In Vitro Reconstitution d’auto-organisationnelle profils protéiques sur bicouches lipidiques pris en charge

Cette méthode peut aider à répondre à des questions clés sur l’organisation des cellules et les membranes, par exemple, le rôle que jouent les indices géométriques dans le processus. Le principal avantage de cette technique est qu’elle permet un contrôle précis de tous les aspects influençant la formation des motifs, tels que les concentrations de protéines. Pour commencer, générez des vésicules multilamellaires comme décrit dans le protocole texte.

Maintenant, gelez-décongelez les lipides pendant sept à 10 cycles, en préparant d’abord un bécher avec de l’eau à 70 à 99 degrés Celsius sur une plaque chauffante, ainsi qu’un récipient contenant de l’azote liquide. Maintenez le flacon dans de l’azote liquide à l’aide d’une grande pince à épiler jusqu’à ce que l’azote cesse de bouillir. Transférez ensuite le flacon dans de l’eau chaude jusqu’à ce que la solution soit complètement décongelée.

Répétez ces étapes jusqu’à ce que le mélange de lipides apparaisse clair à l’œil nu, selon le mélange. Ensuite, assemblez un extrudeur de lipides et pré-rincez le système avec le tampon Min. Extrudez le mélange lipidique entre 35 et 41 fois à travers une membrane de pores de 50 nanomètres.

Assurez-vous de terminer sur un nombre impair de passes pour éviter les agrégats qui n’ont jamais traversé la membrane. Répartissez les lamelles en verre sur une boîte de Pétri en verre inversé ou une autre surface inerte. À l’aide d’une pipette en verre, ajoutez sept gouttes d’acide sulfurique concentré au centre de chaque lamelle.

Ajoutez ensuite deux gouttes de peroxyde d’hydrogène à 50 % au milieu des gouttes d’acide. Couvrez la réaction et incubez pendant au moins 45 minutes. Maintenant, ramassez les lamelles individuellement à l’aide d’une pince à épiler et rincez l’acide avec de l’eau ultra-pure.

Placez les lamelles lavées dans des supports antiadhésifs ou un appareil de transport similaire. Rincez abondamment chaque lamelle avec de l’eau ultrapure et séchez la surface avec du gaz sous pression. Marquez le côté propre de la lamelle avec un marqueur permanent.

Pour assembler la chambre, coupez et jetez d’abord le couvercle et la partie conique d’un tube de réaction de 0,5 millilitre avec des ciseaux tranchants. Appliquez ensuite de la colle UV sur le bord supérieur du tube et répartissez la colle uniformément à l’aide d’une pointe de pipette. Collez le tube à l’envers sur le côté propre de la lamelle.

Enfin, durcissez la colle UV en plaçant plusieurs chambres sous une lampe de 360 nanomètres ou une LED pendant cinq à 15 minutes. Pour la formation de bicouches lipidiques soutenues, préchauffez un bloc de chaleur à 37 degrés Celsius et incubez deux tubes de réaction d’un millilitre avec un tampon Min ou SLB à raison d’un tube par chambre. Soufflez de l’azote dans les chambres assemblées et durcies pour éliminer toute poussière ou autre particule qui aurait pu se déposer pendant le durcissement et l’assemblage UV.

Ensuite, placez les chambres sur le bloc de chaleur. Diluez une aliquote de 20 microlitres de lipides clairs avec 130 microlitres de tampon Min, en créant une concentration de travail de 0,53 milligramme par millilitre. Ajoutez 75 microlitres du mélange lipidique dans chaque chambre.

Maintenant, réglez une minuterie sur trois minutes. Pendant le temps d’incubation, les vésicules éclatent sur la surface du verre hydrophile et fusionnent pour former une SLB cohérente. Une fois que 60 secondes se sont écoulées, ajoutez 150 microlitres de tampon Min dans chaque chambre.

Après les 120 secondes restantes, lavez chaque chambre en ajoutant 200 microlitres de tampon Min ou SLB, en pipetant soigneusement de haut en bas plusieurs fois, en retirant et en ajoutant 200 microlitres supplémentaires. Une fois que chaque chambre a été lavée une fois, procédez au lavage complet de la première chambre jusqu’à ce que les deux millilitres de tampon soient épuisés. Le lavage des bicouches lipidiques supportées nécessite une certaine expérience pour perfectionner l’étendue des mouvements dans la chambre et trouver l’intensité de lavage correcte.

Pour produire des microstructures PDMS à partir de plaquettes de silicium à motifs, utilisez d’abord un gobelet en plastique pour peser 10 grammes de base PDMS et un gramme de réticulant PDMS. Utilisez un appareil de mélange pour mélanger et dégazer le mélange PDMS. Maintenant, utilisez une pointe de pipette pour déposer une petite quantité de PDMS directement sur la structure de la plaquette de silicium.

Placez immédiatement une lamelle 1 sur la goutte PDMS et prenez l’extrémité supérieure d’une pointe de pipette propre pour appuyer doucement la lamelle sur la plaquette de silicium. Le PDMS doit s’étaler finement entre la lamelle de recouvrement et la plaquette de silicium. Placez la plaquette avec les lamelles dans un four et faites durcir le PDMS pendant trois à quatre heures, ou toute la nuit, à 75 degrés Celsius.

Ensuite, sortez la gaufrette du four et laissez-la refroidir à température ambiante. À l’aide d’une lame de rasoir, retirez avec précaution la lamelle avec le PDMS attaché de la plaquette de silicium. Maintenant, fixez une chambre en plastique au PDMS comme décrit précédemment pour le verre.

Prenez les lamelles avec la chambre attachée et placez-les dans un nettoyeur plasma avec de l’oxygène comme gaz de processus. Nettoyez les lamelles avec du plasma. Dans ce travail, une puissance de 30 % et une pression d’oxygène de 0,3 millibar pendant une minute ont été utilisées.

Maintenant, préparez un SLB dans la chambre comme décrit précédemment sur du verre. Pour effectuer le test d’auto-organisation, ajustez le volume du tampon dans la chambre à 200 microlitres de tampon Min, moins la quantité de protéine et de solution d’ATP. Ajoutez ensuite MinD, étiqueté MinD, MinE et, si vous le souhaitez, MinC, et mélangez doucement les composants par pipetage.

Maintenant, ajoutez 2,5 millimolaires ATP pour commencer l’auto-organisation de MinDE. Au cours des 10 à 30 prochaines minutes, vérifiez la formation régulière de motifs MinDE et les microstructures correctement formées sur un microscope à fluorescence. Lorsque des motifs MinDE réguliers se sont formés, pipetez doucement de haut en bas deux fois pour mélanger les composants.

Retirez la grande partie du tampon à l’aide d’une pipette de 100 microlitres, puis retirez soigneusement le reste à l’aide d’une pipette de 10 microlitres. Pour permettre des temps d’imagerie plus longs, insérez un morceau d’éponge humidifié à l’intérieur de la chambre. Assurez-vous que l’éponge n’entre pas en contact avec la surface de la lamelle.

Fermez immédiatement la chambre avec un couvercle pour éviter le dessèchement du tampon résiduel dans les microstructures. Avant l’imagerie des microstructures, confirmez que l’auto-organisation de MinDE est stoppée au-dessus de la microstructure PDMS pendant que les protéines dans les microcavités oscillent. Dans cette vidéo représentative, l’imagerie bicolore montre comment MinD et MinE s’auto-organisent en ondes de surface qui se déplacent et forment des motifs en spirale sur des bicouches lipidiques soutenues.

Ici, l’imagerie monochrome montre MinD et MinE effectuant des oscillations d’un pôle à l’autre dans des microstructures PDMS. Les oscillations établissent un gradient de concentration en MinD moyenné dans le temps avec une concentration maximale aux pôles du compartiment et une concentration minimale au milieu du compartiment. À la suite de cette procédure, d’autres méthodes, comme le suivi de particules uniques, peuvent être effectuées afin de déterminer la cinétique de liaison de la membrane et les temps de séjour.

N’oubliez pas que travailler avec une solution de piranha peut être extrêmement dangereux et que des précautions telles que des équipements de protection individuelle doivent toujours être prises lors de l’exécution de cette procédure.