Name: Évaluation de l’Impact de l’agrégation de protéines sur le Stress oxydatif cellulaire chez la levure (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-06-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 4 s
Description: Découvrez une méthode de cytométrie en flux pour évaluer le stress oxydatif induit par l'agrégation de protéines amyloïdes chez Saccharomyces cerevisiae. Cette technique simple permet de quantifier les dommages cellulaires dans de grandes populations.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

1. Cultures de S. cerevisiae et Expression de la protéine
Remarque : Les variantes Aβ pièce propensions d’agréger les relative due à une mutation dans un seul résidu à la position 19 (Phe19) du peptide Aβ42 (Figure 1 a). Ces variantes de peptide sont marquées par la protéine fluorescente verte (GFP), constituant ainsi une agrégation journaliste (Figure 1)29.
<ol><li>Transformer les plasmides codant pour 20 variantes Aβ42-GFP dans des cellules de levure avec une BY4741 fond parental (MATa sa3Δ1 leu2Δ0 a rencontré15Δ0 ura3Δ0)30. Chaque plasmide codant pour un mutant Aβ42 fusionné à la GFP par un éditeur de liens GSSGSSG. Les plasmides sont pESC(-URA) et incluent le marqueur sélectionnable URA329.<ol>
<li>Préparer le milieu synthétique complet sans uracile (SC-URA) avec les composants suivants : 1,9 g/L azote de levure base sans uracile, sulfate d’ammonium 5 g/L et 900 mL de ddH2O combiné avec 100 mL de glucose 20 % (p/v).</li>
		<li>Mettez une colonie les transformé des cellules de levure dans 20 mL de milieu SC-URA contenant 2 % de glucose et poussent les cultures du jour au lendemain à 30 ° C sous agitation à 210 t/mn.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Le lendemain, poussent les nouvelles cultures de cellules de levure par inoculation 100µl de la culture au jour le jour dans 5 mL de milieu frais de SC-URA.</li>
	<li>Une OD590 de 0,5, centrifuger les cultures à 3 000 x g pendant 4 min, jeter le surnageant et remettre en suspension les cellules dans le même volume de milieu SC-URA frais contenant 2 % raffinose.</li>
	<li>Incuber à 30 ° C sous agitation à 210 tr/min pendant 30 min. Puis, centrifuger les cellules à 3 000 x g pendant 4 min et éliminer le surnageant. Remettre en suspension les cellules dans un milieu frais SC-URA contenant 2 % de galactose pour induire l’expression de protéine recombinante.</li>
	<li>Après 16 h d’induire l’expression de la protéine dans un milieu SC-URA contenant 2 % de galactose, récolter 1 mL des cellules induits dans des microtubes stériles à par centrifugation à 3 000 x g pendant 4 min. Remarque : Les différences principales se produisent après qu’une période d’induction de 16 h. Induced levures exprimant des variantes Aβ42-GFP peut être visualisée par microscopie à fluorescence pour déterminer la distribution de protéines recombinantes dans les cellules (Figure 2 b).</li>
</ol>2. coloration de la cellule
Remarque : Des cellules fraîches non induite sont requis comme témoin négatif de fixer un seuil de fluorescent au cours d’une analyse FC.
<ol><li>Prenez les cellules de levure induite par h 16 et de déterminer leur densité optique à 590 nm (OD590). Diluez-les dans une saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) à une OD590 de 0,1.<ol>
<li>Préparer 1 x solution saline tamponnée au phosphate comme suit : ajouter 8 g de NaCl, 0,2 g de KCl, 1,44 g de Na2HPO4, et de 0,24 g de KH2PO4 à 800 mL de ddH2O. remplir la solution jusqu'à 1 L de ddH2O après ajustement du pH à 7.4 avec HCl filtrer le tampon à travers un filtre de 0,2 µm.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Transférer les suspensions cellulaires exprimant à tubes correctement identifiés (polystyrène de mm fond rond de 12 x 75) et de les protéger de la lumière. Assurez-vous qu’ils sont prêts à être chargés sur le cytomètre en flux pour l’analyse, ainsi que de cellules non induite et non colorés.</li>
	<li>Ajouter la sonde du stress oxydatif (p. ex., CellROX rouge foncé) pour chaque échantillon à une concentration finale de 5 µM et incuber les cellules à 30 ° C pendant 30 min à l’obscurité.</li>
	<li>Après incubation, laver les cellules 3 fois avec 1 x PBS et les remettre en suspension dans le même volume de tampon avant leur analyse par le FC.</li>
</ol>3. analyse en cytométrie en flux
Remarque : Utilisez une configuration FC avec des lasers appropriés et de filtres pour détecter GFP et le signal de fluorescence de sonde le stress oxydatif. Un cytomètre en flux équipé d’un laser à 488 nm bleu pour la détection des GFP et un laser de 635 nm rouge pour la détection de la fluorescence de sonde de stress oxydatif peut être utilisé. Acquisition de fluorescence d’émission de GFP et sonde le stress oxydatif est exécutée avec un filtre de nm BP 530/30 et un filtre de BP 660/20, respectivement (tableau 1).
<ol><li>Cliquez sur le Nouveau panneau de feuille de calcul ouverte et créer les parcelles de dot acquisition suivants.<ol>
<li>Sélectionnez Scatter Plot outil dans la barre d’outils et de créer un terrain avec les variables secondaires Scatter-zone (SSC-A) sur l’axe des ordonnées vs Forward Scatter-zone (FSC-A) à une échelle linéaire sur l’axe des abscisses.</li>
		<li>Cliquez sur l' Outil de traçage Scatter de la barre d’outils et de créer un terrain avec les variables FL1-zone (FITC) sur l' axe des abscisses vs. LV3-zone (APC) dans une échelle logarithmique sur l’axe y.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Cliquez sur l’icône Paramètres Instruments . Cliquez sur l’onglet de Compensation et de définir tous les niveaux de rémunération. Cliquez sur l’onglet Acquisition et sélectionnez un nombre total de 20 000 événements à enregistrer.</li>
	<li>Cliquez sur l’icône de Débit pour passer le débit d’eau faible.</li>
	<li>Cliquez sur l’onglet Acquire pour commencer à courir les cellules non induite, colorées ou non et d’ajuster la tension dans les Paramètres de l’Instrument de l’attaquant et la diffusion latérale jusqu'à ce que la population se répartit dans le quadrant de centre-gauche.<ol>
<li>Cliquez sur l’icône de polygone pour définir une zone R1 autour de la population de cellules à l’exclusion des débris cellulaires et utilisez cette population fermée P1 = R1 pour toutes les parcelles dot fluorescent et représentations de l’histogramme (Figure 3).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour ajuster la tension de la PMT du signal de fluorescence, exécuter les cellules non colorés dans la parcelle de dot FL1-LV3, réglage du gain dans l’onglet Configuration de l’Instrument , jusqu'à ce que les cellules sont distribués dans le quadrant inférieur gauche.</li>
	<li>Remplacez l’exemple les cellules induites pour mesurer la fluorescence GFP. Dans l’onglet Configuration de l’Instrument , réglez le gain à la FSC-A vs FL1 (FITC) lorsque la population est répartie dans le quadrant inférieur droit. Définir la population de cellules positives avec une porte (Gate P2).</li>
	<li>L’échantillon à la non induite par le changement colorées des cellules pour afficher le stress oxydatif de la fluorescence sur une parcelle de dot FSC-A vs LV3 (APC). Accordez le gain jusqu'à ce que la population cellulaire est distribuée dans le quadrant supérieur gauche. Porte la population de cellules positives en P3.</li>
	<li>Faire deux parcelles d’histogramme avec l’icône histogramme pour représenter la fluorescence de la cellule. Pour représenter l’intensité de la fluorescence, assurez-vous que FL1 (FITC) représentant la fluorescence GFP est dans l’axe des abscisses, et LV3 (APC) représentant la fluorescence est dans l’axe des ordonnées, appliquant les populations P2 et P3 sur une échelle logarithmique, respectivement. NOTE : Superpositions histogramme sont une bonne façon d’illustrer les différences entre les profils de fluorescence des cellules exprimant les différentes variantes de bêta-amyloïdes.</li>
</ol>4. recombinant Protein immunodétection
<ol><li>Pour déterminer les niveaux d’expression de protéine, récolter les cultures de levures induites pour 16 h par centrifugation à 4 000 x g pendant 6 min et stocker les pellets de cellule à-80 ° C.<ol>
<li>Remettre en suspension les cellules recueillies exprimant la protéine recombinante pendant 16 h dans du PBS. Préparer des suspensions de cellules 200 µL de chaque mutant Aβ42-GFP à une OD590 de 20.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour l’analyse de fraction de protéine totale, récolter 100 µL de chaque mutant par centrifugation à 14 000 x g pendant 20 min et remettre en suspension les granules cellulaires dans le même volume de tampon de lyse levure Y-par (50 mM Tris-HCl pH 8,0, 1 % DMSO, 200 mM NaCl, EDTA 1 mM contenant 10 mg/mL SB3-14 (myr istyl sulfobétaïne) complétée avec le fluorure phénylméthylsulfonyle (PMSF) de 1 mM).<ol>
<li>Incuber les échantillons pendant 20 min à température ambiante sous agitation légère.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Déterminer la concentration d’extrait de protéine à l’aide de l’analyse de Bradford. Charger jusqu'à 5 µg d’extrait de protéines de l’échantillon sur un gel de l’électrophorèse SDS-PAGE 15 % d’acrylamide et tache sur une polyvinylidène difluoride (PVDF) membrane à 100 V pour 60 min.<ol>
<li>Préparer un Bradford réactif avec 100 mg de bleu de Coomassie brillant bleu G-250 dissoute dans 50 mL d’éthanol à 95 % et ajouter 100 mL d’acide phosphorique à 85 % (p/v). Puis, lorsque la teinture est complètement dissous, diluer le mélange avec les ddH2O à 1 L et filtrer sur papier filtre cellulose juste avant utilisation. Remarque : Le réactif de Bradford devrait être brun clair.</li>
		<li>Préparer un étalon d’albumine sérique bovine (BSA) allant de 5 à 100 µg de protéine pour 1 000 µL de réactif de Bradford.</li>
		<li>Ajoutez 1-10 µL de protéine extrait à 1 mL de réactif de Bradford et incuber le mélange à température ambiante pendant 5 min.</li>
		<li>Mesurer l’absorbance des normes et les échantillons d’extrait de protéine à OD595.</li>
		<li>Pour l’analyse, faire un complot avec les valeurs d’absorbance obtenues pour les normes vs. µg de protéines. D’après la courbe d’étalonnage, déterminer les concentrations des échantillons originaux de la quantité de protéines, compte tenu du volume et la dilution, le cas échéant.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rincer la membrane avec 1 x Tris salin (SCT), 0,1 % Tween 20 (TTBS) et la bloquer à l’aide de 5 % (p/v) de lait sec dans 1 x TTBS.<ol>
<li>Pour préparer 1 L de 10 x TBS, dissoudre 24 g de base Tris et 88 g de NaCl dans 900 mL d’H2OJJ et ajuster le pH à 7,6. Ajouter ddH2O pour un volume final de 1 L. Pour une solution de 1 x, mélanger 1 partie de stock de x 10 en 9 parties de ddH2O.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Incuber la membrane pendant 1 h avec un 6E10 dilué 1 : 1 000 anticorps primaire de β-amyloïde et pendant 1 h à température ambiante avec une chèvre de l’anticorps secondaire Conjugué IgG-HRP anti-souris dilué 01:10, 000.</li>
	<li>Développer des membranes en utilisant 1 mL de réactif fluorescent Luminata et quantifier des bandes par densitométrie, comme indiqué au point 5.2.</li>
</ol>5. analyse
<ol><li>Pour analyser les données obtenues par FC, créer une table affichant la moyenne intensité de fluorescence (IFM) et la fluorescence médian avec son écart-type correspondant et/ou le coefficient de variation (CV) pour fluorescence GFP et les niveaux de stress oxydatif.<ol>
<li>Cliquez sur l’onglet de l’inspecteur et l’icône de statistiques pour personnaliser les données statistiques qui sont requises pour chaque canal. Remarque : Lorsque l'on compare les variants protéiques, convertir les données de valeurs de fluorescence un fond pliable ou la résolution métriques (RD) : <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/57470/57470eq1.jpg"> Dans cette mesure, l’échantillon moyen est la fluorescence moyenne des échantillons de problème, le contrôle de la moyens est la moyenne fluorescence des cellules utilisé comme témoin et le SD est l’écart type de la fluorescence de moyenne. Facteur de RD est un indice plus précis que le valeur MFI il calcule non seulement la différence entre les échantillons, mais aussi comptes visant la diffusion des données. Ce calcul est particulièrement pertinent lorsqu’en comparant les données provenant des différentes expériences effectuées au fil du temps. Une fois que les RDs ont été calculées, l’utilisation d’un test statistique est conseillée de confirmer l’importance des différences observées entre les variantes de la protéine.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Pour les protéines immunodétection, quantifier les niveaux de la protéine recombinante par Western blot à l’aide de logiciels ImageJ.<ol>
<li>Avant l’analyse de la densitométrie, convertir les images raw originales de la membrane développée en fichier format et niveaux de gris en mode JPEG.</li>
		<li>Ajuster la section Mesures de la valeur du menu Analyze pour Signifier la valeur de gris.</li>
		<li>Cliquez sur l’outil Rectangle de ImageJ et définir une région d’intérêt (ROI) avec une taille uniforme pour l’analyse de la densitométrie de bande. Centre de chaque bande sur l’image de la membrane à l’intérieur de l’encadrement rectangulaire créée et enregistrer la mesure un par un en utilisant Ctrl + M (la commande de mesure).</li>
		<li>Mesurer le contexte local adjacent à chaque bande, en appliquant la même zone ROI. Après la mesure, soustraire le fond correspondant local de chaque bande.</li>
	</ol>
</li>
</ol>

<ol><li>Frydman, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Folding+of+newly+translated+proteins+in+vivo%3A+the+role+of+molecular+chaperones%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Folding of newly translated proteins in vivo: the role of molecular chaperones.</a> Annual Review of Biochemistry. 70, 603-647 (2001).</li>
<li>Hartl, F. U., Bracher, A., Hayer-Hartl, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+chaperones+in+protein+folding+and+proteostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Molecular chaperones in protein folding and proteostasis.</a> Nature. 475, 324-332 (2011).</li>
<li>Wong, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+determinants+of+selective+clearance+of+protein+inclusions+by+autophagy%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Molecular determinants of selective clearance of protein inclusions by autophagy.</a> Nature Communications. 3, (2012).</li>
<li>Winkler, J., Tyedmers, J., Bukau, B., Mogk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chaperone+networks+in+protein+disaggregation+and+prion+propagation%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Structural+Biology%22%5BJournal%5D)">Chaperone networks in protein disaggregation and prion propagation.</a> Journal of Structural Biology. 179, 152-160 (2012).</li>
<li>Glickman, M. H., Ciechanover, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ubiquitin-proteasome+proteolytic+pathway%3A+destruction+for+the+sake+of+construction%5BTitle%5D)+AND+%22Physiological+Reviews%22%5BJournal%5D)">The ubiquitin-proteasome proteolytic pathway: destruction for the sake of construction.</a> Physiological Reviews. 82, 373-428 (2002).</li>
<li>Dobson, C. M. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/12181546">Getting out of shape.</a> Nature. 418, 729-730 (2002).</li>
<li>Chiti, F., Dobson, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+misfolding%2C+functional+amyloid%2C+and+human+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Annual+Review+of+Biochemistry%22%5BJournal%5D)">Protein misfolding, functional amyloid, and human disease.</a> Annual Review of Biochemistry. 75, 333-366 (2006).</li>
<li>Aguzzi, A., O'Connor, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+diseases%3A+pathogenicity+and+therapeutic+perspectives%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Drug+Discovery%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation diseases: pathogenicity and therapeutic perspectives.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 9, 237-248 (2010).</li>
<li>Rapezzi, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transthyretin-related+amyloidoses+and+the+heart%3A+a+clinical+overview%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Cardiology%22%5BJournal%5D)">Transthyretin-related amyloidoses and the heart: a clinical overview.</a> Nature Reviews Cardiology. 7, 398-408 (2010).</li>
<li>Deas, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+oligomers+interact+with+metal+ions+to+induce+oxidative+stress+and+neuronal+death+in+Parkinson%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Antioxidants+%26+Redox+Signaling%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein oligomers interact with metal ions to induce oxidative stress and neuronal death in Parkinson's disease.</a> Antioxidants & Redox Signaling. 24, 376-391 (2016).</li>
<li>Brundin, P., Melki, R., Kopito, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+transmission+of+protein+aggregates+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Prion-like transmission of protein aggregates in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 11, 301-307 (2010).</li>
<li>Frost, B., Diamond, M. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prion-like+mechanisms+in+neurodegenerative+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Prion-like mechanisms in neurodegenerative diseases.</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 155-159 (2009).</li>
<li>Arrasate, M., Mitra, S., Schweitzer, E. S., Segal, M. R., Finkbeiner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inclusion+body+formation+reduces+levels+of+mutant+huntingtin+and+the+risk+of+neuronal+death%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Inclusion body formation reduces levels of mutant huntingtin and the risk of neuronal death.</a> Nature. 431, 805-810 (2004).</li>
<li>Ross, C. A., Poirier, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Opinion%3A+what+is+the+role+of+protein+aggregation+in+neurodegeneration%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Opinion: what is the role of protein aggregation in neurodegeneration?</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 6, 891-898 (2005).</li>
<li>Mishra, R., Sjölander, D., Hammarström, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spectroscopic+characterization+of+diverse+amyloid+fibrils+in+vitro+by+the+fluorescent+dye+Nile+red%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Spectroscopic characterization of diverse amyloid fibrils in vitro by the fluorescent dye Nile red.</a> Molecular BioSystems. 7, 1232-1240 (2011).</li>
<li>Klunk, W. E., Jacob, R. F., Mason, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+amyloid+by+congo+red+spectral+shift+assay%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+in+Enzymology%22%5BJournal%5D)">Quantifying amyloid by congo red spectral shift assay.</a> Methods in Enzymology. 309, 285-305 (1999).</li>
<li>Khurana, V., Lindquist, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+neurodegeneration+in+Saccharomyces+cerevisiae%3A+why+cook+with+baker%27s+yeast%3F%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">Modelling neurodegeneration in Saccharomyces cerevisiae: why cook with baker's yeast?</a> Nature Reviews Neuroscience. 11, 436-449 (2010).</li>
<li>Tenreiro, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simple+is+good%3A+yeast+models+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22FEMS+Yeast+Research%22%5BJournal%5D)">Simple is good: yeast models of neurodegeneration.</a> FEMS Yeast Research. 10, 970-979 (2010).</li>
<li>Moosavi, B., Mousavi, B., Macreadie, I. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+model+of+amyloid-%CE%B2+and+Tau+aggregation+in+Alzheimer%27s+disease%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Alzheimer%27s+Disease%22%5BJournal%5D)">Yeast model of amyloid-β and Tau aggregation in Alzheimer's disease.</a> Journal of Alzheimer's Disease. 47, 9-16 (2015).</li>
<li>Tenreiro, S., Munder, M. C., Alberti, S., Outeiro, T. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Harnessing+the+power+of+yeast+to+unravel+the+molecular+basis+of+neurodegeneration%5BTitle%5D)+AND+%22Journal+of+Neurochemistry%22%5BJournal%5D)">Harnessing the power of yeast to unravel the molecular basis of neurodegeneration.</a> Journal of Neurochemistry. 127, 438-452 (2013).</li>
<li>Yang, J., Hao, X., Cao, X., Liu, B., Nyström, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spatial+sequestration+and+detoxification+of+huntingtin+by+the+ribosome+quality+control+complex%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Spatial sequestration and detoxification of huntingtin by the ribosome quality control complex.</a> eLife. 5, (2016).</li>
<li>Braun, R. J., Büttner, S., Ring, J., Kroemer, G., Madeo, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nervous+yeast%3A+modeling+neurotoxic+cell+death%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+in+Biochemical+Sciences%22%5BJournal%5D)">Nervous yeast: modeling neurotoxic cell death.</a> Trends in Biochemical Sciences. 35, 135-144 (2010).</li>
<li>Figley, M. D., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Yeast+genetic+screen+reveals+novel+therapeutic+strategy+for+ALS%5BTitle%5D)+AND+%22Rare+Diseases%22%5BJournal%5D)">Yeast genetic screen reveals novel therapeutic strategy for ALS.</a> Rare Diseases. 1, e24420(2013).</li>
<li>Cooper, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alpha-synuclein+blocks+ER-Golgi+traffic+and+Rab1+rescues+neuron+loss+in+Parkinson%27s+models%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Alpha-synuclein blocks ER-Golgi traffic and Rab1 rescues neuron loss in Parkinson's models.</a> Science. 313, 324-328 (2006).</li>
<li>Johnson, B. S., McCaffery, J. M., Lindquist, S., Gitler, A. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+yeast+TDP-43+proteinopathy+model%3A+exploring+the+molecular+determinants+of+TDP-43+aggregation+and+cellular+toxicity%5BTitle%5D)+AND+%22Proceedings+of+the+National+Academy+of+Sciences+of+the+United+States+of+America%22%5BJournal%5D)">A yeast TDP-43 proteinopathy model: exploring the molecular determinants of TDP-43 aggregation and cellular toxicity.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 105, 6439-6444 (2008).</li>
<li>Bharathi, V., et al. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/27654890">Use of ade1 and ade2 mutations for development of a versatile red/white color assay of amyloid-induced oxidative stress in saccharomyces cerevisiae.</a> Yeast. 33, 607-620 (2016).</li>
<li>Pallarès, I., Ventura, S. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/28685682">Advances in the prediction of protein aggregation propensity.</a> Current Medicinal Chemistry. , (2017).</li>
<li>Villar-Piqué, A., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+propensity+is+a+crucial+determinant+of+intracellular+inclusion+formation+and+quality+control+degradation%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation propensity is a crucial determinant of intracellular inclusion formation and quality control degradation.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1833, 2714-2724 (2013).</li>
<li>Navarro, S., Villar-Piqué, A., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Selection+against+toxic+aggregation-prone+protein+sequences+in+bacteria%5BTitle%5D)+AND+%22Biochimica+et+Biophysica+Acta%22%5BJournal%5D)">Selection against toxic aggregation-prone protein sequences in bacteria.</a> Biochimica et Biophysica Acta. 1843, 866-874 (2014).</li>
<li>Morell, M., de Groot, N. S., Vendrell, J., Avilés, F. X., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linking+amyloid+protein+aggregation+and+yeast+survival%5BTitle%5D)+AND+%22Molecular+BioSystems%22%5BJournal%5D)">Linking amyloid protein aggregation and yeast survival.</a> Molecular BioSystems. 7, 1121-1128 (2011).</li>
<li>Conchillo-Solé, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((AGGRESCAN%3A+a+server+for+the+prediction+and+evaluation+of+%26%2334%3Bhot+spots%26%2334%3B+of+aggregation+in+polypeptides%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">AGGRESCAN: a server for the prediction and evaluation of &#34;hot spots&#34; of aggregation in polypeptides.</a> BMC Bioinformatics. 8, 65(2007).</li>
<li>Fernandez-Escamilla, A. M., Rousseau, F., Schymkowitz, J., Serrano, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Prediction+of+sequence-dependent+and+mutational+effects+on+the+aggregation+of+peptides+and+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Biotechnology%22%5BJournal%5D)">Prediction of sequence-dependent and mutational effects on the aggregation of peptides and proteins.</a> Nature Biotechnology. 22, 1302-1306 (2004).</li>
<li>Renner, M., Melki, R. <a target="_blank" href="https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24698014">Protein aggregation and prionopathies.</a> Pathologie Biologie.(Paris). 62, 162-168 (2014).</li>
<li>Carija, A., Navarro, S., de Groot, N. S., Ventura, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+aggregation+into+insoluble+deposits+protects+from+oxidative+stress%5BTitle%5D)+AND+%22Redox+Biology%22%5BJournal%5D)">Protein aggregation into insoluble deposits protects from oxidative stress.</a> Redox Biology. 12, 699-711 (2017).</li>
</ol>

Un large éventail de maladies est lié à l’accumulation de protéines mal repliées en dépôts cellulaire6,7,8,33. De nombreux efforts ont été faits à élucider les mécanismes moléculaires qui déclenchent l’apparition de ces maladies en utilisant des approches informatiques, qui ne tiennent pas les concentrations de protéine compte, ou in vitro s’approche, où la concentration de protéine re...

Protéostasie est un déterminant fondamental du processus de remise en forme et le vieillissement cellulaire. Dans les cellules, homéostasie des protéines est maintenue par contrôle de la qualité sophistiqué protéine réseaux ayant pour but d’assurer le repliement correct des conformères les protéines mal repliées par chaperons et/ou leur protéolyse ciblée avec des mécanismes bien conservés plusieurs1 ,2,3,4,5. Un grand nombre d’études soutiennent le lien entre le déclenchement et la progression d’un large éventail de maladies humaines et l’échec de protéostasie, conduisant à un mauvais repliement des protéines et de l’agrégation. Par exemple, la présence de dépôts protéiques est considéré comme une caractéristique pathologique des nombreuses maladies neurodégénératives, comme Alzheimer, Parkinson, Huntington maladies6,7,8, prionogenic maladies et non-dégénératives amyloses9. Il a été suggéré que premières assemblées oligomères et protofibrillar dans la réaction d’agrégation sont les éliciteurs principales de cytotoxicité, établissant des interactions avec d’autres protéines aberrantes dans le milieu cellulaire bondé10. En outre, des inclusions protéiques (PI) peuvent être transmises entre les cellules, se propageant leur effet toxique11,12. Par conséquent, il est possible que la formation de PI pourrait en effet constituer un mécanisme de détoxification qui limite la présence d’espèces agrégées dangereux vers des emplacements spécifiques dans la cellule, où ils peuvent être transformés ou accumulés sans effets secondaires majeurs 13 , 14.
Norme in vitro des approches biochimiques ont fourni des renseignements importants sur les différentes espèces qui peuplent les réactions de l’agrégation et leurs propriétés15,16. Toutefois, les conditions utilisées dans ces essais sont clairement différentes de ceux qui se produisent au sein de la cellule et, par conséquent, la question leur pertinence physiologique. En raison de la conservation remarquable des voies cellulaires tels que le contrôle de la qualité protéique, autophagie ou le règlement de l’oxydo-réduction cellulaire état17,18 chez les eucaryotes19,20,21 ,22,23, la levure Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) s’est imposé comme un modèle cellulaire simple privilégié pour étudier les déterminants moléculaires de l’agrégation des protéines et son impact cytotoxique associé dans des environnements biologiquement pertinente24,25,26.
Propension de l’agrégation de protéines est une fonctionnalité intrinsèquement encodée dans la séquence primaire. Ainsi, la formation de structures de type amyloïde peut être prédite basée sur l’identification et l’évaluation de l’activité de promotion à l’agrégation de polypeptides27régions. Cependant, malgré le succès des algorithmes bioinformatiques pour prévoir les propriétés de l’agrégation in vitro de séquences protéiques, elles sont loin de prévoir comment ces penchants se traduiront in vivo des effets cytotoxiques. Les études qui portent sur le lien entre l’état agrégé d’une protéine donnée et ses dommages cellulaires associées de manière systématique peuvent aider à contourner cette limitation computationnelle. Ce sujet est abordé dans la présente étude, en profitant d’un grand nombre de variantes du peptide amyloïde-β Aβ42 ne différant que par un seul résidu, mais affichant une gamme continue de propensions de l’agrégation en vivo28. En particulier, une approche axée sur les FC pour déterminer l’espèce conformationnelle représentent les dommages oxydatifs induits par agrégation sujettes aux protéines dans les cellules de levure est décrite. La méthodologie fournit de nombreux avantages comme la simplicité, la capacité de haut débit et une mesure quantitative précise. Cette approche a permis de confirmer que le jeu PI un rôle protecteur contre le stress oxydatif.

<table><tbody><tr><td>Cellules de levure BY4741&nbsp ;</td><td>ATCC</td><td>201388</td><td>Génotype : MATa his3&Delta ; 1 leu2 et Delta ; 0 met15 et Delta ; 0 ura3 et Delta ; 0</td></tr><tr><td>plasmide pESC(-Ura)&nbsp ;</td><td>Agilent Genomics</td><td>217454</td><td>plasmide d’expression de levure avec un promoteur Gal. Marqueur sélectionnable URA3</td></tr><tr><td>Levure synthétique Drop-out Medium Suppléments</td><td>Sigma</td><td>Y1501</td><td>Levure en poudre</td></tr> Base <tr><td>azotée sans acides aminés</td><td>Sigma</td><td>Y0626</td><td>Poudre</td></tr><tr><td>Raffinose</td><td>Sigma</td><td>R7630</td><td></td></tr><tr><td>Poudre Glucose</td><td>Sigma</td><td>G7021</td><td>Poudre</td></tr><tr><td>Galactose</td><td>Sigma</td><td>G0750</td><td></td></tr><tr><td>Phosphate en poudre Saline tamponnée (PBS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP3991&nbsp ;</td><td>La solution 10X</td></tr><tr><td>Réactif CellROX Deep Red&nbsp ;</td><td>Life Technologies</td><td>C10422</td><td>Capteur fluorescent à cellules perméables à radicaux libres, non fluorescent lorsqu’il est à l’état réduit, et présentant une fluorescence brillante lors de l’oxydation par des espèces réactives de l’oxygène (ROS), avec des maxima d’absorption/émission à 644/665 nm.</td></tr><tr><td>réactif d’extraction de protéines Y-PER&nbsp ;</td><td>Thermo Scientific</td><td>78990</td><td>Tampon de lyse cellulaire liquide</td></tr><tr><td>Acrylamide/Bis-acrylamide</td><td>Sigma</td><td>A6050</td><td></td></tr><tr><td>Solution Réactif de colorant Bradford</td><td>Bio-Rad&nbsp ;</td><td>5000205</td><td>Réactif colorant pour la détermination en une étape de la concentration protéique</td></tr><tr><td>&bêta ;-amyloïde 6E10&nbsp ;</td><td>BioLegend</td><td>803001</td><td>souris IgG1. L’épitope se trouve dans les acides aminés 3-8 de la bêta-amyloïde (EFRHDS).</td></tr><tr><td>Conjugué IgG-HRP anti-souris de chèvre&nbsp ;</td><td>Membrane Bio-Rad</td><td>1721011</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon-P, PVDF</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Luminata forte</td><td>Merk</td><td>WBLUF0100</td><td>Réactif de détection HRP chimiluminescent prémélangé, prêt à l’emploi</td></tr><tr><td>Solution de fluorure de phénylméthanesulfonyle (PMSF)</td><td>Sigma</td><td>93482</td><td>Inhibiteur de protéase. Dissous à 0,1 M dans le</td></tr><tr><td>cytomètre en flux FACSCanto à l’éthanol&nbsp ;</td><td>BD Biosciences</td><td>657338</td><td>Équipé d’un 488&nbsp ; nm laser bleu pour la détection de la GFP, et 635&nbsp ; Laser rouge nm / filtre BP 530/30 nm et filtre BP 660/20</td></tr><tr><td>Cellule de transfert d’électrophorèse Mini Trans-Blot</td> Système de transfert de protéines <td>Bio-Rad</td><td>1703930</td><td>Système de transfert de protéines</td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Handcast Systems</td><td>Bio-Rad</td><td>1658000FC</td><td>Système d’électrophorèse</td></tr></tbody></table>

Évaluation de l’impact de l’agrégation de protéines sur le stress oxydatif cellulaire chez la levure

Evaluation of the Impact of Protein Aggregation on Cellular Oxidative Stress in Yeast

Repliement et agrégation en conformations amyloïdes ont été associés à l’apparition et la progression de maladies neurodégénératives. Cependant, il y a encore peu d’informations sur les protéines insolubles comment agrégats exercent leurs effets toxiques in vivo. Les organismes de modèle simple de procaryotes et eucaryotes, comme les bactéries et les levures, ont largement contribué à notre compréhension actuelle des mécanismes à l’origine de la formation d’amyloïde intracellulaire, propagation des agrégats et la toxicité. Dans ce protocole, l’utilisation de levure est décrit comme un modèle à disséquer la relation entre la formation d’agrégats de protéines et de leur impact sur le stress oxydatif cellulaire. La méthode associe la détection de l’État soluble/agrégés intracellulaire d’une protéine amyloïdogène la quantification du dommage oxydatif cellulaire résultant de son expression à l’aide de cytométrie en flux (FC). Cette approche est simple, rapide et quantitative. L’étude illustre la technique en mettant en corrélation le stress oxydatif cellulaire provoqué par un grand nombre de variantes de peptide amyloïde-β avec leurs propensions agrégation intrinsèque respectifs.

Ce protocole décrit comment employer une collection de 20 variantes du peptide Aβ42 où Phe19 a été muté à tous les protéinogéniques naturels acides aminés28. Les propensions théorique de l’agrégation de ces protéines peuvent être analysées en utilisant deux algorithmes de bioinformatic différentes (AGGRESCAN et TANGO31,32). Dans les deux cas, cette analyse rend une gradation progressive des tendances de l’a...

Agrégation de la protéine provoque un stress oxydatif cellulaire. Ce protocole décrit une méthode pour surveiller les États intracellulaires des protéines amyloïdogène et le stress oxydatif qui leur sont associés, à l’aide de cytométrie en flux. L’approche est utilisée pour étudier le comportement des variantes solubles et sujette à l’agrégation du peptide amyloïde-β.

Évaluation de l’Impact de l’agrégation de protéines sur le Stress oxydatif cellulaire chez la levure

Protein misfolding and aggregation into amyloid conformations have been related to the onset and progression of several neurodegenerative diseases. ...

L’objectif global de cette procédure est de déterminer la relation entre la formation d’agrégats de protéines intracellulaires et leur impact sur le stress oxydatif cellulaire à l’aide de la levure de boulangerie Saccharomyces cerevisiae. Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés dans le domaine des maladies de mauvais repliement et d’agrégation des protéines, telles que les troubles neurodégénératifs et les amyloïdoses non neuropathiques. Le principal avantage de cette technique est qu’elle est simple, rapide et qu’elle permet de quantifier les dommages causés par le stress oxydatif cellulaire dans une grande population de levures.Avec cette méthode, nous pouvons donner un aperçu de la corrélation entre l’état soluble ou agrégé intracellulaire d’une protéine amyloïdogène et les niveaux de stress oxydatif chez la levure. De plus, il peut également être appliqué à d’autres organismes modèles exprimant des protéines recombinantes. Manuela Costa, technicienne de l’installation de cytométrie en flux de l’UAB, fera la démonstration de l’analyse par cytométrie en flux.Dans cette étude, l’état d’agrégation intracellulaire de différents variants du peptide A-bêta-42 est suiv

evaluation-impact-protein-aggregation-on-cellular-oxidative-stress

Research

Recherche

JoVE Journal

Biochemistry

Biochimie

Dans ce protocole d'expression génique, chez la levure...

Analyse de Microarray pour Saccharomyces cerevisiae</em

Ce manuscrit décrit trois protocoles complémentaires pour évaluer la toxicité de polyglutamine (polyQ)-extension protéines dans la...

Les analyses de croissance pour évaluer la toxicité de polyglutamine dans la levure

La viabilité cellulaire dépend de la prise en charge rapide et efficace des mauvais repliement des protéines. Nous décrivons ici une méthode pour visualiser les différents destins possibles d'une protéine mal repliée: repliement, la dégradation ou la séquestration dans les inclusions. Nous démontrons l'utilisation d'un capteur de pliage,...

4D imagerie de l&#39;agrégation des protéines dans les cellules vivantes

Cet article décrit l'utilisation d'une protéine de fusion GFP-luciférase Firefly pour...

Les analyses couplées pour la surveillance protéines repliement<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

Cet article décrit un test basé sur la croissance de levure pour la détermination des exigences génétiques pour la dégradation des protéines. Il fait également la démonstration d’une méthode d’extraction rapide des protéines de levure, adaptée au western blot pour confirmer biochimiquement les exigences de dégradation. Ces techniques peuvent être adaptées pour surveiller la dégradation d’une variété de protéines.

Détermination basée sur la croissance et la confirmation biochimique des exigences génétiques pour la dégradation des protéines dans<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

L’abondance des protéines reflète les taux de synthèse et de dégradation des protéines. Cet article décrit l’utilisation de la chasse au cycloheximide suivie d’un western blot pour analyser la dégradation des protéines chez l’eucaryote unicellulaire modèle, Saccharomyces cerevisiae (levure bourgeonnante).

L&#39;analyse de cycloheximide Chase dans la dégradation des protéines<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em

L’objectif de la méthode présentée ici est d’explorer l’agrégation des protéines au cours du vieillissement normal dans l’organisme modèle c. elegans. Le protocole représente un outil puissant pour étudier les grands agrégats fortement insolubles qui se forment avec l’âge et de déterminer comment la modification des protéostasie sur l’agrégation protéique.

Méthodes d’étude des changements dans l’agrégation des protéines inhérente avec l’âge chez Caenorhabditis elegans

Une des conditions de stress plus difficiles que les organismes se rencontrent au cours de leur vie implique l’accumulation d’oxydants. Au cours du stress oxydatif, cellules s’appuient fortement sur chaperons moléculaires. Nous présentons ici les méthodes utilisées pour enquêter sur l’oxydo-réduction-anti-agrégation activité réglementée, aussi bien quant à surveiller les changements structurels régissant la fonction d’accompagnateur à l’aide de HDX-MS.

Définition d’activité réglementée Redox chaperon de Hsp33 et de cartographie des changements conformationnels sur Hsp33 à l’aide de la spectrométrie de masse d’hydrogène deutérium Exchange

Ce protocole décrit l’extraction et la visualisation de protéines agrégées et solubles d’Escherichia coli après traitement avec un antimicrobien protéotoxique. Suivre cette procédure permet une comparaison qualitative de la formation d’agrégats protéiques in vivo dans différentes souches bactériennes et/ou entre les traitements.

Extraction et visualisation d’agrégats protéiques après traitement d’Escherichia coli avec un facteur de stress protéotoxique

Un modèle physiologique in vivo de la α-synucléine est nécessaire pour étudier et comprendre la pathogenèse de la maladie de Parkinson. Nous décrivons une méthode pour surveiller la cytotoxicité et la formation agrégée de α-synucléine à l’aide d’un modèle de levure humanisé.

Méthode pour étudier la toxicité et l’agrégation de la α-synucléine à l’aide d’un modèle de levure humanisée

Découvrez une méthode de cytométrie en flux pour évaluer le stress oxydatif induit par l'agrégation de protéines amyloïdes chez Saccharomyces cerevisiae. Cette technique simple permet de quantifier les dommages cellulaires dans de grandes populations.

Évaluation de l’Impact de l’agrégation de protéines sur le Stress oxydatif cellulaire chez la levure

Explorer plus de vidéos