Name: In Vitro Reconstitution d’auto-organisationnelle profils protéiques sur bicouches lipidiques pris en charge (Vidéo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-07-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 8 min 10 s
Description: Découvrez l'auto-organisation des protéines MinD et MinE sur des bicouches lipidiques dans des microcompartiments PDMS. Cette méthode permet de contrôler précisément la formation de motifs protéiques et d'étudier la dynamique membranaire.

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Nous remercions Michael Heymann et Frank Siedler pour la production de silicium gaufrettes, Core Facility MPI-B pour l’assistance dans la purification de la protéine et Simon Kretschmer et Leon Harrington pour commentaires sur le manuscrit.

<ol><li>Soh, S., Byrska, M., Kandere-Grzybowska, K., Grzybowski, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reaction-diffusion+systems+in+intracellular+molecular+transport+and+control%5BTitle%5D)+AND+%22Angew+Chemie+Int+Ed%22%5BJournal%5D)">Reaction-diffusion systems in intracellular molecular transport and control.</a> Angew Chemie Int Ed. 49 (25), 4170-4198 (2010).</li>
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<li>Mileykovskaya, E., Fishov, I., Fu, X., Corbin, B. D., Margolin, W., Dowhan, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+phospholipid+composition+on+MinD-membrane+interactions+in+vitro+and+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Effects of phospholipid composition on MinD-membrane interactions in vitro and in vivo.</a> J Biol Chem. 278 (25), 22193-22198 (2003).</li>
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</ol>

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Nous avons décrit un protocole pour la reconstitution in vitro de l’auto-organisation MinCDE sur planaire étayée des bicouches lipidiques et en lipides bicouche couvert de structures 3D, en utilisant l’exemple des microstructures PDMS en forme de bâtonnet. Afin d’obtenir des données précieuses de ces essais, les facteurs les plus importants de contrôle sont qualité de protéine et de la membrane.
Pour assurer la qualité des protéines, protéines masse doit être confirmée par SDS-PAGE et spectrométrie de masse. En outre, il convient de vérifier que les protéines sont solubles et non agrégées, en utilisant la filtration sur gel analytique ou diffusion dynamique de la lumière. Filtration sur gel peut être utilisée pour supprimer toute fraction agrégée des protéines. Ajustement du pH attention et la qualité des nucléotides supplémentaires est critique, comme l’addition de nucléotides non ajustées ou partiellement dégradés à la protéine stocks ou self-organizing dosages est suffisant pour éliminer l’activité de la protéine, donc abolir self-organization.
En regard de la qualité des protéines, qualité de la membrane est plus critique, et formation inadéquate de membrane est le plus souvent la cause de l’auto-organisation défectueuse et l’origine des structures de surface artéfactuelles.
Lors de l’exécution du protocole pour la première fois, il est utile de numéroter les bicouches lipidiques pris en charge en incluant des lipides marqués comme Atto-655-DOPE ou DiI à faibles pourcentages molaires (0,05 %). Ainsi les propriétés et la qualité de la membrane peuvent être jugées directement. À l’aide de FRAP, la fluidité de la membrane peut être évaluée. En outre, on peut évaluer directement la qualité du lavage de la SLB, car il y aura soit être trop de vésicules, aucune membrane liquide ou aucune membrane du tout, si il a été lavé. L’approche de la chambre ouverte permet de laver rigoureusement la membrane et donc aussi pour enlever les vésicules qui sont en tiennent à la surface de la SLB. Les facteurs cruciaux pour l’obtention de fluide et homogène de prise en charge lipidique bicouches sont le nettoyage et la hydrophilicité de la surface d’appui et de la bonne taille et l’homogénéité de la SUvs , il peut être utile vérifier la taille SUV et taille à l’aide de la distribution diffusion dynamique de la lumière. Pour les distributions de taille étroite, nous recommandons les vésicules d’extrusion, plutôt que de sonification eux. Autres méthodes de nettoyage lamelles couvre-objet, par exemple, les traitements avec des bases fortes, détergents de base ou à l’aide de lamelles directement après le rinçage avec de l’eau, peuvent donner de bons résultats, selon le mélange d’application et de lipides.
La première moitié du protocole présenté ici, reconstitution de in vitro sur des bicouches lipidiques planes de prises en charge dans des chambres ouvertes, a l’avantage de rendre la surface accessible pour la microscopie optique, tels que TIRF microscopie30, PAF analyse6, particule suivi34, ainsi que des techniques de sonde de surface telles que la microscopie de force atomique26. La grande surface homogène permettant de meilleures statistiques à des concentrations déterminées. En outre, l’approche de chambre ouverte permet de contrôler précisément la concentration de protéines et un ajout rapid et simple des autres composants, donc permettant d’ajuster la concentration de protéines dans une seule chambre20. Le test peut aussi être étendu par l’addition d’autres composants de divisome bactérien FtsZ22,35, ZipA22 ou la protéine chimère FtsZ-YFP-MTS10,35.
Autres groupes ont adopté une approche similaire pour reconstituer le Min système in vitro, mais d’utiliser une cellule de flux au lieu d’une chambre ouverte17,18,19. Flux-cellules ont certains avantages, en particulier lorsqu’un environnement 3D entièrement clos est nécessaire18, l’influence du débit de19,17,23 ou membrane composition23 sur les habitudes de MinCDE objet d’une enquête, ou si les profils protéiques doivent être observées sous protéines limitant les conditions19. Néanmoins, le contrôle local des concentrations moléculaires est plus difficile. Composants de protéines, en particulier l’esprit, est fortement lient à la membrane qu’ils rencontrent d’abord18,19. Dans notre expérience, les protéines présentent souvent non-spécifiques à tubes, de criques, de seringues et d’autres parties de la microfluidique. Par conséquent, des concentrations de protéines locales diffèrent des concentrations d’entrée18 et également varient sur la longueur de la cellule d’écoulement, résultant en une variété de modèles de différentes protéines sur la membrane entre entrée et sortie, tel qu’observé par d’autres19.
La seconde moitié du protocole présenté ici, la reconstitution in vitro en microstructures en forme de bâtonnet, ré-utilisation de l’approche de la chambre ouverte sur un support à motifs couvert par les lipides bicouches permet un simple imitateur de comportement de protéine en vivo même si un contrôle précis sur les concentrations de protéine est perdu en raison de la suppression de la mémoire tampon. Notez que parce que la longueur d’onde de MinDE est environ un ordre de grandeur plus grande in vitro que in vivo les microcompartments en forme de tige sont également environ un ordre de grandeur plus grande (10 x 30 µm) qu’un bâtonnet d’e. coli cellulaire.
Dans l’ensemble, ce protocole permet un contrôle précis de toutes les conditions, y compris la concentration protéique, la composition du tampon et propriétés de la membrane. L’utilisation de supports structurés 3D permet la réaction d’être étudié sous confinement spatial, imitant en vivo comportement sans le besoin d’équipement complexe microfluidique.

Les patrons spatio-temporels sont essentielles dans la nature, régulation des tâches complexes tant au niveau cellulaire et multicellulaires, de morphogenèse réglementé la division cellulaire1,2. Les systèmes de réaction-diffusion jouent un rôle important dans l’établissement de ces modèles, mais ne sont pas encore bien compris. Un excellent exemple d’un système de réaction-diffusion et le meilleur système biologique caractérisé jusqu'à présent est l’Escherichia coli MinCDE système3,4,5,6,7. Le système MinCDE oscille du pôle de la cellule au pôle de la cellule chez e. coli pour déterminer le milieu de la cellule comme le site de la future division. Ce système repose sur l’esprit de l’ATPase, l’ATPase activation protéine MinE et la membrane comme une réaction spatiale matrice8. MinC ne fait pas partie du mécanisme de formation patron, mais est l’agent fonctionnel réel : un inhibiteur de la divisome principale protéine FtsZ5,6. MinC se lie à l’esprit et donc suit les oscillations, ce qui entraîne un gradient de concentration de protéine moyenne temporelle maximale aux pôles de la cellule et un minimum au milieu cellulaire, permettant seulement FtsZ polymériser à midcell9,10 . Le système de MinCDE fait partie de la grande famille des Walker A ATPases qui sont essentiels à l’organisation spatio-temporelle dans2de bactéries, de positionnement et de transport de protéines complexes plasmides de11 et12 et de régulation cellulaire Division13 et chromosome ségrégation14. Par conséquent, le système de réaction-diffusion MinCDE non seulement représente un système de réaction-diffusion archétypal, mais a aussi attiré l’attention en raison de sa pertinence pour l’organisation spatio-temporelle dans les bactéries.
Des études fonctionnelles détaillées du MinCDE system in vivo sont compliquées, comme la manipulation de la suppression de protéines et de gènes généralement entraîner des défauts de la division cellulaire. En outre, modifier la composition de la membrane ou les propriétés du cytosol in vivo est très difficile de15,16. Les changements au système et facteurs d’influence sont difficiles à interpréter dans l’environnement complexe de la cellule, plus encore si elle est perturbée dans une fonction essentielle en tant que la division cellulaire. Nous et autres avons donc tournée vers une démarche de reconstitution in vitro , de réduire le système à ses composantes de base : esprit, MinE, ATP comme source d’énergie et la prise en charge lipidique comme une réaction matrice6,17, 18. cette approche bottom-up permet de sonder le mécanisme de l’auto-organisation en détail sans la complexité d’une cellule vivante. La forme de protéines voyageant surface ondes6 et autres types de modèles17,19 dans ces conditions, quoique avec une longueur d’onde, qui est généralement une magnitude supérieure à in vivo. L’utilisation d’une chambre ouverte facilite un contrôle précis sur tous les aspects qui influent sur la formation du patron : les concentrations de protéine6, protéines propriétés20, membrane composition10, composition du tampon et concentration d’ATP 6, ainsi que l’ajout d’autres facteurs tels que le surpeuplement des agents21 et autres protéines de divisome22. En comparaison, la reconstitution in vitro du système MinCDE dans une cellule d’écoulement18,19,23 peut être utilisée pour sonder l’influence du débit17,23, protéine limiter les conditions19, membrane composition19 et entièrement en 3D accouchement18 sur les profils protéiques, mais restitue un contrôle exact de la concentration de protéine/composant et ajout de composant séquentielle beaucoup plus compliqué.
Utilisant cette chambre ouverte, nous inspire également le soutien des bicouches lipidiques planes par lequel on peut sonder comment géométriques limites influence modèle formation21, un phénomène qui a récemment été étudiée in vivo à l’aide de bactéries moulé en microstructures7. Nous avons également utilisé ce dosage pour étudier comment définis des mutations dans le mien affect formation du patron du système20. Par ailleurs, le même format de base de test a été employé pour étudier comment formation du patron peut être contrôlée par la lumière, introduction d’un peptide de MinE azobenzène-réticulé dans le dosage et d’imagerie avec TIRF microscopie24.
Nous avons constaté que, afin de reproduire le modèle MinDE formation observée in vivo dans un confinement de système, in vitro a été la clé. Utilisation de microcompartments en forme de bâtonnet, avec des dimensions ajustées à la longueur d’onde plus grande de MinDE in vitro (10 x 30 µm), doublé d’une bicouche lipidique pris en charge a permis la reconstitution des oscillations de pôle-à-l’autre MinDE et formation dégradé des protéines 10,,25. Dans cet essai, la prise en charge des bilayers de lipide sont déposés sur un substrat PDMS à motifs qui contient plusieurs centaines de répliques de microcompartments en forme de bâtonnet qui restent ouvertes sur le dessus. Par la présente, la réaction peut être mises en place dans une chambre ouverte, et par la suite la mémoire tampon est abaissé jusqu’au bord de la microcompartments, limitant ainsi la réaction d’un petit volume. Même si ces compartiments disposent d’une interface d’air-tampon sur un côté et par conséquent ne représentent pas un accouchement en 3D par membrane, la dynamique des protéines imité en vivo oscillations10,,25. Par rapport à l’accouchement entièrement en 3D, qui montre très proche des résultats18, l’essai de microstructures ouverts est relativement simple et facile à gérer et peuvent également être effectuées par des laboratoires qui ne sont pas dotés d’équipements spécialisés de la microfluidique et installations de salle blanche.
Nous présentons ici un protocole expérimental pour la reconstitution de MinCDE formation du patron sur prise en charge lipidique bicouches in vitro à l’aide d’une chambre ouverte qui permet le contrôle de tous les composants et un accès facile par microscopie optique et, avec la mineure modifications, est aussi adaptable pour des techniques de sonde de surface26. À côté des bicouches lipidiques planes de prises en charge, nous montrons aussi comment le confinement de la protéine peut être obtenue à l’aide des bicouches lipidiques pris en charge à motifs simples sur bâtonnet des microstructures PDMS. Ces tests, bien qu’optimisé pour le système de MinCDE, peuvent aussi être transférées à d’autres systèmes de protéines qui interagissent de façon similaire à la membrane, comme FtsZ27 ou un minime actine cortex28.

<table><tbody><tr><td><Réactifs >forts</fort></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>DOPC</td><td>Avanti Lipides polaires</td><td>850375</td><td></td></tr><tr><td>DOPG</td><td>Avanti Polar Lipids</td><td>840475</td><td></td></tr><tr><td>E.coli extrait de lipides</td><td>polaires Avanti Polar Lipids</td><td>100600</td><td></td></tr><tr><td>Adénosine 5&prime ;-triphosphate sel disodique trihydraté</td><td>Roche</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Adénosine 5&prime ;-diphosphate sel monopotassique dihydraté</td><td>Sigma</td><td>A5285-1G</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de sodium</td><td>VWR</td><td>27810.295</td><td></td></tr><tr><td>Chlorure de potassium</td><td>Roth</td><td>6781.1</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma Aldrich</td><td>T1503-1kg</td><td></td></tr><tr><td>Acide chlorhydrique</td><td>Roth</td><td>9277.1</td><td></td></tr><tr><td>TCEP-HCl</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>20491</td><td></td></tr><tr><td>Tétraacétate d’éthylène diamine</td><td>Merck Millipore</td><td>1.08418.1000</td><td></td></tr><tr><td>Acide sulfurique 98 %</td><td>Applichem</td><td>173163.1611</td><td></td></tr><tr><td>Peroxyde d’hydrogène 50 %</td><td>Applichem</td><td>147064.1211</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Biomol</td><td>05288.1</td><td></td></tr><tr><td>diméthylsulfoxyde (DMSO)</td><td>Merck</td><td>102950</td><td>Uvasol</td></tr><tr><td>Glycérol 86 %</td><td>Roth</td><td>4043.1</td><td></td></tr><tr><td>TB moyen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Isopropyle &beta ;-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Roth</td><td>2316.x</td><td></td></tr><tr><td>Atto-655-DOPE</td><td>Atto Tec</td><td>AD 655-161</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA</td><td>agarose Qiagen</td><td>30210</td><td></td></tr><tr><td>PDMS base</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td>SYLGARD 184</td></tr><tr><td>Réticulateur PDMS</td><td>Dow Corning Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Materials</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>UV Glue</td><td>Norland Products</td><td>6801</td><td>#68 et #63 fonctionnent tous les deux bien</td></tr><tr><td>Coverslips #1.5 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&auml ; ser</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Lamelles #1 24x24 mm</td><td>Menzel Gl&auml ; ser</td><td></td><td>utilisé uniquement pour les microstructures PDMS</td></tr><tr><td>Tube de réaction de 0,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>&nbsp ; </td><td></td>0030123301</tr><tr><td>flacon de culture 2L</td><td>Corning</td><td>, par exemple 734-1905</td><td></td></tr><tr><td>His-Trap HP</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Colonne de gelfiltration : HiLoad Superdex 75 PG ou 200 PG</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Econo-Pac 10DG Colonne de dessalage Colonne préemballée</td><td>Biorad</td><td>7322010</td><td></td></tr><tr><td>appareil de dialyse : Cassettes de dialyse Slide-A-Lyzer, 3,5K MWCO, 0,1 - 0,5 mL ou 0,5-3 mL</td><td>Termo Fisher Scientific</td><td>66333 ou 66330</td><td></td></tr><tr><td>lame</td><td></td><td></td><td></td> de rasoir</tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>eau ultrapure : Milli-Q Type 1 Systèmes d’eau ultrapure</td><td></td> Système automatisé de purification des protéines Merck <td></td><td></td></tr><tr><td>: &Auml ; kta Pure</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>sonicateur</td><td>de bain Branson</td><td></td><td>, par exemple modèle 1510</td></tr><tr><td>ARE-250 mélangeur</td><td>Thinky Corporation</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nettoyeur de plasma Zepto</td><td>Diener électronique</td><td>utilisation de</td><td></td> l’oxygène comme gaz de processus</tr><tr><td>pipettes à déplacement positif</td><td>Marque</td><td></td><td>Transferpettor modèles avec embouts</td></tr> <tr><td>en verreMicroscope confocal à balayage laser LSM780</td><td>Zeiss Équipé d’un</td><td></td><td>objectif à immersion dans l’eau Zeiss C-Apochromat 40X/1.20</td></tr><tr><td>Plasmides</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>pET28a-His-MinD_MinE</td><td>Département de biophysique cellulaire et moléculaire, MPI de biochimie, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmide codant His-MinD et MinE non marqué pour améliorer le rendement</td></tr><tr><td>pET28a-His-MinE</td><td>Département de Biophysique Cellulaire et Moléculaire, MPI de Biochimie, Prof. Schwille</td> codant pour le <td></td><td>plasmide His-MinE</td></tr><tr><td>pET28a-His-EGFP-MinD</td><td>Département de Biophysique Cellulaire et Moléculaire, MPI de Biochimie, Prof. Schwille</td> codant pour le <td></td><td>plasmide His-EGFP-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His-mRuby3-MinD</td><td>Département de Biophysique Cellulaire et Moléculaire, MPI de Biochimie, Prof. Schwille</td><td></td><td>Encodage pour Plasmide His-mRuby3-MinD</td></tr><tr><td>pET28a-His- MinC</td><td>Département de Biophysique Cellulaire et Moléculaire, MPI de Biochimie, Prof. Schwille</td><td></td><td>plasmide codant His-MinC</td></tr></tbody></table>

in vitro reconstitution d’auto-organisationnelle profils protéiques sur bicouches lipidiques pris en charge

In Vitro Reconstitution of Self-Organizing Protein Patterns on Supported Lipid Bilayers

Beaucoup d’aspects de l’organisation spatio-temporelle fondamentale des cellules est régies par des systèmes de réaction-diffusion. In vitro la reconstitution de ces systèmes permet pour des études détaillées de leurs mécanismes sous-jacents qui ne serait pas réalisables in vivo. Ici, nous fournissons un protocole pour la reconstitution in vitro du système MinCDE d' Escherichia coli, qui positionne le septum de la division cellulaire dans le milieu cellulaire. Le dosage est conçu pour fournir uniquement les composants nécessaires à l’auto-organisation, à savoir une membrane, l’esprit de deux protéines et MinE et de l’énergie sous forme d’ATP. Nous fabriquons donc une chambre de réaction ouverte sur une lamelle couvre-objet, sur lequel se forme une bicouche lipidique pris en charge. La conception ouverte de la chambre permet une préparation optimale de la bicouche lipidique et contrôlée manipulation de la teneur en vrac. Les deux protéines, esprit et MinE, ainsi que ATP, est ensuite ajouté dans le volume en vrac au-dessus de la membrane. L’imagerie est possible par microscopies optiques beaucoup, comme supports de conception confocale, grand champ et microscope TIRF tant. Dans une variante du protocole, la double couche lipidique est formée sur un support à motifs, sur les microstructures PDMS en forme de cellule, au lieu de verre. Abaissement de la solution en vrac sur le bord de ces compartiments enferme la réaction dans un compartiment plus petit et prévoit des limites qui permettent imitant de in vivo le comportement oscillatoire. Pris ensemble, les auteurs décrivent des protocoles afin de reconstituer le système MinCDE avec et sans confinement spatial, permettant aux chercheurs de contrôler avec précision tous les aspects qui influencent la formation de modèles, tels que les plages de concentration et l’ajout d’autres facteurs ou de protéines et à augmenter systématiquement la complexité du système dans une configuration expérimentale relativement simple.

Purification des protéines selon notre protocole devrait produire une Min protéines de pureté adéquate. Comme référence, Figure 1 offre une image de SDS-PAGE d’esprit, fluorescent étiquetés esprit MinE et MinC. Les différentes étapes de la procédure pour effectuer un test d’auto-organisation MinDE sur bicouches lipidiques supportés non texturés sont décrits à la Figure 2. Utilisant ce protocole, MinDE régulier voyageant à ondes de surface peut être observé tout au long de la chambre (Figure 3). La longueur d’onde peut varier légèrement dans la chambre, mais en général les modèles ressemblent. Les bords de la chambre ne devraient pas servir à des comparaisons quantitatives, comme membranes que forme sur la colle UV semble avoir des propriétés différentes sur le verre de surface (voir Figure 3). Les ondes de surface de voyages peuvent être analysés en traçant l’intensité le long de la direction de propagation (Figure 3 b). Alors que l’esprit de fluorescence des plateaux assez rapide de la fine pointe de la vague et donc fortement diminue sur le bord de fuite, fluorescence MinE augmente presque linéairement depuis le début de la vague d’esprit et atteint son maximum au bout d’esprit sur le bord de fuite, où il se détache nettement6.
En regard de la qualité des protéines, la qualité de la prise en charge des bilayers de lipide est plus critique pour une auto-organisation régulière de MinCDE. D’une part si la membrane est lavée trop excessifs ou la surface sous-jacente a été nettoyée et donc facturée trop fortement, trous peuvent se former dans la membrane (Figure 6 a, top). En revanche si la membrane n’est pas lavée correctement ou la surface sous-jacente n’est pas nettoyé/hydrophilisée, vésicules seront en tiendra à la membrane ou la fluidité de la membrane sera compromise (Figure 6 a, en bas). Bien que pas aussi apparent que lors de l’observation de la membrane directement par l’intermédiaire de lipides marqués, ces problèmes peuvent également être détectés depuis le signal de fluorescence d’esprit, car les patrons ne sont pas réguliers et la fluorescence dans les maxima n’est pas homogène, mais contient des « trous » ou points lumineux comme indiqué dans le panneau central de la Figure 6 a.
Pour l’auto-organisation MinDE en bâtonnet des microstructures PDMS, la procédure est résumée dans la Figure 4. Plusieurs étapes de protocole n’avez pas besoin d’être répété, comme les protéines et les lipides peuvent être réutilisés. Comme si sur des substrats non texturés, le substrat est nettoyé et HYDROPHILISÉ (par plasma-nettoyage), une prise en charge double couche lipidique est formé sur le PDMS et le dosage de l’auto-organisation est mis en place dans un volume de 200 µL. Pour vérifier qu’une membrane appropriée a formé et MinDE s’organise sur la membrane, les chambres sont imagés. Lorsqu’une membrane appropriée a été formée, MinDE formes régulières voyageant ondes de surface sur la surface des PDMS entre les microstructures individuelles et aussi s’organise au fond des microstructures comme les vagues peuvent librement se déplacer sur toute la surface de membrane recouverte (Figure 5 a). Après le retrait du tampon, la surface entre les compartiments ne doit pas afficher n’importe quel modèle de MinDE multiplication (Figure 5 b), comme cela doit être entièrement sec. Si MinDE modèles circulent encore, plus de mémoire tampon doit être retiré. Les protéines sont maintenant confinés dans le microcompartments en forme de tige par le PDMS revêtu de membrane et par voie aérienne sur l’interface supérieure (Figure 5), dans laquelle ils vont s’auto-organiser. Dans ces conditions les deux protéines peuvent effectuer des oscillations de pôle à pôle comme illustré à la Figure 5. Comme une fraction de l’esprit et le mien est toujours liée à la membrane, également au moment du retrait du tampon, les concentrations après le retrait du tampon ne sont pas comparables à des concentrations d’entrée. En raison de cet effet les concentrations varient également entre les microstructures individuelles sur la lamelle couvre-objet même car elles dépendent de la position des modèles avant l’enlèvement de la mémoire tampon. Production de wafer de silicium ou une moulure de PDMS de la plaquette de silicium peut entraîner des microstructures incomplètes qui ne peut pas être utilisés pour l’analyse (Figure 6 b). En outre, en raison de la mémoire tampon microstructures d’enlèvement peuvent dessécher pendant le processus et devraient donc être exclus de l’analyse (Figure 6 b). Ainsi qu’une fraction des microstructures dans une chambre montre les oscillations de pôle à pôle désirées. Pour analyser la dynamique des protéines dans les microstructures, un kymographes peut être obtenue en traçant une sélection sur l’ensemble de la structure (Figure 5E). Lorsque MinCDE oscillent de pôle à pôle, MinC et esprit montrera un gradient de concentration moyenne temporelle avec une concentration maximale au niveau des pôles de compartiment et la concentration minimale au milieu du compartiment (Figure 5F).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig1.jpg"> Figure 1 : SDS-PAGE, montrant les produits finaux de purification de protéine. Son esprit (33,3 kDa), His-eGFP-MinD (60.1 kDa), His-mRuby3-esprit (59,9 kDa), His-MinE (13,9 kDa) et His-MinC (28,3 kDa) sont affichés dans l’ordre. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig1large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig2.jpg"> Figure 2 : diagramme de flux de processus montrant les différentes étapes et le calendrier du protocole d’une auto-organisation sur bicouches aux motifs non pris en charge lipidique (étapes 1 à 6). Boîtes en pointillés indiquent qu’un de ces deux options peut être utilisé pour le nettoyage. Les flèches marquées par des cercles indiquent où le protocole peut être suspendu et repris plus tard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig2large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig3.jpg"> Figure 3 : imagerie du MinDE dosage par microscopie confocale. A) spirale régulière Min, partir quel vitesse de propagation des ondes, la parcelle de l’intensité et la vitesse des mesures peuvent être obtenues. Concentrations utilisées : 0,6 µM (30 % eGFP-esprit) de l’esprit, 1,8 µM His-MinE (30 % His-MinE-Alexa647) B) intrigue intensité normalisée exemple pour la région marquée a. C) vue d’ensemble de chambre de dosage complet (Echelle : 1 mm, les mêmes concentrations de protéine que Voir ci-dessus). Spirales ou l’autre sens de rotation ainsi que les évolutions de la cible peuvent être observées. La région agrandie montre comment les modèles de vagues diffèrent sur la colle UV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig3large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig4.jpg"> Figure 4 : diagramme de flux de processus montrant les différentes étapes et le calendrier du protocole d’auto-organisation en bâtonnet microstructures (étapes 1 à 5, 7, 8). Cases grises indiquent pas où les produits peuvent être réutilisés de protocole sur des bicouches lipidiques supportés non texturés. Les flèches marquées par des cercles indiquent où le protocole peut être suspendu et repris plus tard. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig4large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig5.jpg"> Figure 5 : résultats représentatifs pour MinDE modèle formation en bâtonnet PDMS microcompartments. A) MinDE s’organiser sur la surface de la PDMS faisant voyager des ondes de surface (l’esprit de 1 µM (30 % EGFP-esprit), 2 µM MinE et ATP 2,5 mM). B) après que la mémoire tampon est abaissé à la hauteur des microstructures, l’auto-organisation de la protéine s’arrête sur la surface plane entre les microcompartments. C) schématique d’un microcompartiment en forme de bâtonnet. D) des images représentatives des oscillations de pôle-à-l’autre MinDE après le retrait de la mémoire tampon. E) kymographes des oscillations le long de la ligne en surbrillance montré D). F) Image et profil de l’intensité de fluorescence moyenne de la série chronologique montrée D) montrant clairement le gradient de protéine qui est maximale aux pôles de microcompartiment et un minimum au milieu du compartiment. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig5large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/58139/58139fig6.jpg"> Figure 6 : exemples de résultats expérimentaux négatifs. A) membranes trop lavés accumulent des trous, alors que préparations de vésicule sous-optimal et compositions lipidiques conduisent à coller des vésicules. Les panneaux de deux Centre montrent une combinaison de problèmes et comment ils deviennent visibles lors de l’observation des oscillations de Min. Les membranes ont été marquées avec 0.05 % Atto655-DOPE. (barreaux de l’échelle : 50 µm) B) panneau supérieur : dessèchement microcompartments peut être causée par trop d’enlèvement de tampon ou lorsque la mémoire tampon s’évapore au fil du temps. Panneau inférieur : compartiments incomplètes peuvent être formés au cours de la production de wafer ou le moulage de PDMS. (échelle bars : 30 µm) <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/58139fig6large.jpg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour visionner une version agrandie de cette figure.</a>
Fichier supplémentaire 1 : Carte plasmidique pour son esprit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/01_pET28a-MinD-MinE.gb%20" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 2 : Carte plasmidique pour son EGFP-esprit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/02_pET28a-EGFP-MinD.gb" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 3 : Carte plasmidique pour son mRuby3-esprit. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/03_pET28a-mRuby3-MinD.gb" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 4 : Carte plasmidique pour sa MinE. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/04_pET28a-MinE.gb" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Fichier supplémentaire 5 : Carte plasmidique pour His-MinC. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/05_pET28a-MinC.gb" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>
Complémentaire fichier 6 : Fichier de CAO pour la plaquette de silicium de microcompartments en forme de bâtonnet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/58139/JoVe_wafer_rod-like-structures_3x3.dwg" target="_blank">S’il vous plaît cliquez ici pour télécharger ce fichier.</a>

Nous fournissons un protocole pour in vitro tests d’auto-organisation de l’esprit et le mien sur une double couche lipidique pris en charge dans une chambre ouverte. En outre, nous décrivons comment placer le dosage microcompartments PDMS revêtu de lipides à reproduire in vivo des conditions de confinement de la réaction.

In Vitro Reconstitution d’auto-organisationnelle profils protéiques sur bicouches lipidiques pris en charge

Many aspects of the fundamental spatiotemporal organization of cells are governed by reaction-diffusion type systems. In vitro reconstitution of such ...

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur l’organisation des cellules et les membranes, par exemple, le rôle que jouent les indices géométriques dans le processus. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet un contrôle précis de tous les aspects influençant la formation des motifs, tels que les concentrations de protéines. Pour commencer, générez des vésicules multilamellaires comme décrit dans le protocole texte.Maintenant, gelez-décongelez les lipides pendant sept à 10 cycles, en préparant d’abord un bécher avec de l’eau à 70 à 99 degrés Celsius sur une plaque chauffante, ainsi qu’un récipient contenant de l’azote liquide. Maintenez le flacon dans de l’azote liquide à l’aide d’une grande pince à épiler jusqu’à ce que l’azote cesse de bouillir. Transférez ensuite le flacon dans de l’eau chaude jusqu’à ce que la solution soit complètement décongelée.Répétez ces étapes jusqu’à ce que le mélange de lipides apparaisse clair à l’œil nu, selon le mélange. Ensuite, assemblez un extrudeur de lipides et pré-rincez le système avec le tampon Min. Extrudez le mélange lipidique entre 35 et 41 fois à travers une membrane de pores de 50 nanomètres.Assurez-vous de terminer sur un nombre impair de passes pour éviter les agrégats qui n’ont jamais traversé la membrane. Répartissez les lamelles en verre sur une boîte de Pétri en verre inversé ou une autre surface inerte. À l’aide d’une pipette en verre, ajoutez sept gouttes d’acide sulfurique concentré au centre de chaque lamelle.Ajoutez ensuite deux gouttes de peroxyde d’hydrogène à 50 % au milieu des gouttes d’acide. Couvrez la réaction et incubez pendant au moins 45 minutes. Maintenant, ramassez les lamelles individuellement à l’aide d’une pince à épiler et rincez l’acide avec de l’eau ultra-pure.Placez les lamelles lavées dans des supports antiadhésifs ou un appareil de transport similaire. Rincez abondamment chaque lamelle avec de l’eau ultrapure et séchez la surface avec du gaz sous pression. Marquez le côté propre de la lamelle avec un marqueur permanent.Pour assembler la chambre, coupez et jetez d’abord le couvercle et la partie conique d’un tube de réaction de 0,5 millilitre avec des ciseaux tranchants. Appliquez ensuite de la colle UV sur le bord supérieur du tube et répartissez la colle uniformément à l’aide d’une pointe de pipette. Collez le tube à l’envers sur le côté propre de la lamelle.Enfin, durcissez la colle UV en plaçant plusieurs chambres sous une lampe de 360 nanomètres ou une LED pendant cinq à 15 minutes. Pour la formation de bicouches lipidiques soutenues, préchauffez un bloc de chaleur à 37 degrés Celsius et incubez deux tubes de réaction d’un millilitre avec un tampon Min ou SLB à raison d’un tube par chambre. Soufflez de l’azote dans les chambres assemblées et durcies pour éliminer toute poussière ou autre particule qui aurait pu se déposer pendant le durcissement et l’assemblage UV.Ensuite, placez les chambres sur le bloc de chaleur. Diluez une aliquote de 20 microlitres de lipides clairs avec 130 microlitres de tampon Min, en créant une concentration de travail de 0,53 milligramme par millilitre. Ajoutez 75 microlitres du mélange lipidique dans chaque chambre.Maintenant, réglez une minuterie sur trois minutes. Pendant le temps d’incubation, les vésicules éclatent sur la surface du verre hydrophile et fusionnent pour former une SLB cohérente. Une fois que 60 secondes se sont écoulées, ajoutez 150 microlitres de tampon Min dans chaque chambre.Après les 120 secondes restantes, lavez chaque chambre en ajoutant 200 microlitres de tampon Min ou SLB, en pipetant soigneusement de haut en bas plusieurs fois, en retirant et en ajoutant 200 microlitres supplémentaires. Une fois que chaque chambre a été lavée une fois, procédez au lavage complet de la première chambre jusqu’à ce que les deux millilitres de tampon soient épuisés. Le lavage des bicouches lipidiques supportées nécessite une certaine expérience pour perfectionner l’étendue des mouvements dans la chambre et trouver l’intensité de lavage correcte.Pour produire des microstructures PDMS à partir de plaquettes de silicium à motifs, utilisez d’abord un gobelet en plastique pour peser 10 grammes de base PDMS et un gramme de réticulant PDMS. Utilisez un appareil de mélange pour mélanger et dégazer le mélange PDMS. Maintenant, utilisez une pointe de pipette pour déposer une petite quantité de PDMS directement sur la structure de la plaquette de silicium.Placez immédiatement une lamelle 1 sur la goutte PDMS et prenez l’extrémité supérieure d’une pointe de pipette propre pour appuyer doucement la lamelle sur la plaquette de silicium. Le PDMS doit s’étaler finement entre la lamelle de recouvrement et la plaquette de silicium. Placez la plaquette avec les lamelles dans un four et faites durcir le PDMS pendant trois à quatre heures, ou toute la nuit, à 75 degrés Celsius.Ensuite, sortez la gaufrette du four et laissez-la refroidir à température ambiante. À l’aide d’une lame de rasoir, retirez avec précaution la lamelle avec le PDMS attaché de la plaquette de silicium. Maintenant, fixez une chambre en plastique au PDMS comme décrit précédemment pour le verre.Prenez les lamelles avec la chambre attachée et placez-les dans un nettoyeur plasma avec de l’oxygène comme gaz de processus. Nettoyez les lamelles avec du plasma. Dans ce travail, une puissance de 30 % et une pression d’oxygène de 0,3 millibar pendant une minute ont été utilisées.Maintenant, préparez un SLB dans la chambre comme décrit précédemment sur du verre. Pour effectuer le test d’auto-organisation, ajustez le volume du tampon dans la chambre à 200 microlitres de tampon Min, moins la quantité de protéine et de solution d’ATP. Ajoutez ensuite MinD, étiqueté MinD, MinE et, si vous le souhaitez, MinC, et mélangez doucement les composants par pipetage.Maintenant, ajoutez 2,5 millimolaires ATP pour commencer l’auto-organisation de MinDE. Au cours des 10 à 30 prochaines minutes, vérifiez la formation régulière de motifs MinDE et les microstructures correctement formées sur un microscope à fluorescence. Lorsque des motifs MinDE réguliers se sont formés, pipetez doucement de haut en bas deux fois pour mélanger les composants.Retirez la grande partie du tampon à l’aide d’une pipette de 100 microlitres, puis retirez soigneusement le reste à l’aide d’une pipette de 10 microlitres. Pour permettre des temps d’imagerie plus longs, insérez un morceau d’éponge humidifié à l’intérieur de la chambre. Assurez-vous que l’éponge n’entre pas en contact avec la surface de la lamelle.Fermez immédiatement la chambre avec un couvercle pour éviter le dessèchement du tampon résiduel dans les microstructures. Avant l’imagerie des microstructures, confirmez que l’auto-organisation de MinDE est stoppée au-dessus de la microstructure PDMS pendant que les protéines dans les microcavités oscillent. Dans cette vidéo représentative, l’imagerie bicolore montre comment MinD et MinE s’auto-organisent en ondes de surface qui se déplacent et forment des motifs en spirale sur des bicouches lipidiques soutenues.Ici, l’imagerie monochrome montre MinD et MinE effectuant des oscillations d’un pôle à l’autre dans des microstructures PDMS. Les oscillations établissent un gradient de concentration en MinD moyenné dans le temps avec une concentration maximale aux pôles du compartiment et une concentration minimale au milieu du compartiment. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme le suivi de particules uniques, peuvent être effectuées afin de déterminer la cinétique de liaison de la membrane et les temps de séjour.N’oubliez pas que travailler avec une solution de piranha peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que des équipements de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.

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Sans tensioactifs ultrarapide Reconstitution des protéines membranaires dans les bicouches lipidiques à l’aide de fusogène complémentaire chargée protéoliposomes.

Solide-soutenus, sans protéines, double membranes bicouches phospholipidiques (DALG) peuvent être transformés en réseaux de nanotube de lipides complexes et dynamiques et peuvent servir de modèles 2D de bas en haut du réticulum endoplasmique.

Formation spontanée et le réarrangement des réseaux de Nanotube lipidique artificielle comme un modèle de bas en haut pour le réticulum endoplasmique

La fusion mitochondriale est une réaction homéostatique importante sous-jacente à la dynamique mitochondriale. Décrit ici est un système de reconstitution in vitro pour étudier la fusion mitochondriale de membrane interne qui peut résoudre l’attachement de membrane, l’amarrage, l’hémifusion, et l’ouverture de pore. La polyvalence de cette approche dans l’exploration des systèmes de membrane cellulaire est discutée.

Une plate-forme membranaire modèle pour reconstituer la dynamique memitochondriale de membrane

Ce protocole décrit la formation de cellules imitant les vésicules unilipidiques et multilipidiques, les bicouches lipidiques soutenues et les bicouches lipidiques en suspension. Ces modèles in vitro peuvent être adaptés pour incorporer une variété de types de lipides et peuvent être utilisés pour étudier diverses interactions entre molécules et macromolécules.

Assemblage de modèles de bicouches lipidiques supportées et suspendues imitant des cellules pour l’étude des interactions moléculaires

Ce protocole décrit la formation de bicouches lipidiques soutenues et l’ajout de filaments cytosquelettiques et de protéines motrices pour étudier la dynamique de réseaux cytosquelettiques reconstitués et attachés à la membrane à l’aide de la microscopie à fluorescence.

Reconstitution de cortex minimembranaires d’actine sur des bicouches lipidiques soutenues

Dans ce manuscrit, nous démontrons les techniques expérimentales pour encapsuler le cytosquelette F-actine dans des vésicules lipidiques unilamellaires géantes (également appelées liposomes), et la méthode pour former une couche de F-actine biomitant le cortex au niveau du feuillet interne de la membrane liposomique.

In vitro Reconstitution du cytosquelette d’actine à l’intérieur de vésicules unilamellaires géantes

La reconstitution sans cellules a été un outil clé pour comprendre l’assemblage du cytosquelette, et les travaux de la dernière décennie ont établi des approches pour étudier la dynamique des septines dans des systèmes minimaux. Voici trois méthodes complémentaires pour observer l’assemblage de septines dans différents contextes membranaires : les bicouches planes, les supports sphériques et les supports de tiges.

Reconstitution de l’assemblage de septines au niveau des membranes pour étudier les propriétés et les fonctions biophysiques

Ici, un protocole est décrit pour générer des motifs protéiques régulés par la lumière et réversibles avec une grande précision spatio-temporelle au niveau de membranes lipidiques artificielles. La méthode consiste en la photoactivation localisée de la protéine iLID (dimère inductible par la lumière améliorée) immobilisée sur des membranes modèles qui, sous la lumière bleue, se lie à sa protéine partenaire Nano (SspB de type sauvage).

Motifs protéiques dynamiques induits par la lumière au niveau de membranes modèles

Découvrez l'auto-organisation des protéines MinD et MinE sur des bicouches lipidiques dans des microcompartiments PDMS. Cette méthode permet de contrôler précisément la formation de motifs protéiques et d'étudier la dynamique membranaire.

In Vitro Reconstitution d’auto-organisationnelle profils protéiques sur bicouches lipidiques pris en charge

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