manière avec du PBS. Après le troisième lavage, remettez en suspension les cellules dans le même volume de PBS.

Assurez-vous que les cellules non colorées sont incluses dans l’analyse par cytométrie en flux. À l’aide des lasers et des filtres appropriés, effectuez l’analyse par cytométrie en flux pour détecter la GFP et le signal fluorescent de la sonde de stress oxydatif. Commencez par cliquer sur le panneau Ouvrir une nouvelle feuille de calcul et donnez un nom à l’expérience.

Dans la barre d’outils, sélectionnez l’outil Nuage de points et créez un tracé avec les variables Zone de dispersion latérale sur l’axe des y et Zone de diffusion vers l’avant dans une échelle linéaire sur l’axe des x. Cliquez sur l’outil Nuage de points et créez un graphique avec les variables Zone FITC sur l’axe des x et Zone APC sur une échelle logarithmique sur l’axe des y. Cliquez sur l’icône Réglage de l’instrument et réglez tous les niveaux de compensation à zéro dans l’onglet Compensation.

Cliquez ensuite sur l’onglet Acquisition, et sélectionnez un nombre total de 20 000 événements à enregistrer avec un faible débit. Étant donné que le signal d’émission fluorescente d’un fluorochrome peut être détecté par un autre détecteur, il est important d’effectuer un processus de compensation pour égaliser le signal min de chaque fluorochrome dans tous les détecteurs par une commande monocolore. Renommez le tube 001 en contrôle négatif et cliquez sur l’onglet Acquérir pour commencer à exécuter les cellules non induites et non colorées.

Ajustez la tension dans les paramètres de l’instrument de la diffusion directe et latérale jusqu’à ce que la population soit répartie dans le quadrant central gauche. Cliquez sur l’icône Polygone pour définir une région R1 autour de la population de cellules, à l’exclusion des débris cellulaires, et utilisez cette population fermée P1 égale à R1 pour toutes les représentations de diagrammes de points fluorescents et d’histogrammes. Pour régler la tension PMT du signal de fluorescence, exécutez les cellules non colorées dans le diagramme de points FL1 à FL3, en réglant le gain dans l’onglet Réglage de l’instrument, jusqu’à ce que les cellules soient réparties dans le quadrant inférieur gauche.

À l’aide de l’outil de nuage de points, créez un graphique à points avec les variables FITC-A dans l’axe des x par rapport à FSC-A et un deuxième graphique à points avec les variables APC-A dans l’axe des x par rapport à FSC-A. Ensuite, changez l’échantillon pour les cellules induites pour mesurer la fluorescence GFP. Dans l’onglet Réglage de l’instrument, définissez le gain dans le FSC-A par rapport au FITC lorsque la population est distribuée dans le quadrant inférieur droit.

Définissez la population cellulaire GFP positive à l’aide d’une porte. Changez l’échantillon pour les cellules colorées non induites. Affichez le stress oxydatif par fluorescence sur un graphique à points FSC-A par rapport à APC-A.

Réglez le gain jusqu’à ce que la population cellulaire soit distribuée dans le quadrant supérieur gauche. Gate la population cellulaire positive en P3. Avec l’icône de l’histogramme, créez deux graphiques d’histogramme pour représenter la fluorescence cellulaire, l’un pour la fluorescence FITC et l’autre pour la fluorescence APC. Créez un tableau affichant l’intensité moyenne de la fluorescence et la fluorescence médiane avec l’erreur-type correspondante et/ou le coefficient de variance pour les niveaux de fluorescence GFP et de stress oxydatif.

Cliquez sur l’onglet Compensation et mettez tous les niveaux de rémunération à zéro. Cliquez sur l’onglet Acquisition et sélectionnez un nombre total de 20 000 événements à enregistrer. Préparez trois nouveaux tubes d’échantillons et nommez-les non induits, solubles induits et agrégés induits.

Acquérez des données à partir des échantillons avec les paramètres prédéfinis. Analysez les données en ouvrant une nouvelle feuille et en créant un diagramme à points pour les variables FITC-A et APC-A, en bloquant les cellules positives pour la coloration CellROX. Pour chaque échantillon, créez un tableau de statistiques avec la fluorescence moyenne et l’erreur type pour les canaux FITC et APC.

Il est également possible de trier les cellules à l’aide d’un trieur FACS suite au comptage agrégé des protéines. Les cellules de levure exprimant des variants A-bêta-42 après une période d’induction de 16 heures sont visualisées au microscope à fluorescence pour déterminer la distribution des protéines recombinantes à l’intérieur des cellules. Ces images sont représentatives de certaines variantes de la GFP A-beta-42.

La formation d’inclusions protéiques, ou PI, a été confirmée dans 10 des 20 variantes de la collection analysée. Ce graphique à barres indique le pourcentage de cellules contenant différents nombres d’IP calculé à partir d’un total de 500 cellules fluorescentes pour chaque variant en réplicats biologiques. Une excellente concordance entre les propriétés d’agrégation prédites et in vivo a été observée.

Les niveaux d’expression protéique dans les extraits cellulaires ont été quantifiés à l’aide d’un anticorps A-bêta-spécifique. En règle générale, les variants A-bêta-42 formant des PI, colorés en vert, sont présents à des niveaux inférieurs à ceux distribués de manière diffuse dans le cytosol, colorés en rouge. Des différences importantes entre les variants A-bêta-42 ont été observées lorsque leurs propriétés de fluorescence de sonde de stress oxydatif, de protéines et de fluorescence GFP étaient représentées par rapport à leur capacité à former des PI et à leurs propensions intrinsèques à l’agrégation prédites par l’algorithme bioinformatique AGGRESCAN ou TANGO.

Les variantes formant PI sont en vert et les variantes non formant PI sont en rouge. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes telles que la coloration à l’iodure de propidium ou à l’annexine V peuvent également être effectuées pour répondre à des questions supplémentaires telles que la détermination de l’impact d’une variante protéique exprimée intracellulaire sur l’apoptose cellulaire ou la cytotoxicité.